Изучение морфоструктурных повреждений бактериальных клеток под воздействием хлорсодержащих производных 5-,6-,7-аминоиндолов с помощью сканирующего электронного микроскопа

Полный текст

Введение

Разработка новых противомикробных соединений или других альтернативных средств для борьбы с возбудителями инфекционных заболеваний является важной задачей здравоохранения [1].

Антимикробная активность большинства классов противомикробных соединений направлена на какую-то уникальную особенность строения бактерий или их метаболических процессов. Среди механизмов действия можно выделить: ингибирование синтеза клеточной стенки, нарушение структуры или функции клеточной мембраны, ингибирование структуры и функции нуклеиновых кислот, ингибирование синтеза белка и остановка основных метаболических путей [30].

Целостность клеточной структуры очень важна для жизнедеятельности бактерий [36]. Клеточная стенка и мембраны грамположительных и грамотрицательных бактерий обеспечивают физический, осмотический и метаболический барьер между внутренним содержимым бактериальной клетки и внешней средой. Несомненно, что для всех этих функций необходима целостность мембраны, и ее нарушение может прямо или косвенно вызвать метаболическую дисфункцию и гибель клеток, помимо собственно образования пор. Наблюдение за изменением целостности бактериальной структуры с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) может помочь прояснить детальные механизмы гибели клеток [21, 22].

В настоящем исследовании мы использовали изоляты S. aureus, P. aeruginosa, Е. соli, так как эти патогены наиболее часто представляют собой терапевтическую проблему из-за формирующейся устойчивости к противомикробным препаратам [8, 9, 15, 18].

P. aeruginosa один из наиболее важных клинических оппортунистических патогенов [16, 17, 18, 39]. Он является возбудителем внутрибольничных, раневых инфекций, инфекций мочевыводящих путей и ЛОР-органов, острых и хронических инфекций легких у пациентов с кистозным фиброзом и т. д. [4, 20, 24, 29, 31].

Инфекции, вызванные P. aeruginosa, продолжают представлять терапевтическую проблему из-за лекарственной устойчивости, развивающейся во время терапии, и обусловленной низкой проницаемостью его наружной мембраны. Также наличие у P. aeruginosa клеточного (эффлюксного) насоса для оттока лекарств и β-лактамаз типа AmpC приводит к высоким показателям заболеваемости и смертности [13, 19, 32].

S. aureus является клиническим патогеном, вызывающим инфекции как у людей, так и у животных, начиная от поверхностных инфекций и заканчивая жизнеугрожающими инвазивными инфекциями [14, 25, 33].

S. aureus признан главным возбудителем внутрибольничных инфекций, приводящих к заболеваемости и смертности среди госпитализированных пациентов. Отчасти это связано с его способностью прилипать к поверхности медицинского оборудования и образовывать биопленку, представляющую собой многослойную структуру, состоящую из бактериальных сообществ, внедренных во внеклеточный матрикс [38].

E. coli является основной причиной энтерита, инфекций мочевыводящих путей, септицемии и других клинических инфекций, в том числе неонатального менингита. E. coli также часто вызывает диарею у домашних и сельскохозяйственных животных. Лечение инфекций, вызванных кишечной палочкой, находится под угрозой из-за появления устойчивости к противомикробным препаратам [26, 27, 35].

Описанные выше бактерии относятся к «ESKAPE»-патогенам, которые способны формировать изоляты с множественной лекарственной устойчивостью [9].

Исходя из вышеизложенного, целью нашего исследования был анализ морфологических изменений микробных клеток под воздействием новых соединений с противомикробной активностью — хлорсодержащих производных 5-,6-,7-аминоиндолов — с использованием СЭМ.

Материалы и методы

В качестве тестируемых соединений были использованы хлорзамещенные производные 5-,6-,7-аминоиндолов (табл. 1). Исследуемые соединения разработаны и получены на кафедре химии, технологии и методики обучения ФГБОУ ВО «МГПУ им. М.Е. Евсевьева», г. Саранск. Ранее была доказана противомикробная активность хлорсодержащих соединений индольного ряда [6].

