Секвенирование 16S-ITS-23S фрагмента рибосомального оперона обеспечивает необходимые и достаточные условия для идентификации микобактерий

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Секвенирование гена 16S рРНК является преобладающим методом количественной оценки состава микробных сообществ и молекулярной идентификации отдельных штаммов. При этом технология на основе коротких прочтений (секвенирование 2-го поколения) не позволяет выходить за рамки гена 16S рРНК, а уровень таксономической идентификации образцов обычно остается на уровне рода или даже семейства. В последние годы предлагается использование технологий длинных прочтений (Oxford Nanopore MinION, PacBio) для секвенирования ампликонов почти полного рибосомального оперона, включающего гены 16S, 23S, 5S и межрибосомальный транскрибируемый спейсер (ITS). К настоящему моменту этот подход изучен недостаточно, кроме того предполагает ПЦР-амплификацию весьма протяженного участка ДНК (более 4000 п.н.). Материалы и методы. Сбор штаммов нетуберкулезных микобактерий и их первичная идентификация осуществлена в 2019–2021 гг. Штаммы получены при высеве на среду Левенштейна–Йенсена положительных культур с бактериологического анализатора Bactec MGIT 960, не имеющих антигена MPT64 в иммунохроматографическом тесте MGIT TB Identification Test (Becton Dickinson, США). Предварительная видовая идентификация штаммов осуществлена набором Speed-oligo Mycobacteria (Vircell, Испания) по протоколу производителя. В настоящей работе применяются как известные, так и разработанные вновь, универсальные бактериальные праймеры, фланкирующие почти полный ген 16S рРНК, ITS и начало гена 23S рРНК. Результаты и обсуждение. Секвенированием по Сэнгеру полученных ампликонов (около 2000 п.н.) показан уровень таксономической идентификации, достаточный для определения до вида 8 штаммов нетуберкулезных микобактерий, выделенных от людей, вызвавших клинически и бактериологически подтвержденные заболевания. Предложенная методика ПЦР-амплификации фрагмента бактериального оперона, содержащего большую часть гена 16S рРНК, весь ITS и начало гена 23S рРНК, рассматривается нами как апробация методического подхода по исследованию микробных сообществ из материала с высокой степенью деградации (некротических очагов и т. д.). Полученные результаты свидетельствуют о значительно большей разрешающей способности использованного подхода, чем классическое секвенирование гена 16S рРНК.

Полный текст

Введение

Ген 16S рРНК десятилетиями используется для филогенетической классификации бактерий и архей. В этом отношении ген выделяется своей универсальностью, устойчивостью к горизонтальному переносу генов и высокой степенью сохранности [7, 15]. Высококонсервативные области перемежаются с высоковариабельными, что в ряде случаев позволяет проводить филогенетическую классификацию по видам и более высоким таксономическим уровням. Кроме того, этот ген оказался отличной мишенью для исследований, направленных на количественную оценку таксономического состава микробных сообществ с помощью высокопроизводительного секвенирования ампликонов ПЦР [6]. Праймеры обычно конструируются таким образом, чтобы они гибридизовались с участками консервативных сайтов, фланкирующих вариабельную область, это позволяет извлечь наиболее полную информацию при изучении микробных сообществ. Несмотря на свои многочисленные преимущества, ген 16S рРНК имеет ограниченное количество филогенетически информативных сайтов. Филогенетический анализ на основе гена 16S рРНК чувствителен к стохастической ошибке и демонстрирует разрешение, во многих случаях ограниченное родом микроорганизма [3, 5]. Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК широко используется платформами на основе секвенирования коротких прочтений [4], однако эта технология не позволяет расширить рамки мишени [9]. Для секвенирования ампликонов полного рибосомального оперона в последние годы предлагается использование технологий длинных прочтений, таких как Oxford Nanopore MinION и PacBio [2, 9]. Этот подход позволяет включить в исследование гены 16S, 23S, 5S и межрибосомальный транскрибируемый спейсер (ITS). Область полного рибосомального оперона 16S- ITS-23S имеет в четыре раза больше вариабельности, чем одна только область 16S, и может использоваться для таксономической классификации на уровне вида, а в некоторых случаях на уровне штамма [2]. В настоящее время ведется активная работа по разработке инструментов для анализа результатов NGS микробных сообществ полных рибосомальных оперонов бактерий [10, 12], в том числе в очагах туберкулеза [11]. Существенным недостатком этого подхода является почти предельная для стандартной ПЦР длина ампликона (более 4000 п.н.), что может существенно исказить количественную оценку исследуемых видов при изучении микробных сообществ. Задачей настоящего исследования был дизайн и апробация эубактериальных праймеров для амплификации участка 16S-ITS-23S рибосомального оперона при длине ампликона около 2000 п.н., оптимальной для большинства коммерческих Taq-полимераз.

