Modified quantitative approach for assessing peripheral blood TREC and KREC levels in immunodeficient patients

Full Text

Введение

Иммунный статус представляет собой комплексный показатель состояния иммунной системы, это количественная и качественная характеристика состояния функциональной активности органов иммунной системы и некоторых неспецифических механизмов противомикробной защиты.

Иммунодефицитные состояния характеризуются полным или частичным отсутствием T- или B-клеток, а также натуральных киллеров, или ослаблением функций этих клеток [27]. В качестве суррогатных маркеров созревания Т- и В-клеток и функциональной активности соответствующих звеньев иммунной системы может служить содержание в периферической крови, соответственно, Т-рецепторных эксцизионных колец (T-cell receptor excision circles — TREC) и B-клеточных эксцизионных колец (kappa-deleting recombination excision circles — KREC), формирующихся в процессе V(D)J-реарранжировки, в результате которой часть генетического материала вырезается и замыкается в кольцо [27, 23]. TREC служат маркерами созревания Т-клеток, недавно эмигрировавших из тимуса и слабо вовлекавшихся в процесс пролиферации или не делившихся совсем. В связи с этим концентрацию TREC в периферической крови рассматривают как показатель функциональной активности тимуса — его способности продуцировать Т-лимфоциты. В ходе пролиферации клеток иммунной системы эксцизионные кольца остаются в одной из дочерних клеток, что позволяет использовать их в качестве показателя пролиферации лимфоцитов и суррогатный маркер нормального развития иммунной системы. Содержание KREC в периферической крови является маркером эффективности развития B-клеточного звена иммунной системы в процессе эмбриогенеза.

Полное или частичное отсутствие (снижение уровня) T- и/или B-клеток у новорожденных определяется при первичных иммунодефицитах (ПИД), трисомиях по 21 и 18 хромосомам, различных цитогенетических мутациях, а также при недоношенности младенцев, в том числе при плановом кесаревом сечении (КС). Врожденные аномалии, включая пороки сердца, пороки развития ЖКТ, множественные врожденные пороки развития, а также преждевременные роды могут быть связаны со вторичной лимфопенией младенцев. Современная стратегия развития скрининга новорожденных связана с максимально ранним, в идеале сразу после рождения, выявлением иммунодефицитов, связанных с нарушением пролиферации Т- и В-клеток. В случае генетически обусловленных заболеваний, таких как ПИД, отсутствие функциональных Т- и/или В-лимфоцитов служит диагностическим критерием, в случае преждевременных родов и КС оценка содержания Т- и/или В-лимфоцитов может служить прогностическим маркером. И в том, и в другом случае выявление и оценка уровня TREC и KREC может применяться для скрининга новорожденных.

У взрослых пациентов снижение уровней T- и/или B-клеток может быть определено при выявлении ПИД, поздняя диагностика которых связана с разнообразной и преимущественно сглаженной клинической картиной заболевания, например при селективном IgA-дефиците, общей вариабельной иммунной недостаточности (ОВИН), являющихся наиболее частыми впервые выявляемыми формами ПИД у лиц старше 18 лет [7]. Так, например, описано применение анализа уровней TREC и KREC у взрослых пациентов с ОВИН и выявление его ассоциации с тяжестью течения заболевания; показано, что у взрослых больных с синдромом Ди Джорджи при нормальных уровнях KREC уровни TREC достоверно снижены [10, 14]. Кроме того, полное или частичное отсутствие T- и/или B-клеток у взрослых может быть связано с развитием СПИД у инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), развитием злокачественных заболеваний кроветворной системы, а также показано при трансплантации стволовых клеток [13, 22, 26].

Таким образом, определение уровней TREC и KREC для ранней диагностики первичных и вторичных иммунодефицитных состояний в клинической практике может дать ценную диагностическую и прогностическую информацию в отношении широкого спектра заболеваний, связанных с нарушением Т- и/или В-клеточного звена иммунитета как у детей, так и у взрослых людей, позволяя выявлять пациентов нуждающихся в углубленном обследовании и своевременно назначать адекватную терапию [4]. Количественная оценка уровней TREC и KREC высокоинформативна и может быть легко внедрена в рутинную лабораторную практику [16].

В настоящее время к недостаткам представленных на рынке диагностических наборов следует отнести два фактора. Во-первых, направленность наборов на диагностику иммунодефицитных состояний только у новорожденных и детей, в то время как взрослые пациенты остаются не охвачены [2]. Во-вторых, существенным недостатком является использование для нормирования данных одного эталонного нормировочного гена, в результате чего повышается вариабельность и снижается чувствительность результатов анализа, так как не существует идеального нормировочного гена, постоянного в независимости от ткани и состояния клеток в анализируемом образце. В связи с этим выбор эталонного гена является одним из самых ответственных этапов при разработке анализа. Оптимальным можно считать подход, при котором одновременно используются два и более эталонных гена [9].

Целью настоящей нашей работы была разработка высокочувствительного метода лабораторной оценки состояния иммунитета пациентов с использованием ПЦР в режиме реального времени на основе определения концентрации TREC и KREC у детей и взрослых.

Материалы и методы

Материалы

В работе были использованы следующие образцы от лиц, проживающих на территории Санкт-Петербурга и Ленинградской области: 157 образцов пуповинной крови новорожденных, 2000 образцов сухой капли крови на картах Гатри, полученных от здоровых доношенных новорожденных на 3–4 день жизни, 300 образцов, полученных от условно здоровых лиц старше 18 лет в виде цельной крови и сухой капли крови на картах Гатри одновременно. Были проанализированы также образцы от пациентов с диагностированными первичными иммунодефицитами: 10 образцов сухой капли крови от детей и 10 образцов в виде цельной крови и сухой капли крови на картах Гатри одновременно от больных старше 18 лет.

