16S-ITS-23S rRNA operon segment sequencing provides necessary and sufficient conditions for bacterial species-specific identification

O. B. Ogarkov; Огарков О. Б.; S. N. Zhdanova; Жданова С. Ни.; E. A. Orlova; Орлова Е. А.; P. A. Khromova; Хромова П. А.; N. L. Belkova; Белькова Н. Л.; V. V. Sinkov; Синьков В. В.; I. G. Kondratov; Кондратов И. Г.

doi:10.15789/2220-7619-ROS-1871

16S-ITS-23S rRNA operon segment sequencing provides necessary and sufficient conditions for bacterial species-specific identification

Authors: Ogarkov O.B.¹, Zhdanova S.N.¹, Orlova E.A.¹, Khromova P.A.¹, Belkova N.L.¹, Sinkov V.V.¹, Kondratov I.G.¹
Affiliations:
1. Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems
Issue: Vol 12, No 5 (2022)
Pages: 976-980
Section: METHODS
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/1871
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-ROS-1871
ID: 1871

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Sequencing of the 16S rRNA gene is the predominant method for assessing microbial communities and strain molecular identification. The short reads (2^nd generation sequencing)-based technology does not allow analysis beyond the 16S rRNA gene. The taxonomic verification level of samples usually remains at the genus or even family level. Currently, there have been proposed the latest versions of long-read technologies (Oxford Nanopore MinION, PacBio) for amplicon sequencing of near-complete ribosomal operon, including genes 16S, 23S, 5S, and internal transcribed spacer (ITS). At the moment, this approach has not been sufficiently studied, in addition, it involves PCR amplification of a very extended DNA region (more than 4000 bp-long). Materials and methods. The collection of non-tuberculous mycobacteria strains and their primary identification was carried out in the years 2019–2021. The strains were obtained by inoculation of positive cultures from the Bactec MGIT 960 bacteriological analyzer lacking MPT64 antigen in the MGIT TB Identification Test (Becton Dickinson, USA) on Lowenstein-Jensen medium. Preliminary species strain identification was carried out with the Speed-oligo Mycobacteria kit (Vircell, Spain) according to the manufacturer’s protocol. In this work, both known and newly developed universal bacterial primers flanking the near-complete 16S rRNA gene, ITS, and the beginning of the 23S rRNA gene are used. In the present study, both known and newly developed universal bacterial primers are used to flank the near-complete 16S rRNA gene, ITS, and start of the 23S rRNA gene. Results and discussion. Sanger sequencing of the amplicons (about 2000 bp) obtained shows the taxonomic level sufficient to determine species up to 8 strains of non-tuberculous mycobacteria isolated from humans that caused clinically and bacteriologically confirmed diseases. The method proposed for PCR amplification of a bacterial operon a fragment containing most of the 16S rRNA gene, ITS, and the beginning of the 23S rRNA gene is considered by us as an approbation of a methodological approach to study microbial communities in material with a high degree of degradation (necrotic foci, etc.). The results obtained indicate a significantly higher resolution of the approach used than the classical 16S rRNA gene sequencing.

Keywords

production of biofilms, sequencing, 16S, ITS, rRNA operon, Mycobacterium

Full Text

Введение

Ген 16S рРНК десятилетиями используется для филогенетической классификации бактерий и архей. В этом отношении ген выделяется своей универсальностью, устойчивостью к горизонтальному переносу генов и высокой степенью сохранности [7, 15]. Высококонсервативные области перемежаются с высоковариабельными, что в ряде случаев позволяет проводить филогенетическую классификацию по видам и более высоким таксономическим уровням. Кроме того, этот ген оказался отличной мишенью для исследований, направленных на количественную оценку таксономического состава микробных сообществ с помощью высокопроизводительного секвенирования ампликонов ПЦР [6]. Праймеры обычно конструируются таким образом, чтобы они гибридизовались с участками консервативных сайтов, фланкирующих вариабельную область, это позволяет извлечь наиболее полную информацию при изучении микробных сообществ. Несмотря на свои многочисленные преимущества, ген 16S рРНК имеет ограниченное количество филогенетически информативных сайтов. Филогенетический анализ на основе гена 16S рРНК чувствителен к стохастической ошибке и демонстрирует разрешение, во многих случаях ограниченное родом микроорганизма [3, 5]. Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК широко используется платформами на основе секвенирования коротких прочтений [4], однако эта технология не позволяет расширить рамки мишени [9]. Для секвенирования ампликонов полного рибосомального оперона в последние годы предлагается использование технологий длинных прочтений, таких как Oxford Nanopore MinION и PacBio [2, 9]. Этот подход позволяет включить в исследование гены 16S, 23S, 5S и межрибосомальный транскрибируемый спейсер (ITS). Область полного рибосомального оперона 16S- ITS-23S имеет в четыре раза больше вариабельности, чем одна только область 16S, и может использоваться для таксономической классификации на уровне вида, а в некоторых случаях на уровне штамма [2]. В настоящее время ведется активная работа по разработке инструментов для анализа результатов NGS микробных сообществ полных рибосомальных оперонов бактерий [10, 12], в том числе в очагах туберкулеза [11]. Существенным недостатком этого подхода является почти предельная для стандартной ПЦР длина ампликона (более 4000 п.н.), что может существенно исказить количественную оценку исследуемых видов при изучении микробных сообществ. Задачей настоящего исследования был дизайн и апробация эубактериальных праймеров для амплификации участка 16S-ITS-23S рибосомального оперона при длине ампликона около 2000 п.н., оптимальной для большинства коммерческих Taq-полимераз.

