Оценка содержания фрагментов внеклеточной ДНК в крови реконвалесцентов с постковидным синдромом методом проточной цитофлуориметрии

Полный текст

Введение

Постковидный синдром (ПКС, альтернативно: post-COVID-19 syndrome, chronic COVID syndrome, long COVID) — состояние постоянного или перманентного наличия симптомов патологического процесса вслед за перенесенной инфекцией, вызванной возбудителем SARS-CoV-2. Являясь мультисистемным расстройством, ПКС ассоциируется с множеством клинических проявлений, включая сердечную и дыхательную дисфункцию, нейропсихиатрические нарушения и гиперкоагуляцию. Всемирная организация здравоохранения характеризует его как «присутствие признаков и симптомов, развивающихся во время или после инфекции COVID-19, сохраняющихся более 4 недель и не имеющих объяснения наличием каких-либо других диагнозов» [3, 15].

Патофизиологические механизмы, лежащие в основе ПКС, недостаточно изучены [15]. Опираясь на современные представления о ключевой роли ДНК-сетей нейтрофильных внеклеточных ловушек (Neutrophil Extracellular Traps — NETs) в патогенезе COVID-19 и развитии у людей системных хронических аутоиммунных заболеваний [12], большинство исследователей объясняет остаточные воспалительные симптомы и осложнения, регистрируемые при ПКС, длительным сохранением дисбаланса процессов образования и удаления NETs после перенесенного COVID-19 [13, 15]. Такой дисбаланс, индуцируемый SARS-CoV-2 в острый период новой коронавирусной инфекции, приводит к многократному повышению концентрации в плазме крови фрагментов внеклеточной (вкДНК) [10], которые, обладая выраженным провоспалительным потенциалом [8], активируют коагуляцию и стимулируют образование тромбов в сосудистом русле [12].

С помощью длительных и трудоемких методов детекции, базирующихся на выделении вкДНК из плазмы и последующем количественном ПЦР-анализе, в настоящее время установлено, что при нетозе и некрозе из погибших клеток высвобождаются крупные фрагменты ДНК более 10 000 пар нуклеотидов, которые в 100 раз больше фрагментов, секретируемых в плазму крови при апоптозе [7, 14]. Было установлено, что содержание вкДНК в крови пациентов с тяжелой формой течения COVID-19 в 7 раз превышает среднее значение данного показателя у доноров без коронавирусной инфекции [8]. Однако пока не ясно, в какой степени и как долго эти различия сохраняются у пациентов в период реконвалесценции. Такие исследования не проводились. Возможно, по той причине, что все методы, основанные на экстракции молекулы ДНК из плазмы, требуют большого количества крови для одного анализа (не менее 2–5 мл), дают большой разброс результатов и, как следствие, в клинической медицине пока широко не используются [7]. Выявление нитей ДНК нейтрофильных ловушек, присутствующих в плазме крови пациентов с ПКС, методом люминесцентной микроскопии [4] не обеспечивает объективной оценки результатов.

Целью настоящей работы была разработка метода (технологии) детекции внеклеточной ДНК и оценка ее уровня содержания в крови лиц с постковидным синдромом.

Материалы и методы

Оценку содержания фрагментов вкДНК и иммунофенотипирование лейкоцитов в крови больных COVID-19, реконвалесцентов и условно здоровых добровольцев проводили в период первой волны эпидемии COVID-19 (август — октябрь 2020 г.) среди жителей г. Саратова и Саратовской области. Клинический материал (кровь) поступал на анализ в пробирках с гепарином из профильных учреждений г. Саратова и г. Энгельса в течение 3 ч после взятия. Исследование проводили на основании письменного согласия пациентов в рамках плановой научной тематики учреждения, одобренной локальным этическим комитетом ФКУН Российский противочумный институт «Микроб».

Кровь реконвалесцентов, перенесших тяжелую форму COVID-19 (опытная группа, n = 8, возраст от 53 до 64 лет), исследовали в период от 1 до 3 месяцев после завершения процесса лечения в стационаре. Наличие у обследуемых ПКС устанавливали при опросе по жалобам на один или несколько характерных симптомов этого синдрома [3], таких как слабость, одышка, быстрая утомляемость, нарушение сна, обострение имеющихся хронических заболеваний, появление головных, мышечных, суставных или позвоночных болей. Положительным контролем (I группа сравнения, n = 5, возраст от 48 до 67 лет) высокого уровня содержания вкДНК служили результаты анализа крови пациентов отделения реанимации с нарушениями дыхательной функции легких и изменениями состояния сердечно-сосудистой системы, соответствующими по общепринятой клинической классификации тяжелой форме течения COVID-19 [5]. В качестве отрицательного контроля исследовали кровь лиц без перенесенной коронавирусной инфекции, добровольно присоединившихся к исследованию после подписания информированного согласия. Таких доноров делили по возрасту на две группы: от 18 до 30 лет (II группа сравнения, n = 12) и старше 60 лет (III группа сравнения, n = 10).