Среди детей с установленными первичными иммунодефицитами присутствовали пациенты с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью (ТКИН), транзиторной гипогаммаглобулинемией детского возраста, синдромом CHARGE, а также с недифференцированными ПИД, сопровождающимися пневмониями, неонатальными сепсисами, лимфоцитопениями. Все исследованные пациенты старше 18 лет имели установленный диагноз ОВИН.

Дополнительно исследовали образцы цельной крови, полученные от ВИЧ-инфицированных лиц. Представлены 100 образцов от пациентов 18–65 лет, проживающих в Северо-Западном федеральном округе, в том числе от 25 мужчин и 25 женщин с впервые выявленным ВИЧ и подтвержденным сроком инфицирования менее одного года, а также от 25 мужчин и 25 женщин, инфицированных ВИЧ не менее пяти лет, с высокой вирусной нагрузкой и вирусологически неэффективной антиретровирусной терапией (АРТ).

Методы

Методы сравнения

В качестве сравнительных методов использовали две диагностические системы: коммерческий набор «EnLite™ TREC-KREC kit» (PerkinElmer, Финляндия) и зарегистрированный в РФ диагностический набор «ИММУНО-БИТ» (АБВ-Тест, Москва).

Набор реагентов «EnLite™ TREC-KREC kit» (PerkinElmer, Финляндия). Набор предназначен для полуколичественного определения ДНК TREC и KREC у новорожденных в образцах крови, высушенной на фильтровальной бумаге. Определение уровней TREC и KREC осуществляется методом ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с последующим пересчетом абсолютных количеств целевых молекул на нормировочный ген бета-актина (BetaActin), с использованием специального термоциклера «VICTOR™ EnLite» (PerkinElmer, Финляндия). Полученные результаты представляют в копиях на мкл. Определены нижние границы для TREC и KREC при использовании набора — 33 и 46 копий/мкл соответственно. Указанный набор не зарегистрирован в Российской Федерации в качестве медицинского изделия, однако широко применяется в странах Европы и в США [12, 17].

Набор реагентов «ИММУНО-БИТ» (АБВ-Тест, Москва). Набор зарегистрирован в РФ в качестве медицинского изделия, предназначен для определения уровней TREC и KREC у новорожденных и детей в цельной крови и сухой капле крови. Определение уровней TREC и KREC осуществляется методом ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с последующим пересчетом абсолютных количеств целевых молекул на нормировочный ген сывороточного альбумина (ALB). Полученные результаты представляют в копиях на 10⁵ клеток.

Указанные нижние границы нормы целевых молекул при использовании набора различаются для образцов ДНК, экстрагированных из цельной крови (TREC — 200 копий/10⁵ клеток для детей в возрасте от 0 до 1 года, 80 копий/10⁵ клеток — от 1 года до 6 лет, 30 копий/10⁵ клеток от 6 до 18 лет; KREC — 250 копий/10⁵ клеток для детей в возрасте от 0 до 1 года, 100 копий/10⁵ клеток — от 1 года до 6 лет, 40 копий/10⁵ клеток от 6 до 18 лет ) и из сухой капли крови (TREC — 450 копий/10⁵ клеток, KREC — 250 копий/10⁵ клеток для новорожденных) [1].

Модифицированный метод

Выделение нуклеиновых кислот. Экстракцию ДНК проводили с помощью двух коммерческих комплектов реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала: «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия) и «Экстра-ДНК-Био» (Алкор-Био, Россия), согласно инструкциям производителей.

Амплификация целевых и нормировочных генов. В образце ДНК, выделенном из цельной крови или из капли сухой крови, определяли количество целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов «домашнего хозяйства» — ген гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы человека (HPRT) и ген белковой субъединицы р30 рибонуклеазы Р (RPP30) с использованием олигонуклеотидов и соответствующих олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов (табл. 1).

 

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, использованные для выявления ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30 методом ПЦР в режиме реального времени

Table 1. Primer and probe nucleotide sequences used to detect the DNA TREC, KREC as well as two reference normalization genes HPRT and RPP30 using real-time PCR

Праймер Primer	Нуклеотидная последовательность Nucleotide sequence
TRECF	5′-CACATCCCTTTCAACCATGCT-3′
TRECR	5′-TGCAGGTGCCTATGCATCA-3′
TRECzondFAM	5′-FAM-CACCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCC-RTQ1/BHQ1-3′
KRECF	5′-TCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCACT-3′
KRECR	5′-AGGAGCCAGCTCTTACCCTAGAGT-3′
KRECzondHEX	5′-HEX-TCTGCACGGGCAGCAGGTTGG-BHQ1-3′
HPRTF	5′-CTTGCTCGAGATGTGATGAAGG-3′
HPRTR	5′-CAGCAGGTCAGCAAAGAATTTATAG-3′
HPRT-zondCy5	5′-Cy5-ATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGCTCAAGG-RTQ2/BHQ2-3′
RPP30F	5′-TTTGGACCTGCGAGCG-3′
RPP30R	5′-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3′
RPP30-zondROX	5′-ROX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-RTQ2/BHQ2-3′

 

Для ПЦР в общем виде использовали следующий состав амплификационной смеси: буферный раствор, содержащий Трис-HCl pH 8,8 (при 25°C), KCl, 6–7 мМ MgCl₂, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Tween 20, SynTaq ДНК-полимераза с ингибирующими активность фермента антителами (или 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы или Hot-start Taq ДНК-полимеразы), вода без нуклеаз до конечного объема 15 мкл.

ПЦР проводили на амплификаторах с функцией детекции флуоресценции в режиме реального времени по каналам HEX/Yellow, FAM/Green, ROX/Orange и Cy5/Red планшетного типа (например, CFX96) или роторного типа (например, Rotor-Gene 3000/6000) при указанных в табл. 2 условиях. Регистрировали полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции с помощью программного обеспечения используемых приборов.