 

Таблица 1. Молекулярные структуры исследуемых производных 5-,6-,7-аминоиндолов

Table 1. Molecular structures of the studied derivatives of 5-, 6-, 7-aminoindoles

Структурная формула Structural formula	Название, лабораторный шифр Name, laboratory code
	2-хлор-N-(2,3-диметил-1H-индол-7-ил)ацетамид (Т-1) 2-chloro-N-(2,3-dimethyl-1H-indol-7-yl)acetamide (T-1)
	2-хлор-N-(5-метокси-2,3-диметил-1H-индол-6-ил)ацетамид (Т-4) 2-chloro-N-(5-methoxy-2,3-dimethyl-1H-indol-6-yl)acetamide (T-4)
	2-хлор-N-(1,2,3-триметил-1H-индол-5-ил)ацетамид (Т-7) 2-chloro-N-(1,2,3-trimethyl-1H-indol-5-yl)acetamide (T-7)
	Монохлорацетат-2,3-диметил-1H-индол-7-аммония (Т-12) Monochloroacetate-2,3-dimethyl-1H-indole-7-ammonium (T-12)

 

Опытные штаммы микроорганизмов с различной чувствительностью к традиционно используемым антимикробным препаратам получены от больных с неспецифическими заболеваниями органов дыхания, мочевыводящих путей, кишечника.

Верификацию опытных штаммов микроорганизмов осуществляли бактериологическими методами по классической методике [3, 5, 7].

Опытные штаммы P. aeruginosa, S. aureus и E. coli выращивали в течение ночи в бульоне LB. Суспензии клеток центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин. Осадок дважды промывали стерильным фосфатным буфером. Приблизительно 2 × 10⁸ микробных клеток каждого опытного штамма переносили в пробирку Эппендорф на 1,5 мл и инкубировали с исследуемыми соединениями заданной концентрации (500 мкг/мл) в течение часа. Концентрацию микробных клеток вычисляли по оптической плотности. После инкубации клетки дважды промывали фосфатным буфером и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин. Затем фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида в течение 15 мин. После фиксации клетки снова отмывали фосфатным буфером и постепенно обезвоживали путем последовательных погружений в растворы этанола возрастающих концентраций (30, 50, 70, 90 и 96%). Каждый этап промывки и обезвоживания длился 10 мин. Затем клетки обезвоживали в чистом ацетоне (99,8%). Образцы бактерий высушивали в критической точке на установке Leica CPD 300, напыляли золотом на Quorum 150 RESplus и исследовали на сканирующем электронном микроскопе Tescan Mira 3. Рабочее расстояние и ускоряющее напряжение регулировались для получения подходящего увеличения. Для каждого препарата наблюдалось около 100 бактериальных клеток [28].

Все данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение в трех повторностях. Статистическая значимость полученных различий считалась достоверной при значении р ≤ 0,05. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel версия 16.0.

Результаты

В контрольных образцах клетки P. aeruginosa длинные и неповрежденные (рис. 1А–В, 4А–В, 7А–В, 10А–В). Клетки S. aureus заключены в межклеточный матрикс синтезированных ими полимеров, есть участки с толстой, плотной и полностью сформировавшейся биопленкой, состоящей из многослойных бактериальных клеток (рис. 2А–В, 5А–В, 8А–В, 11А–В), клетки E. coli представляли собой типичные палочковидные бактерии длиной 1,22–1,88 мкм, шириной 0,37–0,43 мкм (рис. 3А–В, 6А–В, 9А–В, 12А–В).

 

Рисунок 1. Морфоструктурные изменения P. aeruginosa под воздействием 2-хлор-N-(2,3-диметил-1H-индол-7-ил)ацетамида (Т-1)

Примечание. А, Б, В — интактные клетки P. aeruginosa без обработки исследуемым соединением; Г, Д, Е — клетки P. aeruginosa после воздействия исследуемым соединением.