Иммунофенотипирование лейкоцитов проводили в микрообъемах цельной крови с помощью стандартной процедуры Lyse/No-Wash (BD Bioscience), исключающей потерю клеток и клеточного дебриса при окраске образцов флуоресцирующими реагентами [16]. Для определения относительного содержания в крови фрагментов вкДНК был разработан способ проточно-цитофлуориметрического анализа, основанный на добавлении к 50 мкл цельной крови 10 мкл раствора йодистого пропидия (IP) c концентрацией 100 мкг/мл фосфатно-солевого буфера (рН 7,4) совместно с 10 мкл реагента CD45-FITC, используемого при иммунофенотипировании лейкоцитов крови по Lyse/No-Wash протоколу для автоматического дифференцирования неповрежденных клеток от клеточного дебриса [6].

Для измерения в потоке интенсивности светорассеяния, иммунофлюоресценции и ДНК-флуоресценции больших статистических выборок отдельных лейкоцитов и продуктов клеточного распада использовали проточный цитофлуориметр «DakoCytomation» (Дания) с программным обеспечением «Summit v.4.3 Built 2445».

Полученные данные статистически обрабатывали с использованием стандартного пакета программ «Microsoft Office Excel 2016», «Statistica 10.0» (StatSoft Inc.), представляя их в виде медианы (Me) и квартильных отклонений (Q25–Q75) с расчетом достоверности различий в исследуемых группах с использованием U-критерия Манна–Уитни. Значение р < 0,05 считали статистически значимым.

Результаты и обсуждение

Использованный в настоящей работе цитофлуориметрический способ детекции вкДНК был разработан благодаря экспериментально установленной нами способности лизирующего эритроциты реагента (BD FACS Lysing Solution), содержащего 3% диэтиленгликоль, 1% формальдегид и 0,35% метанол, повышать проницаемость цитоплазматических мембран лейкоцитов крови для молекул IP. При попадании в кровь IP окрашивал фрагменты вкДНК в плазме, а после добавления в образец крови лизирующего эритроциты и фиксирующего лейкоциты реагента проникал внутрь клеток, где окрашивал ядерную ДНК. При высокой разрешающей способности процесса измерения интенсивности ДНК-флуоресценции в логарифмическом режиме, метод проточной цитометрии позволял получать информацию как о присутствии (или отсутствии) в крови фрагментов вкДНК, так и об относительном содержании в образце крови неповрежденных диплоидных лейкоцитов, имеющих нормальное состояние ядерного хроматина. Поэтому мы учитывали результат анализа в виде доли, которую более слабые импульсы ДНК-флуоресценции, регистрируемые от фрагментов вкДНК, составляли от общего числа поступающих на анализ сигналов ДНК-флуоресценции. Результат выражали в процентах.

На рисунке представлены характерные ДНК-гистограммы (А1, В1, С1 и D1), наглядно иллюстрирующие степень различий по относительному содержанию фрагментов вкДНК в образцах крови лиц 4-х обследуемых нами групп. Слева от ДНК-гистограмм на рисунке представлены соответствующие им цитограммы (А, B, C и D), отражающие индивидуальный характер распределения в образцах крови отдельных лейкоцитов и продуктов клеточного распада по уровню экспрессии общего лейкоцитарного антигена CD45 и интенсивности бокового светорассеяния (степени гранулярности, SS). Цитограммы позволяли определять содержание в образцах крови клеточного дебриса («мусора»), включающего высвобождаемые из погибших клеток фрагменты вкДНК. Так, в образце сравнения — кровь пожилой женщины (группа III, 63 года, результат анализа В, В1) содержание дебриса и фрагментов вкДНК было более высоким, чем в крови молодой женщины (группа II, 24 года, результат А, А1). Однако пожилой пациент с тяжелой формой течения COVID-19 (группа I, 67 лет, С, С1) очень сильно отличался по исследуемому параметру от доноров II и III групп. В его крови было в 5,3 раза больше фрагментов вкДНК (68,8%), чем в крови донора III группы (13%). У пациента с ПКС (опытная группа, 59 лет, D, D1) фрагментов вкДНК в крови было вдвое меньше (34,3%), чем у больного с острой формой инфекции (68,8%), но в 2,6 раза больше, чем у условно здорового донора III группы (13%).

 

Рисунок. Результат сравнительного анализа четырех образцов крови с различным содержанием клеточного дебриса и фрагментов внеклеточной ДНК в плазме

Figure. Result of comparative analysis of four blood samples with different content of cellular debris and extracellular DNA fragments in plasma

Примечание. ДНК-гистограммы А1, В1, С1 и D1 с цитограммами А, В, С и D соответствуют образцам крови из групп II, III, I и опытной группы. Три популяции клеток в регионе R1 на цитограммах — это неповрежденные лимфоциты, моноциты и гранулоциты. За пределами региона R1 учитывался клеточный дебрис, доля которого в пробах определялась как Total — R1 и равнялась для А, В, С и D соответственно 3,17%, 28,5%, 62,7% и 30,3%. Сигналы ДНК-флуоресценции от фрагментов внеклеточной ДНК учитывались на ДНК-гистограммах в регионе R4. Значение показателя для групп I, II, III и опытной группы 68,8%, 2,5%, 13% и 34,3% соответственно.