 

Таблица 2. Параметры программы амплификации на приборах CFX96 (Bio-Rad, США) и Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Австралия)

Table 2. Amplification setup parameters for CFX96 cycler (Bio-Rad, USA) and Rotor-Gene 3000/6000 cycler (Corbett Research, Australia)

Цикл Cycle	Температура, °С Temperature, °С	Время Time	Измерение флуоресценции Fluorescence measurement	Количество циклов Number of cycles
1	95	15 мин/15 min		1
2	95	10 с/10 s		5
	61	30 с/30 s
	72	15 с/15 s
3	95	10 с/10 s		40
	60	30 с/30 s	HEX/Yellow, FAM/Green, Cy5/Red, ROX/Orange
	72	15 с/15 s

 

Таблица 3. Соответствие определения уровней TREC, KREC у здоровых новорожденных и у детей с диагностированными первичными иммунодефицитами

Table 3. Correspondence between detecting the TREC and KREC levels in healthy newborns and children with diagnosed primary immunodeficiencies

Пациенты Patients	Данные по TREC и KREC Data for TREC and KREC	Количество Quantity	Разработанный способ Developed method	ИММУНО-БИТ IMMUNO-BIT	EnLite™ TREC-KREC kit
Здоровые новорожденные Healthy newborns	Нормальные уровни TREC и KREC Normal TREC and KREC levels	2000	98%	98%	97%
Дети с ПИД Children with PID	Сниженные уровни TREC и/или KREC Decreased TREC and/or KREC levels	10	100%	100%	100%

 

Оценка результатов амплификации. Анализировали кривые накопления флуоресцентного сигнала по четырем каналам: по каналу для флуорофора FAM/Green — сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК TREC; по каналу для флуорофора HEX/Yellow — сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК KREC; по каналу для флуорофора ROX/Orange сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК RPP30; по каналу для флуорофора Cy5/Red сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК HPRT. Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (устанавливается в середине линейного участка прироста флуоресценции положительного контроля в логарифмической шкале), что определяло наличие (или отсутствие) для данной пробы значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов.

Подготовка калибраторов. Для получения калибраторов и последующего определения уровней TREC и KREC использовали плазмиду, несущую синтетическую последовательность, соответствующую выявляемым фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30 со спейсерами между ними.

Полученную от производителя навеску плазмидной ДНК разводили ТЕ-буфером, исходя из указанной в паспорте производителем концентрации плазмиды и ее протяженности, составляющей 3370 нуклеотидов, получая препарат плазмиды с приблизительной концентрацией 10¹⁰ копий/мл. Готовили последовательные десятикратные разведения препарата плазмиды с концентрациями 10⁹, 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³, 10² копий/мл в ТЕ буферном растворе. Для предварительной оценки концентрации образцов плазмидной ДНК использовали цифровую ПЦР, позволяющую провести точную (вплоть до 1 копии на 100 000) количественную оценку представленности того или иного участка ДНК в образце без использования калибровочных кривых. При этом в ходе работы реакционная смесь распылялась на множество мельчайших капель (более 20 тысяч), в каждой из которых протекала индивидуальная ПЦР. Интересующую мишень амплифицировали, после чего подсчитывали положительные (присутствовала представляющая интерес последовательность мишени) и отрицательные (отсутствовала представляющая интерес последовательность мишени) реакции для абсолютного количественного определения интересующих молекулярных мишеней. Методом цифровой ПЦР определяли точную концентрацию (копий/мл) в препаратах плазмиды с предположительными концентрациями 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵ и относительно данных образцов проводили калибровку серии разведений плазмиды. Из серии разведений отбирали препараты плазмид с концентрациями 1–9 × 10⁸, 1–9 × 10⁷, 1–9 × 10⁶, 1–9 × 10⁵, 1–9 × 10⁴ копий/мл и присваивали полученным разведениям наименования, соответственно, — Калибратор К1, Калибратор К2, Калибратор К3, Калибратор К4, Калибратор К5.

Количественная оценка уровней TREC и KREC. Для количественной оценки уровней TREC и KREC параллельно постановке ПЦР в анализируемых образцах проводили постановку ПЦР для калибраторов с известными концентрациями.

Уровень ДНК TREC и KREC определяли в копиях на миллилитр и в копиях на 10⁵ клеток. Расчет уровней целевых молекул осуществляли с использованием следующих формул.

Эффективность ПЦР:

$E={10}^{\frac{1}{a}}$,

где Е — эффективность, a – коэффициент из уравнения y = ax+b, получаемого при аппроксимации зависимости порогового цикла от концентрации матрицы в образце.

Коэффициент пропорциональности:

$a=\frac{F_{Ct}}{C_0\times E^{Ct}}$,

где a — коэффициент пропорциональности, C_t — пороговый цикл, С₀ — исходная концентрация, F_Ct — уровень пороговой линии (флуоресценция в пороговом цикле), Е — эффективность.

$a_m=\frac{a_1+a_2+a_3+a4+a_5}{5}$

где a_m — a средняя для флуорофора, a_1–5 — a для каждого калибратора.

Концентрация целевых молекул в копиях на мл:

$C_0=\frac{F_{Ct}}{a_m\times E^{Ct}}$

где С₀ — исходная концентрация, a_m — a средняя для флуорофора, C_t — пороговый цикл, F_Ct — уровень пороговой линии (флуоресценция в пороговом цикле), Е — эффективность.