 

Рисунок 2. Морфоструктурные изменения S. aureus под воздействием 2-хлор-N-(2,3-диметил-1H-индол-7-ил)ацетамида (Т-1)

Примечание. А, Б, В — интактные клетки S. aureus без обработки исследуемым соединением; Г, Д, Е — клетки S. aureus после воздействия исследуемым соединением.

 

Рисунок 3. Морфоструктурные изменения E. coli под воздействием 2-хлор-N-(2,3-диметил-1H-индол-7-ил)ацетамида (Т-1)

Примечание. А, Б, В — интактные клетки E. coli без обработки исследуемым соединением; Г, Д, Е — клетки E. coli после воздействия исследуемым соединением.

 

Рисунок 4. Морфоструктурные изменения P. aeruginosa под воздействием 2-хлор-N-(5-метокси-2,3-диметил-1H-индол-6-ил)ацетамида (Т-4)

Примечание. А, Б, В — интактные клетки P. aeruginosa без обработки исследуемым соединением; Г, Д, Е — клетки P. aeruginosa после воздействия исследуемым соединением.

 

Рисунок 5. Морфоструктурные изменения S. aureus под воздействием 2-хлор-N-(5-метокси-2,3-диметил-1H-индол-6-ил)ацетамида (Т-4)

Примечание. А, Б, В — интактные клетки S. aureus без обработки исследуемым соединением; Г, Д, Е — клетки S. aureus после воздействия исследуемым соединением.

 

Рисунок 6. Морфоструктурные изменения E. coli под воздействием 2-хлор-N-(5-метокси-2,3-диметил-1H-индол-6-ил)ацетамида (Т-4)

Примечание. А, Б, В — интактные клетки E. coli без обработки исследуемым соединением; Г, Д, Е — клетки E. coli после воздействия исследуемым соединением.

 

Рисунок 7. Морфоструктурные изменения P. aeruginosa под воздействием 2-хлор-N-(1,2,3-триметил-1H-индол-5-ил)ацетамида (Т-7)

Примечание. А, Б, В — интактные клетки P. aeruginosa без обработки исследуемым соединением; Г, Д, Е — клетки P. aeruginosa после воздействия исследуемым соединением.

 

Рисунок 8. Морфоструктурные изменения S. aureus под воздействием 2-хлор-N-(1,2,3-триметил-1H-индол-5-ил)ацетамида (Т-7)

Примечание. А, Б, В — интактные клетки S. aureus без обработки исследуемым соединением; Г, Д, Е — клетки S. aureus после воздействия исследуемым соединением.

 

Рисунок 9. Морфоструктурные изменения E. coli под воздействием 2-хлор-N-(1,2,3-триметил-1H-индол-5-ил)ацетамида (Т-7)

Примечание. А, Б, В — интактные клетки E. coli без обработки исследуемым соединением; Г, Д, Е — клетки E. coli после воздействия исследуемым соединением.

 

Рисунок 10. Морфоструктурные изменения P. aeruginosa под воздействием монохлорацетат-2,3-диметил-1H-индол-7-аммония (Т-12)

Примечание. А, Б, В — интактные клетки P. aeruginosa без обработки исследуемым соединением; Г, Д, Е — клетки P. aeruginosa после воздействия исследуемым соединением.

 

Рисунок 11. Морфоструктурные изменения S. aureus под воздействием монохлорацетат-2,3-диметил-1H-индол-7-аммония (Т-12)

Примечание. А, Б, В — интактные клетки S. aureus без обработки исследуемым соединением; Г, Д, Е — клетки S. aureus после воздействия исследуемым соединением.

 

Рисунок 12. Морфоструктурные изменения E. coli под воздействием монохлорацетат-2,3-диметил-1H-индол-7-аммония (Т-12)

Примечание. А, Б, В — интактные клетки E. coli без обработки исследуемым соединением; Г, Д, Е — клетки E. coli после воздействия исследуемым соединением.