Материалы и методы

Сбор штаммов нетуберкулезных микобактерий и их первичная идентификация осуществлена в рамках некоммерческого сотрудничества с ОГБУЗ Иркутская Областная Туберкулезная Больница в 2019–2021 гг. Штаммы получены при высеве на среду Левенштейна–Йенсена положительных культур с бактериологического анализатора Bactec MGIT 960, не имеющих антигена MPT64 в иммунохроматографическом тесте MGIT TB Identification Test (Becton Dickinson, США). Предварительная видовая идентификация штаммов осуществлена набором Speed-oligo Mycobacteria (Vircell, Испания) по протоколу производителя. Данный тест предполагает ПЦР амплификацию ДНК фрагментов 16S рРНК и ITS с последующей гибридизацией ампликонов с олигонуклеотидными зондами на хроматографической тест-полоске. Секвенирование по Сэнгеру фрагментов 16S-ITS-23S рРНК проведено на базе ЗАО «Евроген». В работе изначально планировалось использовать 9 культур нетуберкулезных микобактерий (MOT — Mycobacterium other than tuberculosis), однако одна из культур по результатам секвенирования по Сэнгеру была исключена, как смесь нескольких видов микроорганизмов. В дальнейшем исследовались 5 медленнорастущих (MOT1, MOT2, MOT6, MOT7, MOT9) и 3 быстрорастущих штамма микобактерий (MOT3, MOT4, MOT8).

ПЦР в течение 37 циклов выполняли с праймерами 27F и 189R (синтезированы ЗАО «Евроген») в концентрации 500 нмоль каждого с реактивами AmpliTaqGold 360 MasterMix (Applied Biosystems, США) в присутствии 1× раствора энхансера на амплификаторе CFX-96 (BioRad, США). Режим амплификации: 95°С — 10 мин, активация полимеразы; 95°С — 60 с; 55°С — 30 с; 72°С — 120 с. Нами использована структура широко известного эубактериального праймера 27F 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG [13, 14], берущего старт вначале гена 16S рРНК. Праймер 189R 5′-GGGAASTGAAACATCTHAGTA, гибридизующийся в начале гена 23S рРНК, сконструирован с учетом известной вариабельности гена 23S рРНК [8], структура праймера проверена в сервисах SILVA rRNA database (https://www.arb-silva.de) и Blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Секвенирование по Сэнгеру выполнялось в ЦКП «Центр разработки прогрессивных персонализированных технологий здоровья» ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ (г. Иркутск), с использованием праймеров 27F, 189R и внутреннего 800L 5′-AGGATTAGATACCCTGGTAGTC (ген 16S рРНК) [1].

Результаты и обсуждение

Нуклеотидные последовательности фрагментов рибосомального оперона 16S-ITS-23S образцов MOT1, MOT2, MOT3, MOT4, MOT6, MOT7, MOT8, MOT9 размещены в GenBank под номерами MZ823582, MZ851786, MZ851787, MZ851788, MZ851789, MZ851790, MZ851791, MZ851792 соответственно. Как видно из таблицы, в одном случае (MOT3) в рамках предлагаемого подхода определен вид возбудителя, ранее не установленный коммерческим тестом Speed-oligo Mycobacteria (Vircell, Испания). В двух случаях (MOT6 и MOT9) изменена видовая принадлежность штамма. В остальных случаях наблюдалось совпадения результатов коммерческого теста с результатами секвенирования по Сэнгеру, при этом в двух случаях (MOT1 и MOT8) удалось провести идентификацию таксонов до подвида.