Концентрация целевых молекул в копиях на 100 тыс. клеток: С₁₀⁵ = ((4 × С₀)/C_HPRT + C_RPP30) × 10⁵ для женского пола и С₁₀⁵ = ((4 × С₀)/2C_HPRT + C_RPP30) × 10⁵ для мужского пола, соответственно, где С₁₀⁵ — количество TREC или KREC на 100 тыс. ядросодержащих клеток, С₀ — исходная концентрация TREC или KREC в миллилитре образца, С_HPRT — исходная концентрация HPRT в миллилитре образца, С_RPP30 — исходная концентрация RPP30 в миллилитре образца.

Аналитическая специфичность. Оценку аналитической специфичности проводили в ходе анализа in silico с помощью алгоритма BLASTn специфических нуклеотидных последовательностей фрагментов целевых генов TREC и KREC, а также RPP30 и HPRT, используемых в качестве внутреннего контроля, являющихся генетическими мишенями для ПЦР, с представленными в международной базе данных GenBank нуклеотидными последовательностями.

Аналитическая чувствительность. Аналитическую чувствительность (предел обнаружения) определяли на основе данных о пороговых циклах флуоресценции в серийных разведениях Калибратора К1 при постановке ПЦР, при ее эффективности 100±10%. Для этого готовили серию десятикратных разведений Калибратора К1 следующим образом: аликвоту объемом 10 мкл вносили в микропробирку объемом 1,5 мл, добавляли 90 мкл ТЕ-буфера, тщательно пипетировали и переносили 10 мкл полученного пула в новую микропробирку, куда снова добавляли 90 мкл ТЕ-буфера и т. д. до получения серии последовательных десятикратных разведений. С каждой пробой проводили ПЦР в 3-х повторах. Вычисляли средние значения концентрации образца в каждом разведении (копий/мл). Наименьшую концентрацию принимали за предел обнаружения. Об аналитическом диапазоне измерений судили по результатам анализа предела обнаружения. За нижнее значение диапазона принимали предел обнаружения, а за верхнее — концентрацию Калибратора К1.

Точность измерений. Оценку точности (правильности) измерений (ТИ) проводили, используя метод добавок (тест на «открытие»), заключающийся в постановке в восьми повторах ПЦР суммарной пробы, представляющей собой смесь двух Калибраторов наименьшей концентрации, и анализе отклонения практического значения концентрации ДНК TREC и KREC в суммарной пробе от теоретического. При этом значение ТИ должно находиться в пределах от 90 до 110%. Для получения суммарной пробы смешивали в равных объемах Калибраторы К4 и К5 с концентрациями 3,13 × 10⁵ и 3,34 × 10⁴ копий/мл соответственно. Анализ проводили по формуле: ТИ [%] = (Спр/Ст) × 100, где Спр [копий/мл] — рассчитанное по калибровочному графику среднее (практическое) значение концентрации ДНК в исследуемой суммарной пробе при n = 8; Ст [копий/мл] — расчетное (теоретическое) значение концентрации ДНК в исследуемой пробе, рассчитываемое по формуле: Ст [копий/мл] = (СК4 + СК5)/2, где СК4 и СК5 [копий/мл] — значения концентраций ДНК TREC/KREC в Калибраторах К4 и К5.

Эквивалентность результатов при использовании цельной крови и сухой капли крови. Оценку эквивалентности образцов цельной крови с гемостабилизатором (ЭДТА) и сухих капель крови проводили с использованием ДНК, экстрагированной из цельной крови и сухой капли крови 300 условно здоровых лиц и 10 пациентов старше 18 лет с диагностированным ПИД. Полученные данные сравнивали по наличию позитивности или негативности в отношении Т- и В-клеточного иммунодефицита, опираясь на значения нижней границы нормы для концентрации TREC и KREC в различных возрастных группах. В случае совпадения результатов (положительных или отрицательных) в различных типах клинических образцов делали вывод об эквивалентности образцов цельной крови и сухих капель крови.

Диагностическая чувствительность и специфичность. Оценку диагностической чувствительности и диагностической специфичности проводили с использованием образцов сухих капель крови, полученных от 2000 новорожденных без иммунодефицитов, 300 условно здоровых взрослых лиц, а также от пациентов с диагностированными ПИД (10 детей и 10 взрослых человек).

Границы нормы уровней TREC и KREC у новорожденных. Для определения границ нормы уровней TREC и KREC у новорожденных результаты исследуемых аналитов в группе условно здоровых детей были ранжированы, после чего из общего массива данных удаляли так называемые выбросы, согласно методу Диксона–Рида, и определяли 95% доверительный интервал [3].

Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prizm 5 и Microsoft Exel 2010. Нормальность распределения полученных числовых данных проверяли с помощью двух критериев: Колмогорова–Смирнова и Шапиро–Уилка. Для оценки статистически значимых различий между отдельными выборками применяли критерий Манна–Уитни, а также ROC-анализ. Корреляционный анализ проводили с расчетом коэффициента Спирмена, значение которого оценивали по шкале Чеддока.

Результаты

Для определения уровней TREC и KREC в цельной крови или в сухой капле крови пациентов был разработан способ на базе ранее предложенной нами методики [6].

В рамках настоящей работы для оценки и корректировки эффективности экстракции ДНК и последующей ПЦР, а также в качестве основы для нормирования и расчетов результатов анализа целевых аналитов нами были выбраны два референсных гена: ген гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы человека (HPRT) и ген белковой субъединицы р30 рибонуклеазы Р (RPP30). Было продемонстрировано, что эти гены в цельной крови и в сухой капле крови имеют постоянный уровень, зависящий только от количества клеток, во всех образцах вне зависимости от группы пациентов.