Note. DNA histograms A1, B1, C1 and D1 with cytograms A, B, C and D correspond to blood samples from groups II, III, I and the experimental group. Three cell populations in the R1 region on the cytograms are intact lymphocytes, monocytes and granulocytes. Outside the R1 region, cellular debris was taken into account, the proportion of which in the samples was defined as Total — R1 and was equal to 3.17%, 28.5%, 62.7% and 30.3% for A, B, C and D, respectively. DNA fluorescence signals from cell-free DNA fragments were taken into account on DNA histograms in the R4 region. The value of the indicator for groups I, II, III and the experimental group was 68.8%, 2.5%, 13% and 34.3%, respectively.

 

В таблице приведены результаты статистической обработки полученных в работе экспериментальных данных, которые согласуются с зарубежными исследованиями, выполненными ранее с использованием длительных традиционных методов детекции в крови вкДНК. Во-первых, они подтверждают, что при отсутствии коронавирусной инфекции повышенная концентрация циркулирующей в кровяном русле вкДНК является биомаркером старения организма на клеточном уровне [11], связанным с феноменом воспалительного старения («inflammaging») как основой возраст-ассоциированной патологии [1]. Во-вторых, наши данные подтверждают установленный факт многократного повышения концентрации вкДНК в крови человека при угрожающих жизни критических состояниях (сепсисе, обширных травмах, сосудистых катастрофах и др.) [7]. В данном случае, при тяжелой форме течения COVID-19, при которой своевременное определение чрезмерно высокого уровня содержания вкДНК в плазме позволяет своевременно корректировать терапию, что способствует повышению вероятности благоприятного исхода болезни [10]. Характеристика уровня вкДНК крайне важна в аспекте испытания и применения новых современных методов лечения COVID-19, основанных на удалении вкДНК из периферической крови (терапевтический плазмообмен) [2] и на расщеплении вкДНК-сетей NETs рекомбинантной нуклеазой (препаратом дорназа альфа) [13, 15].

 

Таблица. Относительное содержание фрагментов внеклеточной ДНК в крови лиц четырех обследуемых групп

Table. Relative content of extracellular DNA fragments in the blood of individuals in four examined groups

Группы Grups	Содержание фрагментов ДНК, Me(Q25–Q75) в % DNA fragments content, Me(Q25–Q75), %
Опытная Experimental	40,5 (27,4–52,0)
Сравнения Comparison I	82,4 (68,0–88,6)*
Cравнения Comparison II	3,2 (2,0–5,6)*
Сравнения Comparison III	13,4 (10,1–18,6)*

Примечание. * — достоверные различия с опытной группой (p < 0,05).

Note. * — significant differences with the experimental group (p < 0.05).

 

Учитывая важность оценки исследуемого в работе показателя с точки зрения обоснования прогноза и своевременной персонализации лечения коронавирусной инфекции [9, 10, 14], результаты применения быстрого цитофлуориметрического способа детекции вкДНК в микрообъемах цельной крови, равных объемам пальцевой крови пациентов, могут в перспективе иметь определенный диагностический, прогностический и терапевтический потенциал, в том числе, видимо, и при обследовании пациентов с ПКС, в крови которых нами впервые было зарегистрировано методом проточной цитофлуориметрии существенно повышенное в сравнении с показателями для условно здоровых доноров содержание фрагментов вкДНК.

Дальнейшие исследования механизмов образования и выведения вкДНК позволят найти ответ на вопросы, каким образом нетоз может запускать развитие ПКС в организме выживших при COVID-19 пациентов и как в этом процессе участвуют аутоантитела (антинуклеарные, антигистоновые и антинейтрофильные цитоплазматические антитела) к входящим в состав NETs продуктам распада нейтрофилов, которые присутствуют в крови всех реконвалесцентов, переболевших тяжелой формой COVID-19 [13, 15]. Разработанный нами метод (технология) может способствовать накоплению достоверных данных по оценке уровня содержания вкДНК в крови при различных патологических состояниях.

Заключение

Cогласно полученным данным, определение вкДНК по разработанной методике (технологии) позволяет характеризовать тяжесть течения COVID-19 и оценить компенсаторные возможности организма в посковидном периоде.

Об авторах

Александр Леонидович Кравцов

ФКУН Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: kravzov195723@gmail.com

ведущий научный сотрудник отдела иммунологии

Россия, Саратов

Светлана Николаевна Клюева

ФКУН Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: klyueva.cvetlana@mail.ru

к.б.н., научный сотрудник отдела иммунологии

Россия, Саратов

Виталий Александрович Кожевников

ФКУН Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@microbe.ru

младший научный сотрудник отдела иммунологии

Россия, Саратов

Светлана Александровна Бугоркова

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, Саратов, Россия

Email: rusrapi@microbe.ru

д.м.н., главный научный сотрудник отдела иммунологии

Россия, Саратов

Список литературы

Дополнительные файлы