Таблица. Сравнительная идентификация секвенированием по Сэнгеру и тест-системой Speed-oligo «Mycobacteria»

Table. Sanger sequencing and the Speed-oligo test system of “Mycobacteria” for comparative identification

№ штамма Strain number	Мишень Target	Длина, п.н. Lenght	Сходство [NCBI Blastn, Genome DataBase; RefSeq; Mycobacteria (taxid:85007)] Similarity [NCBI Blastn, Genome DataBase; RefSeq; Mycobacteria (taxid:85007)]	Результат по тестам Speed-oligo Speed-oligo test result	Вид, определенный секвенированием Species determined by sequencing
MOT1	16S-ITS-23S	1904	*> 99% (1901/1904) Mycobacterium avium* subsp. hominissuis (36 штаммов)** > 99% (1901/1904) Mycobacterium avium subsp. hominissuis (36 strains)	Mycobacterium avium (MAC)	Mycobacterium avium subsp. hominissuis (MAC)
MOT2	16S-ITS-23S	1900	*> 99% (1898/1899) Mycobacterium gordonae* (8 штаммов)** > 99% (1898/1899) Mycobacterium gordonae (8 штаммов) *> 99% (1891/1899) Mycobacterium paragordonae* (6 штаммов)** > 99% (1891/1899) Mycobacterium paragordonae (6 strains)	*Mycobacterium gordonae*	*Mycobacterium gordonae*
MOT3	16S-ITS-23S	1960	*100% (1960/1960) Mycolicibacterium holsaticum* штамм M7 PROKKA** 100% (1960/1960) Mycolicibacterium holsaticum M7 PROKKA strain *95% (1882/1960) Mycolicibacterium gadium* strain JCM 12688** 95% (1882/1960) Mycolicibacterium gadium strain JCM 12688	Mycobacterium spp.	*Mycolicibacterium holsaticum*
MOT4	16S-ITS-23S	1475	*> 99% (1473/1475) Mycolicibacterium fortuitum* (27 штаммов)** > 99% (1473/1475) Mycolicibacterium fortuitum (27 strains)	*Mycobacterium fortuitum*	*Mycolicibacterium fortuitum*
MOT6	16S-ITS-23S	1909	*> 99% (1907/1909) Mycobacterium paragordonae* (6 штаммов)** > 99% (1907/1909) Mycobacterium paragordonae (6 strains)	*Mycobacterium gordonae*	*Mycobacterium paragordonae*
MOT7	16S-ITS-23S	1920	*> 99% (1918/1920) Mycobacterium avium* subsp. hominissuis (32 штаммов)** > 99% (1918/1920) Mycobacterium avium subsp. hominissuis (32 strains) *> 99% (1918/1920) Mycobacterium bouchedurhonense* штамм DSM 45439** > 99% (1918/1920) Mycobacterium bouchedurhonense strain DSM 45439 *> 99% (1918/1920) Mycobacterium avium* subsp. paratuberculosis (37 штаммов)** > 99% (1918/1920) Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (37 strains)	Mycobacterium avium (MAC)	Mycobacterium avium (MAC)
MOT8	16S-ITS-23S	1917	*> 99% (456/458) Mycobacteroides abscessus* subsp. massiliense (98 штаммов)** > 99% (456/458) Mycobacteroides abscessus subsp. massiliense (98 strains)	*Mycobacterium abscessus*	Mycobacteroides abscessus subsp. massiliense
MOT9	16S-ITS-23S	1551	*> 99% (1550/1551) Mycobacterium mantenii* (6 штаммов)** > 99% (1550/1551) Mycobacterium mantenii (6 strains)	Mycobacterium intracellulare (MAC)	Mycobacterium mantenii (MAC)

Заключение

Предложенная методика ПЦР амплификации фрагмента бактериального оперона, содержащего большую часть гена 16S рРНК, весь ITS и начало гена 23S рРНК, рассматривается нами как апробация методического подхода по исследованию микробных сообществ из материала с высокой степенью деградации (некротических очагов и т. д.). Полученные результаты свидетельствуют о значительно большей разрешающей способности использованного подхода, чем классическое секвенирование гена 16S рРНК. Авторы предполагают, что предложенный подход может получить в дальнейшем широкое распространение при исследовании микробных сообществ как секвенированием по Сэнгеру клонированных образцов, так и с помощью NGS-технологий длинных прочтений, таких как Oxford Nanopore MinION и PacBio.