Согласно модифицированному нами методу, выделенную ДНК использовали для одновременной амплификации в одной емкости участков целевых молекул ДНК TREC, KREC и эталонных нормировочных генов RPP30 и HPRT с использованием четырех пар олигонуклеотидных праймеров и соответствующих им олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов, несущих на 5′-конце флуорофоры, а на 3′-конце нефлуоресцентные тушители (см. табл.1). Основой для возникновения флуоресценции является амплификация целевых и эталонных фрагментов ДНК на специфических олигонуклеотидах. Для детекции накопления специфических продуктов ПЦР используются флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды. В ходе реакции происходит гибридизация олигонуклеотидов и зондов с комплементарными участками ДНК-мишеней. Образование специфического продукта амплификации в присутствии фермента Taq-полимеразы сопровождается отщеплением флуоресцентной метки от зондов благодаря наличию у Taq-полимеразы 5′-экзонуклеазной активности. Олигонуклеотидные зонды, используемые для детекции ДНК целевых молекул и детекции фрагментов ДНК эталонных нормировочных генов, имеют флуоресцентные метки с разными спектрами поглощения и испускания, что позволяет проводить одновременную регистрацию флуоресценции по четырем каналам амплификатора с функцией детекции флуоресценции в режиме реального времени. По каналам, соответствующим флуорофорам FAM и HEX, детектировали фрагменты ДНК TREC и KREC, а по каналам, соответствующим флуорофорам Cy5 и ROX, — фрагменты ДНК генов HPRT и RPP30 соответственно (рис. 1).

 

Рисунок 1. Кривые флуоресценции, отражающие динамику образования продуктов реакции в ходе амплификации

Figure 1. Fluorescence curves reflecting dynamic reaction products formation during amplification

Примечание. ОЕФ — относительные единицы флюоресценции. Кружками и треугольниками обозначены сигналы флуорофоров FAM и HEX, свидетельствующие о накоплении продуктов амплификации целевых молекул TREC и KREC соответственно. Ромбами и крестами обозначены сигналы флуорофоров ROX и Cy5, представляющие собой результат амплификации эталонных нормировочных генов RPP30 и HPRT соответственно, свидетельствующие об успешности экстракции ДНК и амплификации в целом.

Note. RFU — relative fluorescence units. The circles and triangles indicate the signals of the FAM and HEX fluorophores pointing at accumulation of amplification products of the target TREC and KREC molecules, respectively. Diamond and cross symbols indicate the signals of the ROX and Cy5 fluorophores resulting from amplification of the reference normalization genes RPP30 and HPRT, respectively, evidencing about successful DNA extraction and overall amplification.

 

Выделение и амплификацию ДНК образца считали успешными, если на каналах Cy5 и ROX получены значения порогового цикла Ct.

Анализ результатов проводили с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР c гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием калибровочных графиков, построенных при амплификации калибраторов с известными концентрациями искомых продуктов (TREC, KREC) и эталонных генов (HPRT, RPP30). Наличие калибраторов с известной концентрацией и негативного контроля (К–) позволяет контролировать все этапы анализа для каждого образца и оценивать влияние ингибиторов на результаты амплификации.

При оценке предела обнаружения аналитическая чувствительность составила 10³ копий ДНК TREC/KREC на 1 мл анализируемого образца, аналитический диапазон измерений ДНК TREC/KREC составил от 10³ до 10⁹ копий/мл. На основании вышесказанного в качестве калибраторов определили препараты плазмид с концентрациями 1–9 × 10⁸, 1–9 × 10⁷, 1–9 × 10⁶, 1–9 × 10⁵, 1–9 × 10⁴ копий/мл (рис. 2).

 

Рисунок 2. Кривые флуоресценции и калибровочные графики, отражающие динамику образования продуктов реакции амплификации при анализе серии разведений калибраторов

Figure 2. Fluorescence curves and calibration graphs reflecting dynamic formation of amplification reaction products in the analysis of calibrator dilutions series

Примечание. ОЕФ — относительные единицы флюоресценции. Кружками и треугольниками обозначены сигналы флуорофоров FAM и HEX, свидетельствующие о накоплении продуктов амплификации целевых молекул TREC и KREC соответственно. Ромбами и крестами обозначены сигналы флуорофоров ROX и Cy5, представляющие собой результат амплификации эталонных нормировочных генов RPP30 и HPRT соответственно.

Note. RFU — relative fluorescence units. The circles and triangles indicate the signals of the FAM and HEX fluorophores, indicating accumulation of amplification products of the target TREC and KREC molecules, respectively. Diamond and cross symbols indicate the signals of the ROX and Cy5 fluorophores after amplification of the reference normalization genes RPP30 and HPRT, respectively.

 

При оценке аналитической специфичности in silico установлено, что искомые последовательности имеют сходство только с последовательностями соответствующих генов TREC, KREC, RPP30 и HPRT в геноме человека (рис. 3).

 

Рисунок 3. Анализ in silico фрагментов нуклеотидных последовательностей генов человека

Figure 3. In silico analysis of the fragments of human gene nucleotide sequences

Примечание. А — фрагмент целевой молекулы ДНК TREC, Б — фрагмент целевой молекулы ДНК KREC, В — фрагмент ДНК эталонного нормировочного гена HPRT, Г — фрагмент ДНК эталонного нормировочного гена RPP30.

Note. A — fragment of the target DNA molecule TREC, B — fragment of the target DNA molecule KREC, C — DNA fragment of the HPRT reference normalization gene, D — DNA fragment of the RPP30 reference normalization gene.

 

При оценке точности (правильности) измерений в 8 повторах с использованием амплификаторов различных модификаций, ТИ на приборе планшетного типа (CFX) составила 95,84%, а на приборе роторного типа (Rotor-Gene 3000) — 95,11%, что соответствует нормативному показателю (90–110%).