Материалы и методы

Сбор штаммов нетуберкулезных микобактерий и их первичная идентификация осуществлена в рамках некоммерческого сотрудничества с ОГБУЗ Иркутская Областная Туберкулезная Больница в 2019–2021 гг. Штаммы получены при высеве на среду Левенштейна–Йенсена положительных культур с бактериологического анализатора Bactec MGIT 960, не имеющих антигена MPT64 в иммунохроматографическом тесте MGIT TB Identification Test (Becton Dickinson, США). Предварительная видовая идентификация штаммов осуществлена набором Speed-oligo Mycobacteria (Vircell, Испания) по протоколу производителя. Данный тест предполагает ПЦР амплификацию ДНК фрагментов 16S рРНК и ITS с последующей гибридизацией ампликонов с олигонуклеотидными зондами на хроматографической тест-полоске. Секвенирование по Сэнгеру фрагментов 16S-ITS-23S рРНК проведено на базе ЗАО «Евроген». В работе изначально планировалось использовать 9 культур нетуберкулезных микобактерий (MOT — Mycobacterium other than tuberculosis), однако одна из культур по результатам секвенирования по Сэнгеру была исключена, как смесь нескольких видов микроорганизмов. В дальнейшем исследовались 5 медленнорастущих (MOT1, MOT2, MOT6, MOT7, MOT9) и 3 быстрорастущих штамма микобактерий (MOT3, MOT4, MOT8).

ПЦР в течение 37 циклов выполняли с праймерами 27F и 189R (синтезированы ЗАО «Евроген») в концентрации 500 нмоль каждого с реактивами AmpliTaqGold 360 MasterMix (Applied Biosystems, США) в присутствии 1× раствора энхансера на амплификаторе CFX-96 (BioRad, США). Режим амплификации: 95°С — 10 мин, активация полимеразы; 95°С — 60 с; 55°С — 30 с; 72°С — 120 с. Нами использована структура широко известного эубактериального праймера 27F 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG [13, 14], берущего старт вначале гена 16S рРНК. Праймер 189R 5′-GGGAASTGAAACATCTHAGTA, гибридизующийся в начале гена 23S рРНК, сконструирован с учетом известной вариабельности гена 23S рРНК [8], структура праймера проверена в сервисах SILVA rRNA database (https://www.arb-silva.de) и Blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Секвенирование по Сэнгеру выполнялось в ЦКП «Центр разработки прогрессивных персонализированных технологий здоровья» ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ (г. Иркутск), с использованием праймеров 27F, 189R и внутреннего 800L 5′-AGGATTAGATACCCTGGTAGTC (ген 16S рРНК) [1].

Результаты и обсуждение

Нуклеотидные последовательности фрагментов рибосомального оперона 16S-ITS-23S образцов MOT1, MOT2, MOT3, MOT4, MOT6, MOT7, MOT8, MOT9 размещены в GenBank под номерами MZ823582, MZ851786, MZ851787, MZ851788, MZ851789, MZ851790, MZ851791, MZ851792 соответственно. Как видно из таблицы, в одном случае (MOT3) в рамках предлагаемого подхода определен вид возбудителя, ранее не установленный коммерческим тестом Speed-oligo Mycobacteria (Vircell, Испания). В двух случаях (MOT6 и MOT9) изменена видовая принадлежность штамма. В остальных случаях наблюдалось совпадения результатов коммерческого теста с результатами секвенирования по Сэнгеру, при этом в двух случаях (MOT1 и MOT8) удалось провести идентификацию таксонов до подвида.

 

Таблица. Сравнительная идентификация секвенированием по Сэнгеру и тест-системой Speed-oligo «Mycobacteria»

Table. Sanger sequencing and the Speed-oligo test system of “Mycobacteria” for comparative identification

№ штамма

Strain number

Мишень

Target

Длина, п.н.