 

Клетки P. aeruginosa, обработанные 2-хлор-N-(2,3-диметил-1H-индол-7-ил)ацетамидом (Т1), короткие и более компактные. Поверхность обработанных клеток выглядит шероховатой и морщинистой по сравнению с поверхностью необработанных клеток. Наблюдается образование пузырьков и везикул на наружной мембране. Клетки после воздействия Т1 имеют отверстия, вмятины и глубокие кратеры. Форма и размер клеток практически не изменились (рис. 1Г–Е).

В обработанных Т1 клетках S. aureus межклеточный матрикс поврежден или отсутствует, встречаются лопнувшие клетки. Некоторые клетки имеют сформированную перегородку деления. Форма и размер клеток практически не изменились (рис. 2Г–Е).

Клетки E. coli после воздействия исследуемого соединения Т1 имеют отверстия, вмятины и глубокие кратеры. Встречаются полностью лизированные клетки, тургор неразрушенных клеток нарушен. Форма и размер клеток практически не изменились (рис. 3Г–Е).

Статистический анализ морфометрии поверхности клеток в контрольных и опытных образцах не выявил существенных изменений размеров под воздействием Т1 (табл. 2).

 

Таблица 2. Размеры поверхности бактериальных клеток при воздействии соединения с лабораторным шифром Т1 (500 мкг/мл)

Table 2. Surface dimensions of bacterial cells exposed to a compound with laboratory code T1 (500 µg/mL)

Исследуемый микроорганизм Investigated microorganism	Измеряемые параметры Measured parameters
	Длина, мкм Length, µm	Ширина, мкм Width, µm
P. aeruginosa	1,80±0,39	0,66±0,02
P. aeruginosa (control)	2,10±0,44	0,66±0,03
S. aureus	0,69±0,02	0,69±0,02
S. aureus (control)	0,66±0,04	0,66±0,05
E. coli	1,23±0,18	0,41±0,06
E. coli (control)	1,45±0,28	0,40±0,02

 

Поверхность обработанных 2-хлор-N-(5-метокси-2,3-диметил-1H-индол-6-ил)ацетамидом (Т4) клеток P. aeruginosa практически не отличается от поверхности клеток в контроле. Встречаются единичные поры на поверхности клеток, недоразвитые мелкие клетки, обломки оторвавшихся клеток. Форма и размер клеток практически не изменились (рис. 4Г–Е).

В обработанных Т4 клетках S. aureus, помимо гомогенного вещества, в больших количествах содержатся частицы зернистой формы, расположенные вокруг клеток S. aureus. Форма и размер обработанных клеток практически не изменились. Некоторые клетки имеют сформированную перегородку деления (рис. 5Г–Е).

Поверхность клеток Е. coli, обработанных Т4, выглядит шероховатой и морщинистой, содержит вмятины по сравнению с поверхностью необработанных клеток. Отмечается полиморфизм клеток, вокруг клеток визуализируются мелкие гранулярные компоненты (рис. 6Г–Е).

Статистический анализ морфометрии поверхности клеток в контрольных и опытных образцах не выявил существенных изменений размеров под воздействием Т4 (табл. 3).

 

Таблица 3. Размеры поверхности бактериальных клеток при воздействии соединения с лабораторным шифром Т4 (500 мкг/мл)

Table 3. Surface dimensions of bacterial cells exposed to a compound with laboratory code T4 (500 µg/mL)

Исследуемый микроорганизм Investigated microorganism	Измеряемые параметры Measured parameters
	Длина, мкм Length, µm	Ширина, мкм Width, µm
P. aeruginosa	2,45±0,65	0,62±0,03
P. aeruginosa (control)	2,10±0,44	0,66±0,03
S. aureus	0,59±0,10	0,59±0,10
S. aureus (control)	0,66±0,04	0,66±0,05
E. coli	1,31±0,40	0,40±0,06
E. coli (control)	1,45±0,28	0,40±0,02

 

Некоторые клетки P. aeruginosa, обработанные 2-хлор-N-(1,2,3-триметил-1H-индол-5-ил)ацетамидом (Т7), имеют длинную нитевидную форму (рис. 7Г–Д). Клеточная стенка части клеток P. aeruginosa отходит от клеточной мембраны (рис. 7Д–Е). Встречаются лопнувшие клетки, из полости которых происходит отток внутриклеточного материала (рис. 7Д).