При оценке эквивалентности образцов цельной крови и сухих капель крови во всех проанализированных случаях при параллельных тестированиях условно здоровых лиц и в цельной крови, и в сухой капле крови не выявлено снижения уровней TREC и KREC. При анализе образцов, полученных от больных с ПИД, показано параллельное снижение уровней TREC и KREC в цельной крови и в сухой капле крови.

Ни в одной из выборок (уровни TREC и KREC в цельной и сухой крови) распределение числовых данных не подчинялось закону нормального распределения. В связи с вышесказанным, для расчета коэффициента корреляции использовали критерий Спирмена. При оценке ранговой корреляции Спирмена результатов уровней TREC, полученных при анализе образцов ДНК, экстрагированных из цельной крови и сухого пятна крови, показано: r_S = 0,7265, p < 0,0001 (95% ДИ: 0,6674–0,7765), теснота связи по шкале Чеддока — высокая. При анализе уровней KREC — r_S = 0,7349, p < 0,0001 (95% ДИ: 0,6773–0,7836), теснота связи по шкале Чеддока — высокая. Таким образом, модифицированный нами способ позволяет использовать в качестве клинического материала как цельную кровь, так и сухую каплю крови.

В ходе работы были определены нижние границы нормы целевых аналитов у новорожденных в группе, образцы которой представлены цельной пуповинной кровью и в группе, образцы которой представлены сухой каплей крови на картах Гатри. Достоверных различий между группами не выявлено (p > 0,05), в связи с чем группы были объединены и определены общие для цельной крови и сухой капли крови границы норм новорожденных. Нижняя граница нормы уровней TREC для новорожденных составила 892,6 копий/10⁵ клеток, уровней KREC — 400,4 копий/10⁵ клеток.

В рамках оценки диагностической чувствительности и диагностической специфичности при сравнении выборок условно здоровых новорожденных и детей с диагностированными первичными иммунодефицитами на основании результатов анализа, полученных с использованием модифицированного нами метода, площадь под кривой для уровней TREC и KREC достигла единицы при 95% ДИ: 1,000–1,000, p < 0,0001 (рис. 4).

 

Рисунок 4. ROC-кривые, построенные при сравнении результатов анализа с использованием модифицированного нами метода выборок условно здоровых новорожденных и детей с диагностированными первичными иммунодефицитами по параметрам TREC (А) и KREC (Б)

Figure 4. ROC-curves constructed by comparing the analysis data by using the proposed modified method for samples of apparently healthy newborns and children diagnosed with primary immunodeficiency, according to the TREC (A) and KREC (B) parameters

 

В качестве тестов сравнения использовали диагностический коммерческий набор реагентов для количественного определения ДНК TREC и KREC методом ПЦР в режиме реального времени «ИММУНО-БИТ» (АБВ-Тест, Москва) и «EnLite™ TREC-KREC kit» (PerkinElmer, Финляндия).

Согласно проведенному анализу, ни в одной из выборок распределение числовых данных не подчинялось закону нормального распределения. Для расчета коэффициентов корреляции использовали критерий Спирмена. При оценке ранговой корреляции Спирмена результатов уровней TREC, полученных при анализе образцов ДНК условно здоровых новорожденных и детей с диагностированными первичными иммунодефицитами, экстрагированных из сухого пятна крови, проанализированных с использованием модифицированного нами метода и коммерческим набором «ИММУНО-БИТ» (АБВ-Тест, Москва), показано: r_S = 0,7932, p < 0,0001 (95% ДИ: 0,5714–0,9070), теснота связи по шкале Чеддока — высокая. При анализе уровней KREC — r_S = 0,8511, p < 0,0001 (95% ДИ: 0,6805–0,9342), теснота связи по шкале Чеддока — высокая. При сравнении полученных результатов с использованием модифицированного нами метода и набора «EnLite™ TREC-KREC kit» (PerkinElmer, Финляндия) коэффициент корреляции для уровней TREC и KREC выше, теснота связи по шкале Чеддока высокая: для TREC r_S = 0,8130, p < 0,0001 (95% ДИ: 0,6078–0,9164), для KREC r_S = 0,7495, p < 0,0001 (95% ДИ: 0,4941–0,8858).

При сравнении выборок взрослых условно здоровых лиц и больных с диагностированными первичными иммунодефицитами на основании результатов анализа, полученных с использованием модифицированного нами метода, площадь под кривой для уровней TREC составила 0,98±0,015 при 95% ДИ: 0,9489–1,009, p < 0,0001; для уровней KREC составила 0,99±0,003 при 95% ДИ: 0,9918–1,003, p < 0,0001 (рис. 5).

 

Рисунок 5. ROC-кривые, построенные при сравнении результатов анализа с использованием модифицированного нами метода выборок взрослых условно здоровых лиц и больных с диагностированными первичными иммунодефицитами по параметрам TREC (А) и KREC (Б)

Figure 5. ROC-curves constructed by comparing the analysis data by using the proposed modified method for samples of apparently healthy adults and patients with diagnosed primary immunodeficiency, according to the TREC (A) and KREC (B) parameters

 

Анализ количества TREC и KREC в образцах цельной крови, полученной от ВИЧ-инфицированных больных, показал достоверное снижение уровней целевых аналитов у длительное время инфицированных пациентов с вирусологической неэффективностью АРТ по сравнению с контрольной группой (рис. 6). Площадь под кривой для параметра TREC составила 0,9997±0,0003, при 95% ДИ: 0,9989–1,000, p < 0,0001. Для параметра KREC площадь под кривой составила 0,9948±0,0024, при 95% ДИ: 0,9900–0,9996, p < 0,0001. Разницы уровней ДНК TREC и KREC между здоровыми людьми и лицами с впервые выявленным ВИЧ со сроком инфицирования менее одного года не выявлено.