Lenght

Сходство [NCBI Blastn, Genome DataBase; RefSeq; Mycobacteria (taxid:85007)]

Similarity [NCBI Blastn, Genome DataBase; RefSeq; Mycobacteria (taxid:85007)]

Результат по тестам Speed-oligo

Speed-oligo test result

Вид, определенный секвенированием

Species determined by sequencing

MOT1

16S-ITS-23S

1904

> 99% (1901/1904) Mycobacterium avium subsp. hominissuis (36 штаммов)

> 99% (1901/1904) Mycobacterium avium subsp. hominissuis (36 strains)

Mycobacterium avium (MAC)

Mycobacterium avium subsp. hominissuis (MAC)

MOT2

16S-ITS-23S

1900

> 99% (1898/1899) Mycobacterium gordonae (8 штаммов)

> 99% (1898/1899) Mycobacterium gordonae (8 штаммов)

> 99% (1891/1899) Mycobacterium paragordonae (6 штаммов)

> 99% (1891/1899) Mycobacterium paragordonae (6 strains)

Mycobacterium gordonae

Mycobacterium gordonae

MOT3

16S-ITS-23S

1960

100% (1960/1960) Mycolicibacterium holsaticum штамм M7 PROKKA

100% (1960/1960) Mycolicibacterium holsaticum M7 PROKKA strain

95% (1882/1960) Mycolicibacterium gadium strain JCM 12688

95% (1882/1960) Mycolicibacterium gadium strain JCM 12688

Mycobacterium spp.

Mycolicibacterium holsaticum

MOT4

16S-ITS-23S

1475

> 99% (1473/1475) Mycolicibacterium fortuitum (27 штаммов)

> 99% (1473/1475) Mycolicibacterium fortuitum (27 strains)

Mycobacterium fortuitum

Mycolicibacterium fortuitum

MOT6

16S-ITS-23S

1909

> 99% (1907/1909) Mycobacterium paragordonae (6 штаммов)

> 99% (1907/1909) Mycobacterium paragordonae (6 strains)

Mycobacterium gordonae

Mycobacterium paragordonae

MOT7

16S-ITS-23S

1920

> 99% (1918/1920) Mycobacterium avium subsp. hominissuis (32 штаммов)

> 99% (1918/1920) Mycobacterium avium subsp. hominissuis (32 strains)

> 99% (1918/1920) Mycobacterium bouchedurhonense штамм DSM 45439

> 99% (1918/1920) Mycobacterium bouchedurhonense strain DSM 45439

> 99% (1918/1920) Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (37 штаммов)

> 99% (1918/1920) Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (37 strains)

Mycobacterium avium (MAC)

Mycobacterium avium (MAC)

MOT8

16S-ITS-23S

1917

> 99% (456/458) Mycobacteroides abscessus subsp. massiliense (98 штаммов)

> 99% (456/458) Mycobacteroides abscessus subsp. massiliense (98 strains)

Mycobacterium abscessus

Mycobacteroides abscessus subsp. massiliense

MOT9

16S-ITS-23S

1551

> 99% (1550/1551) Mycobacterium mantenii (6 штаммов)

> 99% (1550/1551) Mycobacterium mantenii (6 strains)

Mycobacterium intracellulare (MAC)

Mycobacterium mantenii (MAC)

 

Заключение

Предложенная методика ПЦР амплификации фрагмента бактериального оперона, содержащего большую часть гена 16S рРНК, весь ITS и начало гена 23S рРНК, рассматривается нами как апробация методического подхода по исследованию микробных сообществ из материала с высокой степенью деградации (некротических очагов и т. д.). Полученные результаты свидетельствуют о значительно большей разрешающей способности использованного подхода, чем классическое секвенирование гена 16S рРНК. Авторы предполагают, что предложенный подход может получить в дальнейшем широкое распространение при исследовании микробных сообществ как секвенированием по Сэнгеру клонированных образцов, так и с помощью NGS-технологий длинных прочтений, таких как Oxford Nanopore MinION и PacBio.