В обработанных Т7 клетках S. aureus, помимо гомогенного вещества, содержатся в больших количествах гранулярные соединения. Вокруг клеток S. aureus наблюдается большое количество клеточных обломков, обработанные клетки слипаются (рис. 8Г–Е).

Поверхность клеток Е. coli, обработанная соединением Т7, по сравнению с поверхностью необработанных клеток выглядит шероховатой и морщинистой, содержит вмятины. Наблюдается клеточный полиморфизм, вокруг клеток определяются мелкие гранулярные компоненты. Отмечены потеря тургорного давления и лизис клеток (рис. 9Г–Е).

Статистический анализ морфометрии поверхности клеток в контрольных и опытных образцах не выявил существенных изменений размеров под воздействием Т7 (табл. 4).

 

Таблица 4. Размеры поверхности бактериальных клеток при воздействии соединения с лабораторным шифром Т7 (500 мкг/мл)

Table 4. Surface dimensions of bacterial cells exposed to the compound with laboratory code T7 (500 µg/mL)

Исследуемый микроорганизм Investigated microorganism	Измеряемые параметры Measured parameters
	Длина, мкм Length, µm	Ширина, мкм Width, µm
P. aeruginosa	2,11±0,53	0,64±0,02
P. aeruginosa (control)	2,10±0,44	0,66±0,03
S. aureus	0,56±0,06	0,56±0,06
S. aureus (control)	0,66±0,04	0,66±0,05
E. coli	1,14±0,19	0,41±0,05
E. coli (control)	1,45±0,28	0,40±0,02

 

Некоторые клетки P. aeruginosa, обработанные монохлорацетат-2,3-диметил-1H-индол-7-аммонием (Т12), имеют длинную нитевидную форму и шероховатую поверхность (рис. 10Г–Д). Клеточная стенка части клеток P. aeruginosa отходит от клеточной мембраны (рис. 10Г–Е). Встречаются лопнувшие клетки, из полости которых вытекает внутриклеточное содержимое (рис. 10Д).

Вокруг клеток S. aureus, обработанных Т12, наблюдается большое количество клеточных обломков, встречаются лопнувшие клетки, наблюдается отток внутриклеточного материала из полости клеток (рис. 11Г–Е). Помимо гомогенного вещества рядом с клетками содержатся в больших количествах элементы зернистой формы.

Клетки E. coli после воздействия исследуемого соединения Т12 имеют отверстия, глубокие кратеры, выявляются клеточные обломки, полностью лизированные клетки. Форма и размер клеток практически не изменены (рис. 12Г–Е).

Статистический анализ морфометрии поверхности клеток в контрольных и опытных образцах не выявил существенных изменений размеров под воздействием Т12 (табл. 5).

 

Таблица 5. Размеры поверхности бактериальных клеток при воздействии соединения с лабораторным шифром Т12 (500 мкг/мл)

Table 5. Surface dimensions of bacterial cells exposed to a compound with laboratory code T12 (500 µg/mL)

Исследуемый микроорганизм Investigated microorganism	Измеряемые параметры Measured parameters
	Длина, мкм Length, µm	Ширина, мкм Width, µm
P. aeruginosa	2,01±0,79	0,66±0,04
P. aeruginosa (control)	2,10±0,44	0,66±0,03
S. aureus	0,63±0,07	0,63±0,07
S. aureus (control)	0,66±0,04	0,66±0,05
E. coli	1,39±0,44	0,40±0,01
E. coli (control)	1,45±0,28	0,40±0,02

 

Обсуждение

Индольные алкалоиды служат основой природных и синтетических физиологически активных веществ. Являясь частью живых систем, индол содержится в молекулах биогенного амина серотонина и незаменимой белковой аминокислоты триптофана. Исследуемые хлорсодержащие соединения индольного ряда показали свою биологическую активность, а именно — противомикробную.