 

Рисунок 6. ROC-кривые, построенные при сравнении результатов анализа с использованием модифицированного нами метода выборок взрослых условно здоровых лиц и ВИЧ-инфицированных больных: с вирусологической неэффективностью АРТ по параметрам TREC (А) и KREC (Б); с недавно выявленной инфекцией ВИЧ по параметрам TREC (В) и KREC (Г)

Figure 6. ROC-curves constructed while comparing the analysis data by using the proposed modified method for samples of apparently healthy adults and HIV-infected patients: with virological ART ineffectiveness according to the TREC (A) and KREC (B) parameters; with newly diagnosed HIV infection according to the TREC (C) and KREC (D) parameters

 

Наборы реагентов для определения уровней ДНК TREC и KREC «ИММУНО-БИТ» (АБВ-Тест, Москва) и «EnLite™ TREC-KREC kit» (PerkinElmer, Финляндия) предназначены для работы с образцами сухой капли крови, полученными у детей, однако в рамках настоящей работы мы сочли возможным провести анализ с использованием указанных методов у взрослых людей, чтобы оценить корреляцию между полученными результатами и уровнями целевых аналитов, определенными модифицированным нами методом. При оценке ранговой корреляции Спирмена результатов уровней TREC, полученных с использованием модифицированного нами метода и коммерческим набором «ИММУНО-БИТ» (АБВ-Тест, Москва) показано: r_S = 0,4941, p = 0,0026 (95% ДИ: 0,1826–0,7155), теснота связи по шкале Чеддока — умеренная. При анализе уровней KREC — r_S = 0,8244, p < 0,0001 (95% ДИ: 0,6715–0,9099), теснота связи по шкале Чеддока — высокая. При сравнении полученных результатов у взрослых людей с использованием модифицированного нами метода и набора «EnLite™ TREC-KREC kit» (PerkinElmer, Финляндия) коэффициент корреляции для уровней TREC и KREC ниже: для TREC корреляция не достоверная r_S = 0,3301, p = 0,0528 (95% ДИ: 0,01382–0,6042), для KREC теснота связи по шкале Чеддока умеренная — r_S = 0,4142, p = 0,0134 (95% ДИ: 0,0837–0,6626).

Обсуждение

Мультиплексная амплификация TREC, KREC и нормировочного гена в одной реакции устраняет вариабельность, связанную с ошибками пипетирования, позволяя более точно оценивать уровни целевых аналитов. При этом необходимо с особым вниманием отнестись к выбору нормировочных генов, необходимых для оценки и корректировки эффективности экстракции ДНК и последующей ПЦР из разных клинических образцов. Ряд генов домашнего хозяйства традиционно используется в качестве эталонных, однако, как и другие гены, они могут быть вариабельны при некоторых патологических состояниях из-за своей мультифункциональности. Не существует идеального нормировочного гена, однако правильно подобранный эталонный ген может уменьшить вариации, вызванные разным количеством и качеством исходного биологического материала, разной эффективностью выделения нуклеиновых кислот и разной эффективностью ПЦР. В связи с вышесказанным, оптимальным является одновременное использование двух эталонных нормировочных генов. В качестве таковых нами были выбраны гены «домашнего хозяйства» — и ген белковой субъединицы Р30 рибонуклеазы Р (RPP30), и ген гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы человека (HPRT). Выбор RPP30 был обоснован анализом литературных данных, свидетельствующих о применимости данного гена в качестве контрольного для определения эффективности экстракции геномной ДНК человека, в качестве эндогенного контроля для диагностики и количественной оценки бактериальной и вирусной нагрузки для нормализации количества копий инфекционных агентов с количеством клеток, основанным на наличии двух копий RPP30 в каждой клетке, а также в качестве эталонного гена для определения вариаций числа копий таргетных генов в геноме человека [11].

Выбор гена HPRT, локализующегося на X-хромосоме, обусловлен тем, что половая принадлежность потенциально может влиять на иммунитет, развитие связанных с иммунным статусом заболеваний. Кроме того, хотя одни исследователи сообщают об отсутствии корреляции уровней TREC и KREC с полом [8, 23], другие указывают на более высокий уровень TREC у девочек-подростков, замедленное снижение уровня TREC у взрослых женщин по сравнению с мужчинами [18, 24], более высокий уровень TREC у новорожденных девочек, чем у новорожденных мальчиков [21] и, напротив, более высокий уровень KREC у девочек в возрасте полового созревания (9–12 лет), чем у мальчиков [16]. Таким образом, можно предположить, что половые гормоны способны играть существенную иммуномодулирующую роль в иммунных реакциях [15]. Выбор одного из нормировочных генов с локализацией на X-хромосоме и, соответственно, отличающиеся формулы расчетов уровней TREC и KREC для женского и мужского полов позволяют более точно оценить влияние гендера на уровни TREC и KREC. Однако наши результаты не показали значительных различий в уровнях целевых аналитов между женщинами и мужчинами, независимо от возраста. Такие отличия в получаемых разными исследовательскими группами результатах могут быть связаны с различиями и объемами анализируемых выборок.

Следует отметить, что цифровая ПЦР обладает большей точностью и чувствительностью, чем мультиплексная ПЦР, что могло бы позволить снизить частоту ложноположительных результатов [19, 25], однако высокая стоимость является очевидным недостатком метода, не позволяющим использовать его в рутинной диагностике. Тем не менее применение в нашей работе цифровой ПЦР для определения концентрации калибраторов, позволяет увеличить точность метода без существенного увеличения стоимости.

