Продукция провоспалительных цитокинов в ответ на стимуляцию адгезирующихся клеток донорской крови растворимым ЛПС и фагоцитируемыми бактериями

Полный текст

Введение

Система врожденного иммунитета распознает присутствие патогенных микроорганизмов посредством широкого набора рецепторов, каждый из которых активируется определенным классом микробных молекул [3]. Структурные мотивы, характерные для микробных молекул, распознаваемых рецепторами врожденного иммунитета, называют патоген-ассоциированными молекулярными структурами (ПАМС) (от английского термина «pathogen-associated molecular patterns»). Рецепторы врожденного иммунитета разделяют на две группы на основании их локализации. Рецепторы, располагающиеся на плазматической мембране клетки, а также на мембранах эндосом, образуют первую группу. Эта группа включает в себя семейства Toll-подобных рецепторов (TLR) и лектиновых рецепторов С-типа. Рецепторы этих семейств активируются ПАМС, располагающимися во внеклеточном пространстве, а также эндосомально располагающимися нуклеиновыми кислотами бактериального или вирусного происхождения [5]. Вторая группа микробных сенсоров образована цитоплазматическими рецепторами различных белковых семейств и включает в себя NOD-подобные рецепторы (NLRs), RIG-I-подобные рецепторы (RLRs), цитозольный ДНК-сенсор cGAS, а также рецептор Aim2 (absent in melanoma 2) [8]. Основная функция рецепторов цитоплазматической группы заключается в обнаружении ПАМС в цитозоле клеток. RLRs активируются вирусными нуклеиновыми кислотами, Aim2 активируется бактериальной и вирусной ДНК [8]. Эффекторные механизмы, запускаемые цитоплазматическими рецепторами, разнообразны и включают в себя активацию противовирусного иммунитета посредством активации продукции интерферонов, протеолитическое созревание интерлейкинов IL-1 и IL-18 в их зрелые, секретируемые формы, индукцию различных форм программируемой клеточной смерти посредством активации каспаз, а также другие, более специализированные функции [1, 5]. Некоторые NLRs, например NOD1 и NOD2, выполняют функции аналогичные функциям TLRs, так как эти рецепторы активируют транскрипционные факторы семейства NF-kB и митоген-активируемые протеин киназы (МАПК), тем самым индуцируя продукцию цитокинов клеткой-хозяином [1]. NOD1 и NOD2 распознают молекулярные мотивы пептидогликанов клеточной стенки как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, играя важную роль в формировании иммунного ответа на оба эти класса бактериальных патогенов [1]. Пептидогликаны не являются единственным классом ПАМС, способных активировать NOD1 и NOD2, эти рецепторы также могут активироваться бактериальными эффекторами белковой природы, а также эндогенными молекулами [6]. NOD1 и NOD2 присутствуют в клетках различных типов [10], в частности, NOD2 особенно обильно экспрессируется моноцитами периферической крови [9].

Цитоплазматические рецепторы врожденной иммунной системы играют важную роль в распознавании патогенных вирусов и бактерий, репликационный цикл которых протекает в цитоплазме эукариотических клеток [8]. Кроме того, цитоплазматические сенсоры патогенов важны и для распознавания бактерий, не способных к выходу из фагосом, но в значительной мере элиминирующихся посредством фагоцитоза [1, 15]. Механизмы, посредством которых ПАМС фагоцитируемых бактерий попадают из фагосом в цитоплазму, остаются предметом изучения. В литературе рассматривается как простая трансмембранная утечка ПАМС из фагосом, так и участие бактериальных транспортных систем в таком переносе [1]. В настоящее время распространено представление о кооперативности участия мембранных и цитоплазматических рецепторов в формировании иммунного ответа на фагоцитируемые бактерии [15], а также растет понимание различий в последствиях активации клеток иммунной системы растворимыми ПАМС и корпускулярными, фагоцитируемыми бактериями [2].

Передача сигнала активированными Toll-подобными рецепторами происходит за счет белок-белковых взаимодействий, осуществляемых TIR-доменами, присутствующими как во всех TLRs, так и в адаптерных белках, рекрутируемых к TLRs при активации [5, 14]. Блокировка взаимодействий TIR-доменов пептидами, происходящими из сайтов, осуществляющих сигнал-зависимые белковые взаимодействия, является эффективной стратегией разработки ингибиторов TLR [11, 12]. Пептид, соответствующий третьему спиральному участку TIR-домена TLR5 и синтезированный вместе с пептидным вектором, обеспечивающим проникновение всей конструкции в клетку (пептид 5R667), является мультиспецифичным ингибитором TLR, способным ингибировать TLR5, TLR4, TLR2, и TLR9, но не TLR7 или TLR8 [4].