Контрольные клетки были морфологически правильными и типичными (рис. 1–12, А–В) [8]. Статистический анализ морфометрии поверхности клеток в контрольных и опытных образцах не выявил существенных изменений размеров под воздействием соединений с лабораторным шифром Т1, Т4, Т7 и Т12. При этом, по сравнению с контрольными необработанными клетками P. aeruginosa, S. aureus и E. coli, обработка хлорзамещенными производными 5-,6-,7-аминоиндолов вызывала явные морфологические изменения, что свидетельствует об ухудшении состояния клеточной стенки.

В колониях P. aeruginosa под воздействием Т7 и Т12 наблюдались филаментные клетки (рис. 7Г, 10Г). Появление длинных нитей может быть связано со стрессом, который испытывает клетка после воздействия исследуемых соединений. Считается, что образование таких филаментов у бактерий в условиях стресса является результатом дефектов клеточного деления, особенно при отделении дочерних клеток [23, 40]. Есть данные, согласно которым при подавлении синтеза ДНК бактерии изменяется ее морфология, она становится длиннее, но деления клетки не происходит [37, 34]. Обработка Т1, Т7 и Т12 приводила к деградации клеточной стенки P. aeruginosa (рис. 1Г–Е, 7Г–Е, 10Г–Е), в то время как обработка Т4 вызывала образование пор на поверхности клетки (рис. 4Е).

В этом исследовании данные, полученные с СЭМ, показали заметные морфологические изменения клеточных стенок S. aureus под действием Т1, Т4, Т7 и Т12, что привело к деформации клеток (рис. 2Г–Е, 5Г–Е, 8Г–Е, 11Г–Е). Эти морфологические изменения могут быть связаны с аберрациями липидного состава мембраны, ее измененной текучестью и/или нарушениями целостности мембраны, что приводит к лизису клеточной стенки и потере внутриклеточного материала [2, 11, 15, 21].

Обработка клеток E. coli Т1, Т4, Т7 и Т12 при концентрации 500 мкг/мл вызывала лизис клеток, хотя нелизированные клетки также были обнаружены (рис. 3Г–Е, 6Г–Е, 9Г–Е, 12Г–Е). Появление клеточных обломков вокруг целых клеток E. coli указывает на повреждение мембраны, которое, вероятно, приводит к изменению осмотического давления (рис. 12Д–Е) [10, 12].

Результаты с использованием СЭМ подтвердили данные об антимикробной активности хлорзамещенных производных 5-,6-,7-аминоиндолов. Действительно, полученные морфологические изменения бактериальной поверхности указывают на мембраноповреждающую активность исследуемых соединений.

Благодарности

Работа была выполнена с использованием оборудования ЦКП «Инструментальные методы в экологии» при ИПЭЭ РАН.

Об авторах

Алена Александровна Масейкина

ФГБОУ ВО Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева

Автор, ответственный за переписку.
Email: minibat@mail.ru

соискатель кафедры иммунологии, микробиологии и вирусологии Медицинского института

Россия, г. Саранск

Ирина Семеновна Степаненко

ФГБОУ ВО Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: minibat@mail.ru

д.м.н., доцент, зав. кафедрой иммунологии, микробиологии и вирусологии с курсом клинической микробиологии

Россия, г. Волгоград

Татьяна Николаевна Платкова

ФГБОУ ВО Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева

Email: minibat@mail.ru

соискатель кафедры иммунологии, микробиологии и вирусологии Медицинского института

Россия, г. Саранск

Анастасия Игоревна Кирютина

ФГБОУ ВО Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева

Email: minibat@mail.ru

соискатель кафедры иммунологии, микробиологии и вирусологии Медицинского институт

Россия, г. Саранск

Влада Сергеевна Малышева

ФГБОУ ВО Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева

Email: minibat@mail.ru

студентка Медицинского института

Россия, г. Саранск

Список литературы

Дополнительные файлы