Ряд первичных иммунодефицитов, имеющих сравнительно более легкую форму течения заболевания, позволяют больным достичь совершеннолетия и могут быть впервые выявлены у взрослых людей [5]. Поскольку с возрастом уровни ДНК TREC и KREC в периферической крови снижаются, для оценки состояния иммунитета пациента необходимы методики с высокой чувствительностью и специфичностью. В противном случае, в то время как адекватная терапия позволяет не только сохранить жизнь больным с тяжелыми ПИД, но и значительно улучшить качество жизни пациентов с более легкими формами заболеваний, взрослые больные с общим вариабельным иммунодефицитом могут не получать адекватной заместительной терапии из-за отсутствия своевременной диагностики. Модифицированный нами способ оценки иммунодефицитных состояний может быть использован не только для выявления первичных иммунодефицитов у детей, но и для определения снижения иммунитета у взрослых людей. Данное обстоятельство представляется особенно важным, так как из-за распространенного мнения о том, что ПИД характерны только для детского возраста, врачи смежных специальностей исключают ПИД из дифференциальной диагностики у взрослых пациентов. Описанный в настоящей работе метод количественного определения уровней TREC и KREC в периферической крови для лабораторной диагностики состояния иммунитета пациентов с использованием ПЦР в режиме реального времени позволит обратить особое внимание лечащих врачей на таких пациентов.

Не менее значима возможность применения настоящего метода не только для выявления случаев первичных иммунодефицитов, но и для диагностики состояния иммунитета при вторичных иммунодефицитах.

Так, при анализе двух групп ВИЧ-инфицированных больных показано достоверное снижение уровней TREC и KREC у инфицированных в течение длительного времени пациентов с вирусологической неэффективностью АРТ, в то время как уровни целевых аналитов у инфицированных менее года лиц не отличались от уровней группы условно здоровых взрослых людей. Полученные нами результаты согласуются с данными иностранных коллег, согласно которым количество TREC у ВИЧ-инфицированных пациентов коррелирует с различными клинико-патологическими параметрами (возраст больных, вирусная нагрузка РНК ВИЧ в плазме, количество CD4⁺ T-лимфоцитов, процентное содержание CD4⁺ T-лимфоцитов), а продукция KREC при АРТ остается неизменной на протяжении 10–12 месяцев, однако снижается после продолжительной терапии [20], что также не противоречит выявленному нами снижению KREC у получавших терапию больных. Известно, что уровень TREC у ВИЧ-инфицированных лиц повышается после начала АРТ и, хотя не поднимается до характерных для здоровых людей уровней, достигает плато через 12 месяцев и остается стабильным в течение нескольких лет [20]. В нашей работе мы не наблюдали достаточно высоких уровней TREC у длительно инфицированных ВИЧ больных, находящихся на терапии. По всей видимости, это может быть связано с тем, что исследуемая нами группа была представлена больными с вирусологической неэффективностью АРТ и, соответственно, высокой вирусной нагрузкой, а также преимущественно низким количеством CD4⁺ клеток. Полученные результаты согласуются с ранее показанными данными, согласно которым количество TREC у пациентов, нуждающихся в АРТ, значительно ниже не только по сравнению с контрольной группой, но и по сравнению с ненуждающимися в лечении, согласно действующим рекомендациям, ВИЧ-инфицированными пациентами с относительно сохранным числом клеток CD4⁺ [23]. Таким образом, количественное определение уровней TREC и KREC в периферической крови представляет собой усовершенствованный метод мониторинга состояния иммунитета ВИЧ-инфицированных лиц, а также потенциально — метод определения нуждающихся в терапии больных.

Заключение

Способ лабораторной диагностики состояния иммунитета пациентов с использованием ПЦР в режиме реального времени на основе определения уровней TREC и KREC обладает высокой специфичностью и чувствительностью. Калибраторы характеризуются стабильностью и воспроизводимостью. Метод позволяет диагностировать снижение Т- и/или В-клеточного иммунитета у детей и взрослых, и может быть применен для детекции молекул TREC и KREC как в образцах цельной периферической крови, так и в сухой капле крови с использование карт Гатри. При этом возможно применение единых значений референсных норм, независимо от анализируемого клинического материала. Результаты испытаний свидетельствуют о возможности эффективного использования мультиплексной ПЦР-диагностики как для комплексного первичного тестирования/скрининга новорожденных, так и для оценки состояния иммунитета в целях выявления взрослых больных ПИД и в рамках диагностики пациентов со вторичными иммунодефицитами, например, с инфекцией ВИЧ. Своевременная персонифицированная оценка состояния иммунитета будет способствовать сохранению жизни пациентов и улучшению ее качества.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

M. A. Saitgalina

St. Petersburg Pasteur Institute

Email: Sajgalinam@mail.ru

Junior Researcher, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, St.Petersburg

Yu. V. Ostankova

St. Petersburg Pasteur Institute

Author for correspondence.
Email: shenna1@yandex.ru

PhD (Biology), Head of the Laboratory of HIV Immunology and Virology; Senior Researcher, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, St. Petersburg

N. E. Liubimova

St. Petersburg Pasteur Institute

Email: natelu@mail.ru

PhD (Biology), Researcher, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, St. Petersburg

A. V. Semenov

Ekaterinburg Research Institute of Viral Infections of SRC VB Vector of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Email: alexvsemenov@yahoo.com

PhD, MD (Biology), Director

Russian Federation, Ekaterinburg

R. N. Kuznetsova

St. Petersburg Pasteur Institute; I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University of the Ministry of Healthcare of Russian Federation

Email: kuznetzova.rais@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1668-6716

PhD (Medicine), Allergologist-Immunologist, Associate Professor, Department of Immunology

Russian Federation, St. Petersburg; St. Petersburg

A. A. Totolian

St. Petersburg Pasteur Institute; I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University of the Ministry of Healthcare of Russian Federation

Email: totolian@spbraaci.ru

RAS Full Member, PhD, MD (Medicine), Professor, Director, Head of the Department of Immunology

Russian Federation, St. Petersburg; St. Petersburg

References

Supplementary files