В настоящем исследовании было изучено влияние пептида 5R667 на фагоцитарную способность гранулоцитов и моноцитов периферической крови доноров. Сравнивали лейкоцитарную продукцию цитокинов, индуцированную высокоочищенным ЛПС, с таковой, индуцированной фагоцитируемыми, фиксированными грамотрицательными бактериями, а также эффекты TLR-блокирующего пептида на продукцию цитокинов при стимуляции как ЛПС, так и фагоцитируемыми бактериями. Полученные результаты указывают на существенные различия в механизмах реакции лейкоцитов на ЛПС и на фагоцитируемые бактерии, что выявляет неполноту моделирования ответа иммунной системы на бактериальные инфекции исключительно высокоочищенными TLR-агонистами.

Материалы и методы

Получение проб донорской крови. Забор образцов периферической крови производился с помощью системы для вакуумного взятия венозной крови условно здоровых добровольцев в гепаринизированные пробирки вакутейнеры (Химмедснаб, Россия) в медпункте Университета «Сириус» квалифицированным персоналом. Непосредственно после забора производился цитологический анализ крови на гемоцитометре «Celltac MEK-7300K» (Nihon Kohden, Япония).

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов. Для определения фагоцитарной активности лейкоцитов к 100 мкл цельной крови, контрольной или предобработанной пептидом 5R667 в конечной концентрации 10, 20 или 40 мкМ в течение 30 мин, добавляли фиксированные, конъюгированные с флуоресцеином (FITC) бактерии E. coli (штамм DH5a) в соотношении лейкоциты:бактерии 1:20. Фиксированные и конъюгированные бактерии были приготовлены согласно ранее опубликованной методике [7]. После добавления бактерий аликвоты крови инкубировали в течение часа в атмосфере 5% СО₂ при 37°С. По окончании инкубации эритроциты лизировали BD Pharm Lyse буфером по протоколу производителя (BD Biosciences, США). Анализ на фагоцитарную активность лейкоцитов проводили на проточном цитофлуориметре BD LSRFortessa как описано ранее [7].

Определение продукции провоспалительных цитокинов. Образцы крови распределяли по 250 мкл на лунку в 48-луночные культуральные планшеты (NEST, Китай) и инкубировали в течение 2 ч в атмосфере 5% СО₂ при 37°С. По окончании инкубации кровь аспирировали, и адгезировавшиеся клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером. После промывки добавляли культуральную среду RPMI 1640, содержащую 10% телячьей сыворотки, глютамин и HEPES. Блокирующий пептид 5R667, имеющий последовательность -RQIKIWFQNRRMKWKKWCLEAFSYAQGR-, добавлялся в культуральную среду в концентрации 10 или 20 мкМ [4] (Genscript, США). После 30-минутной инкубации в присутствии пептида, стимулировали продукцию цитокинов либо очищенным E. coli ЛПС (100 нг/мл) (Sigma-Aldrich, США), либо фиксированными бактериями, добавленными в соотношении лейкоциты:бактерии 1:20. Клеточные супернатанты собирали через 22 ч после стимуляции, очищали центрифугированием и замораживали. Анализ содержания TNF и IFNg в супернатантах проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) при помощи наборов компании «Вектор-Бест» (Россия). Содержание IL-6 анализировалось при помощи ИФА наборов компании «BioLegend» (США).

Статистический анализ. Статистическую достоверность различий средних оценивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Целью первой серии экспериментов было определение влияния TLR-блокирующего пептида 5R667 на фагоцитоз бактерий лейкоцитами периферической крови. Для этого к образцам крови здоровых доноров добавлялся 5R667 до конечной концентрации 40, 20, 10, или 0 мкМ, и пробы инкубировались в течение 30 мин в СО₂-инкубаторе. Затем добавлялись меченные флуоресцеином бактерии в количестве ~20 бактерий на лейкоцит. Фагоцитарная способность лейкоцитов оценивалась методом проточной цитометрии отдельно для популяций моно- и гранулоцитов, выделяемых по размеру и гранулярности клеток (рис. 1А). Фагоцитарная активность оценивалась по интенсивности флуоресценции клеток в канале FITC (рис. 1А).

 

Рисунок 1. Влияние TLR-блокирующего пептида 5R667 на фагоцитоз бактерий E. coli моноцитами и гранулоцитами периферической крови. Примечание. (A) Cтратегия гейтирования популяций лейкоцитов периферической крови. Популяции гранулоцитов и моноцитов выделяли среди одиночных клеток (singlets) по размеру и гранулярности клеток. Фагоцитирующие клетки характеризовались наличием флуоресценции в канале FITC в связи с добавлением меченных FITC бактерий, как показано на правых панелях рисунка. (Б) Пептид 5R667 не вызывает значимых изменений фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови. Цельную гепаринизированную кровь инкубировали в присутствии различных концентраций пептида 5R667 в течении 30 мин, после чего добавляли меченные флуоресцеином бактерии. Долю фагоцитирующих клеток оценивали методом проточной цитометрии через 1 ч после добавления бактерий. Статистический анализ выполнен с помощью U-критерия Манна–Уитни.

 

Анализ полученных данных показал, что инкубация крови с проникающим в клетки пептидом не вызывала значимых изменений фагоцитарной способности лейкоцитов периферической крови (рис. 1В). В случае добавления 40 μM пептида можно было отметить тенденцию к некоторому снижению фагоцитарной активности моноцитов. Такой тенденции, однако, не наблюдалось в популяции гранулоцитов (рис. 1В). Отсутствие значимого эффекта пептида на фагоцитарную активность лейкоцитов крови также подтверждалось визуальным анализом поглощения FITC-меченных E. coli адгезированными на пластик лейкоцитами методом флуоресцентной микроскопии (не показано). Результаты, представленные на рис. 1, показывают, что обработка лейкоцитов TLR-блокирующим пептидом не отражается существенным образом на их фагоцитарной активности.

В следующей серии экспериментов сравнивали лейкоцитарный цитокиновый ответ, индуцированный растворимым ЛПС, с ответом, индуцированным корпускулярными фагоцитируемыми бактериями. Оценивалось содержание TNF, IL-6 и IFNg в супернатантах, собранных через 22 ч после стимуляции лейкоцитов бактериальными продуктами. Стимуляция лейкоцитов как ЛПС, так и цельными бактериями активировала продукцию цитокинов сходным образом (рис. 2). Следует отметить, однако, что ни ЛПС, ни цельные бактерии не вызывали продукции IFNg (не показано). Это наблюдение указывает на отличие спектра цитокинов, продуцируемых адгезирующимися клетками крови от такового, продуцируемого перитониальными макрофагами. Так, ранее сообщалось, что стимуляция первичной культуры перитониальных макрофагов ЛПС вызывает TLR4-зависимую, MyD88-независимую активацию продукции IFNg [13]. Эти различия могут быть объяснены сниженной экспрессией компонентов TRIF-зависимого сигнального пути адгезирующимися лейкоцитами периферической крови.

 

Рисунок 2. Продукция провоспалительных цитокинов адгезирующимися лейкоцитами крови человека при стимуляции растворимым ЛПС и фагоцитируемыми бактериями. Примечание. Адгезировавшиеся к пластику клетки крови отмывали от эритроцитов, преинкубировали с различными концентрациями пептида 5R667 в течение 30 мин и стимулировали либо высокоочищенным, растворимым ЛПС в дозе 100 нг/мл, либо фиксированными бактериями в количестве ~20 бактерий на лейкоцит. Супернатанты для измерения содержания цитокинов собирали через 22 ч после стимуляции клеток. (A) Продукция TNF. (Б) Продукция IL-6. Статистический анализ выполнялся методом однофакторного дисперсионного анализа. * — p < 0.05. Проанализированы пробы крови, полученные от 12 доноров.

 

Установив, что корпускулярные фагоцитируемые бактерии вызывают продукцию провоспалительных цитокинов, количественно сравнимую с продукцией, вызываемой растворимым ЛПС, было оценено влияние мультиспецифического ингибитора TLRs пептида 5R667 на индуцированную продукцию TNF и IL-6. Эксперименты показали значительные различия в чувствительности цитокиновой продукции к ингибированию TLRs. Пептид 5R667 вызывал значительное, статистически достоверное снижение продукции обоих цитокинов, индуцированной растворимым ЛПС, но не влиял на продукцию, индуцированную корпускулярными бактериями (рис. 2). Данные, представленные на рис. 2, также подтверждают ранее сделанный вывод о вероятном отсутствии видовой специфичности ингибиторного действия пептида 5R667 [4], что подтверждается эффективным блокированием пептидом ЛПС-индуцированной продукции цитокинов в лейкоцитах человека (рис. 2).

Отсутствие эффекта пептида на продукцию цитокинов не может быть объяснено участием дополнительных TLRs при стимуляции бактериальными частицами, содержащими ПАМС различных классов, поскольку пептид 5R667 ингибирует множественные TLRs [4]. Так, помимо TLR4, активируемого ЛПС грамотрицательных бактерий, 5R667 ингибировал TLRs, активируемые и другими ПАМС грамотрицательных бактерий: TLR5, агонистом которого является флагеллин (белок, формирующий бактериальные жгутики); а также TLR9, активируемый бактериальной, неметилированной ДНК [4]. Несмотря на то что TLR7 не ингибировался пептидом 5R667, вклад TLR7 и TLR8 в индукцию продукции цитокинов бактериями можно исключить на основании того, что эти рецепторы активируются вирусной одноцепочечной РНК, а не бактериальными ПАМС [5]. Наиболее вероятными индукторами, ответственными за TLR-независимую продукцию провоспалительных цитокинов, являются члены семейства NOD-подобных рецепторов — NOD1 и NOD2. Эти рецепторы активируются различными фрагментами пептидогликанов, присутствующих в бактериальной стенке как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий [6]. Оба рецептора активируют транскрипционные факторы, стимулирующие транскрипцию провоспалительных цитокинов (транскрипционные факторы семейства NF-kB, а также МАПК)) [1]. Эти рецепторы экспрессируются лейкоцитами периферической крови, в частности NOD2 обильно экспрессируется в моноцитах [9].

Заключение

Настоящее исследование выявило существенные различия механизмов индукции цитокинов растворимым очищенным ЛПС и корпускулярными бактериями. Эти различия обусловлены не только более широким спектром ПАМС, активирующих дополнительные TLR рецепторы при стимуляции цельными бактериями, но и задействованием цитоплазматических рецепторов, предположительно NOD1 и NOD2, распознающих бактериальное присутствие, за счет интернализации бактериальных продуктов посредством фагоцитоза. Наше исследование также указывает на неполноту моделирования бактериальных инфекций с использованием растворимого ЛПС (или иных высокоочищенных бактериальных продуктов). Использование корпускулярных, содержащих ПАМС фагоцитируемых частиц, таких как фиксированные бактерии, может повысить корректность моделирования иммунного ответа на бактериальные инфекции. В будущем мы планируем более детально изучить механизмы активации продукции цитокинов цельными бактериями, а также использовать фиксированные бактерии в экспериментальном моделировании иммунного ответа на бактериальные инфекции.

Благодарности

Авторы благодарят сотрудников ресурсного центра клеточных технологий и иммунологии, лабораторного комплекса НТУ «Сириус» за предоставление оборудования и техническую поддержку исследований.

Дополнительная информация

Соблюдение этических норм. Все процедуры, выполненные в исследовании с образцами добровольцев на анонимной основе, соответствуют национальным этическим стандартам, Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям и были одобрены комитетом по биоэтике Университета «Сириус» (протокол от 06.03.2023 г.). Информированное добровольное согласие получено от всех участников исследования до отбора образцов крови.

Об авторах

Е. В. Лысакова

АНО ВО Научно-технологический университет «Сириус»

Email: toschakov.vy@talantiuspeh.ru

аспирант

Россия, Федеральная территория «Сириус», Краснодарский край

С. А. Рыбцов

АНО ВО Научно-технологический университет «Сириус»

Email: toschakov.vy@talantiuspeh.ru

к.б.н., руководитель ресурсного центра клеточных технологий и иммунологии

Россия, Федеральная территория «Сириус», Краснодарский край

Владимир Юрьевич Тощаков

АНО ВО Научно-технологический университет «Сириус»

Автор, ответственный за переписку.
Email: toschakov.vy@talantiuspeh.ru

к.м.н., ведущий научный сотрудник, направление «Иммунобиология и биомедицина»

Россия, Федеральная территория «Сириус», Краснодарский край

Список литературы

Дополнительные файлы