×

Об авторах

О. Б. Огарков

ФГБНУ Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека

Автор, ответственный за переписку.
Email: obogarkov@mail.ru

д.м.н., главный научный сотрудник, зав. отделом эпидемиологии и микробиологии

Россия, Иркутск

С. Ни. Жданова

ФГБНУ Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека

Email: svetnii@mail.ru

д.м.н., ведущий научный сотрудник отдела эпидемиологии и микробиологии

Россия, Иркутск

Е. А. Орлова

ФГБНУ Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека

Email: elizaveta.a.orlova@gmail.com

младший научный сотрудник отдела эпидемиологии и микробиологии

Россия, Иркутск

П. А. Хромова

ФГБНУ Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека

Email: polina.and38@gmail.com

младший научный сотрудник отдела эпидемиологии и микробиологии

Россия, Иркутск

Н. Л. Белькова

ФГБНУ Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека

Email: nlbelkova@gmail.com

к.б.н., старший научный сотрудник отдела эпидемиологии и микробиологии

Россия, Иркутск

В. В. Синьков

ФГБНУ Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека

Email: vsinkov@gmail.com

к.м.н., старший научный сотрудник отдела эпидемиологии и микробиологии

Россия, Иркутск

И. Г. Кондратов

ФГБНУ Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека

Email: kondratovig@mail.ru

к.б.н., научный сотрудник отдела эпидемиологии и микробиологии

Россия, Иркутск

Список литературы

  1. Bel’kova N.L., Parfenova V.V., Kostornova T.Ya., Denisova L.Ya., Zaichikov E.F. Microbial biodiversity in the water of lake Baikal. Microbiology, 2003, vol. 72, pp. 203–213. doi: 10.1023/A:1023224215929
  2. Benítez-Páez A., Sanz Y. Multi-locus and long amplicon sequencing approach to study microbial diversity at species level using the MinION™ portable nanopore sequencer. Gigascience, 2017, vol. 6, no. 7, pp. 1–12. doi: 10.1093/gigascience/gix043
  3. Brown J.R., Douady C.J., Italia M.J., Marshall W.E., Stanhope M.J. Universal trees based on large combined protein sequence data sets. Nat. Genet., 2001, vol. 28, no. 3, pp. 281–285. doi: 10.1038/90129
  4. Burke C.M., Darling A.E. A method for high precision sequencing of near full-length 16S rRNA genes on an Illumina MiSeq. Peer J., 2016, vol. 4: e2492. doi: 10.7717/peerj.2492
  5. Delsuc F., Brinkmann H., Philippe H. Phylogenomics and the reconstruction of the tree of life. Nat. Rev. Genet., 2005, vol. 6, no. 5, pp. 361–375. doi: 10.1038/nrg1603
  6. Doolittle W.F. Phylogenetic classification and the universal tree. Science, 1999, vol. 284, no. 5423, pp. 2124–2129. doi: 10.1126/science.284.5423.2124
  7. Green R., Noller H.F. Ribosomes and translation. Annu. Rev. Biochem., 1997, vol. 66, pp. 679–716. doi: 10.1146/annurev.biochem.66.1.679
  8. Hunt D.E., Klepac-Ceraj V., Acinas S.G., Gautier C., Bertilsson S., Polz M.F. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol., 2006, vol. 72, no. 3, pp. 2221–2225.
  9. Martijn J., Lind A.E., Schön M.E., Spiertz I., Juzokaite L., Bunikis I., Pettersson O.V., Ettema T.J.G. Confident phylogenetic identification of uncultured prokaryotes through long read amplicon sequencing of the 16S-ITS-23S rRNA operon. Environ. Microbiol., 2019, vol. 21, no. 7, pp. 2485–2498. doi: 10.1111/1462-2920.14636
  10. Milani C., Alessandri G., Mangifesta M., Mancabelli L., Lugli G.A., Fontana F., Longhi G., Anzalone R., Viappiani A., Duranti S., Turroni F., Costi R., Annicchiarico A., Morini A., Sarli L., Ossiprandi M.C., van Sinderen D., Ventura M. Untangling species-level composition of complex bacterial communities through a novel metagenomic approach. mSystems, 2020, vol. 5, no. 4: e00404-20. doi: 10.1128/msystems.00404-20
  11. Orlova E.A., Ogarkov O.B., Suzdalnitskiy A.E., Khromova P.A., Sinkov V.V., Plotnikov A.O., Belkova N.L., Zhdanova S.N. Analysis of microbial diversity in caseous necrosis of tuberculosis foci. Mol. Genet. Microbiol. Virol., 2021, vol. 36, pp. 132–138. doi: 10.3103/S0891416821030058
  12. Peker N., Garcia-Croes S., Dijkhuizen B., Wiersma H.H., van Zanten E., Wisselink G., Friedrich A.W., Kooistra-Smid M., Sinha B., Rossen J.W.A., Couto N. A comparison of three different bioinformatics analyses of the 16S-23S rRNA encoding region for bacterial identification. Front. Microbiol., 2019, vol. 10: 620. doi: 10.3389/fmicb.2019.00620
  13. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol., 1991, vol. 173, no. 2, pp. 697–703. doi: 10.1128/jb.173.2.697-703.1991
  14. Wilson K.H., Blitchington R.B., Greene R.C. Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 1990, vol. 28, no. 9, pp. 1942–1946. doi: 10.1128/jcm.28.9.1942-1946.1990
  15. Woese C.R. Bacterial evolution. Microbiol. Rev., 1987, vol. 51, pp. 221–271. doi: 10.1128/mr.51.2.221-271.1987

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Огарков О.Б., Жданова С.Н., Орлова Е.А., Хромова П.А., Белькова Н.Л., Синьков В.В., Кондратов И.Г., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах