Mice microglia cytokine profile changes under the influence of HSV-1

Irina D. Bulgakova; Булгакова Ирина Дмитриевна; V. V. Zverev; Зверев В. В.; E. O. Kravtsova; Кравцова Е. О.; G. N. Usatova; Усатова Г. Н.; D. A. Shoichet; Шойхет Д. А.; E. A. Zadvornykh; Задворных Е. А.; A. A. Shumkina; Шумкина А. А.

doi:10.15789/2220-7619-MMC-16772

Изменение цитокинового профиля микроглии у мышей под действием ВПГ-1

Авторы: Булгакова И.Д.¹^,2, Зверев В.В.¹^,2, Кравцова Е.О.², Усатова Г.Н.², Шойхет Д.А.², Задворных Е.А.², Шумкина А.А.²
Учреждения:
1. ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
2. ФГАОУ ВО Первый московский медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)
Выпуск: Том 14, № 3 (2024)
Страницы: 500-504
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Дата подачи: 26.07.2024
Дата принятия к публикации: 26.07.2024
Дата публикации: 28.07.2024
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/17727
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-MMC-16772
ID: 17727

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Введение. На сегодняшний день неуклонно растет количество людей с нейродегенеративной патологией. За последние годы появляется все больше информации о роли микроглии в развитии этих заболеваний. Исследования на животных показывают, что периферические воспалительные стимулы могут активировать микроглию в головном мозге, что указывает на важную роль этих клеток в развитии нейродегенерации. Под действием разных факторов микроглия может изменять свой фенотип и участвовать как в репарации, так и в повреждении клеток головного мозга. Еще одним известным фактором развития различных нейродегенеративных патологий является хроническая герпесвирусная инфекция, вызванная ВПГ-1 (вирусом простого герпеса 1 типа), однако точные патогенетические механизмы до сих пор неизвестны, тем не менее изучение влияния этого вируса на микроглию имеет большой потенциал. В связи с этим целью этой работы стала оценка влияния ВПГ-1 на изменение фенотипов микроглии у линии мышей, обладающих обычной восприимчивостью к данному вирусу, и у линии, более устойчивой к действию ВПГ-1, путем определения цитокинового профиля. Также нами было проведено сравнение межлинейных различий экспрессии генов цитокинов в контрольных группах. Материалы и методы. В исследовании проводилось заражение мышей линий C57BL/6 и BALB/c вирусом простого герпеса 1 типа, микроглию получали с использованием прерывистого градиента плотности, цитокиновый профиль оценивали по уровням экспрессии генов с использованием ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией, подсчет осуществлялся по методу 2^–ΔΔ^Ct, статистическую значимость определяли с помощью U-критерия Манна–Уитни. Результаты. Межлинейных различий экспрессии генов цитокинов в контрольных группах разных линий мышей не было обнаружено. При этом экспрессия генов отличалось в экспериментальных группах: у мышей линии BALB/c увеличивалась экспрессия генов как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов, у мышей линии C57BL/6 наблюдалось незначительное увеличение экспрессии генов IL-1β. Выводы. Полученные данные свидетельствуют о формировании различных фенотипов микроглии после перенесенной ВПГ-1 инфекции у разных линий мышей. По всей видимости, у мышей линии BALB/c происходит переключение с провосполительного М1-фенотипа микроглии на противовоспалительный М²-фенотип, в то время как у мышей линии C57BL/6 затухание инфекционного процесса происходит через возвращение к исходному М0-фенотипу.

Ключевые слова

IL-10, IL-1β, IL-6, TNFα, TGF-β, цитокины, экспрессия генов, ВПГ-1, микроглия, нейродегенерация

Полный текст

Введение

Микроглия представляет собой мононуклеарные клетки ЦНС мезодермального происхождения. Это резидентные иммунные клетки в ЦНС, которые различаются по морфологической структуре и функциональным особенностям. Микроглия выполняет ряд жизненно важных функций: участие в нейропластичности, взаимодействие с другими клетками ЦНС, формирование и развитие нервной системы, поддержание гомеостаза, репарация, защита от инфекций, привлечение периферических иммунных клеток, регуляция иммунного ответа, старение и повреждение [2].

В физиологических условиях в головном мозге находятся следующие типы микроглии: «покоящаяся» или малоактивная, М0-фенотипа, и два типа активированной микроглии — M1 и M2. «Покоящаяся» микроглия характеризуется минимальным высвобождением хемокинов и цитокинов, низкой экспрессией антигенов на клеточной поверхности. M1-фенотип характеризуется продукцией провоспалительных цитокинов, активных форм кислорода и азота и других факторов, вызывающих сильный воспалительный ответ. Этот тип микроглии участвует в элиминации патогена, активации клеток адаптивного иммунитета и повреждении нейронов, что может становиться пусковым механизмом развития нейродегенерации. M2-фенотип характеризуется синтезом противовоспалительных цитокинов, участвует в очистке тканей от клеточного детрита, активирует ангио генез, ремоделирует и репарирует ткани [3, 7].

Еще одним важным фактором, связанным с развитием нейродегенеративной патологии, является инфицирование ВПГ-1, однако конкретные патогенетические механизмы до сих пор остаются неизвестными. Тем не менее известно, что линия мышей C57BL/6 является более устойчивой к действию ВПГ-1, кроме того, вирус быстрее элиминируется из клеток мозга мышей этой линии, а сами поражения носят локальный характер, в то время как инфицирование мышей линии BALB/c тем же титром ВПГ-1 приводит к развитию энцефалита, серьезных поражений ЦНС, гибели мышей или длительной элиминации вируса, который поражает все отделы мозга [5].

Нами было выдвинуто предположение, что возможной причиной поражения ЦНС после перенесенной герпетической инфекции является нарушение переключения клеток микроглии с провоспалительного М1-фенотипа. Для проверки данной гипотезы были получены клетки микроглии от мышей этих двух линий после предварительного инфицирования ВПГ-1 с целью определения цитокинового профиля этих клеток.

Материалы и методы

В работе использовался эталонный штамм ВПГ-1 (из коллекции ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова). Культивирование и определение титра вируса проводилось на культуре клеток Vero. Титр вируса оценивали в lg ТЦД₅₀/мл.

Культуру клеток Vero выращивали в питательной среде DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS (Gibco, США)), бензилпенициллина (ПанЭко, Россия) 100 ЕД/мл, стрептомицин (ПанЭко, Россия) в концентрации 100 мкг/мл. Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ в течение 24 ч.

В работе использовались 8-месячные мыши линий BALB/c и C57BL/6. Мышей получали из питомника лабораторных животных филиала «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА (Столбовая, Россия). Все процедуры проводились строго в соответствии с требованиями, изложенными в «Правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных за № 755 от 12.08.1977». Инфекционный материал вводили интраназально под наркозом. В экспериментальную группу были включены мыши, перенесшие герпесвирусную инфекцию, в крови и ЦНС которых не обнаруживалась ДНК ВПГ-1.

Перед извлечением мозга под наркозом была проведена транскардиальная перфузия раствором Рингера. (Гематек, Россия), затем от мышей получали головной мозг, а клетки микроглии выделяли с использованием прерывистого градиента плотности [6]. Эксперимент воспроизводился по 3 раза для каждой линии мышей как инфицированных, так и контрольных групп.

Для обнаружения ВПГ-1 в мозге использовали набор для выделения ДНК — ДНК-СОРБ-АМ (АмплиСенс, Россия), с последующей постановкой ПЦР-РВ с помощью набора HSV I, II-FL (АмплиСенс) в соответствии с инструкциями производителя.

Для определения экспрессии генов IL-10, IL-1β, IL-6, TNFα, TGF-β получали клеточную РНК при помощи набора «Рибо-Сорб» (Синтол, Россия) с последующей постановкой ОТ-ПЦР-РВ с использованием набора «ОТ-1» для обратной транскрипции (Синтол) и набора реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I (Синтол). Подбор праймеров проводился на основании данных литературы.

Статистическую обработку данных проводили с помощью стандартных пакетов прикладных программ Excel (Microsoft Office, 2019), GraphPad Prism 8.4.3 (GraphPad Holdings, США). При обработке результатов пользовались стандартными статистическими методами. Для статистической обработки полученных данных использовали метод 2^–ΔΔ^Ct. Результаты, соответствующие значениям пороговых циклов (Ct) > 40, были признаны отрицательными. Для описания данных использовали средние величины (M) и стандартное отклонение (St Dev). Поскольку было замечено, что распределение ненормальное, то статистическую значимость полученных результатов определяли с помощью U-критерия Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

Микроглия экспрессирует различные рецепторы врожденного иммунитета, такие как TLRs (Toll-like receptors) и NLRs (NOD-like receptors), результатом активации которых является продукция цитокинов. В зависимости от активирующих сигналов из М0-фенотипа формируется М1- или М²-фенотип, которые характеризуются синтезом определенных цитокинов. В исследование были включены цитокины, характерные для каждого фенотипа, а затем были отобраны цитокины, чья роль в развитии нейродегенерации играет наиболее важное значение [7]. Таким образом, была проведена оценка уровня экспрессии генов цитокинов, синтезируемых М1-фенотипом — IL-1β, IL-6, TNFα, и М²-фенотипом — IL-10, TGF-β.

Экспрессию генов цитокинов сравнивали у двух линий мышей, перенесших герпетичес кую инфекцию, а также в контрольных группах. Экспрессия генов цитокинов (значение 2^–∆∆^Ct, отн. ед.) и степень достоверности (p) представлены в табл.

Таблица. Экспрессия генов цитокинов (значение 2⁻^∆∆^Ct, отн. ед.) и степень достоверности (p) для пар групп ½, ¾, ⅓ и ²̸₄

Table. Cytokine gene expression (2⁻^ΔΔ^Ct method) and P-value for groups ½, ¾, ⅓ and ²̸₄

BALB/c

C57BL/6

Значение P

P-value

Контрольная группа

Сontrol group

После инфицирования ВПГ-1

Mice infected with HSV-1

Контрольная группа

Сontrol group

После инфицирования ВПГ-1

Mice infected with HSV-1

IL-1β

1,02

(0,72–1,35)

12706,98* **

(11856,03–13619,0)

0,96

(0,68–1,55)

2,90*

(1,66–4,10)

P_1/2 < 0,05

P_3/4 < 0,05

P_1/3 — ns

P_2/4 < 0,05

IL-6

1,32

(0,57–1,32)

18,38*

(13,93–24,25)

–

P_1/2 < 0,05

P_3/4 — ns

TNFα

1,02 (0,72–1,35)

1702,38* **

(1290,16–2246,30)

1,0

(0,54–1,87)

1,07 (0,62–1,07)

P_1/2 < 0,05

P_3/4 — ns

P_1/3 — ns

P_2/4 < 0,05

TGF-β

1,29

(0,46–1,70)

1824,560575*

(1382,76–1955,52)

–

P_1/2 < 0,05

P_3/4 — ns

Примечание. * — обозначены группы с достоверно повышенным значением экспрессии генов цитокинов в сравнении с контрольной группой той же линии. ** — обозначены межлинейные группы с достоверно повышенной экспрессией генов в сравнении с экспрессией тех же генов другой линии мышей; «–» — результаты, соответствующие значениям пороговых циклов (Ct) > 40, были признаны отрицательными.

Note. * — groups with significantly increased expression of cytokine genes in comparison with the control group of the same line; ** — groups with significantly increased gene expression in comparison with the expression of the same genes of another mouse strain; «–» — results corresponding to cycle threshold (Ct) values > 40 were considered negative.

Была проведена оценка межлинейных различий в экспрессии генов клеток микроглии у здоровы мышей линий BALB/c и C57BL/6. Полученные данные свидетельствуют в пользу отсутствия этих различий. Затем, было проведено сравнение цитокинового профиля микроглии после перенесенной инфекции, вызванной ВПГ-1, с цитокиновым профилем здоровых мышей той же линии. В результате у линии BALB/c достоверно увеличивалась экспрессия генов как провоспалительных (IL-1β, IL-6, TNFα) цитокинов, так и противовоспалительного цитокина TGF-β, в то время как у линии C57BL/6 достоверно была увеличена экспрессия только IL-1β, но не на таком высоком уровне, как у BALB/c.

Несмотря на то, что экспериментальные группы мышей обеих линий перенесли герпесвирусную инфекцию, межлинейные изменения в цитокиновом профиле микроглии этих мышей существенно отличался. У мышей линии BALB/c значительное увеличение количества как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов можно объяснить переходом М1-фенотипа микроглии в М²-фенотип, что обычно и происходит после завершения инфекционного процесса. Однако у мышей линии C57BL/6 мы получили совершенно другие результаты. После перенесенной герпетической инфекции наблюдалось менее выраженное увеличение экспрессии генов провоспалительного цитокина IL-1β, при том, что достоверных изменений в экспрессии генов других цитокинов не наблюдалось. Данные результаты могут свидетельствовать о переходе М1-фенотипа в М0-фенотип без формирования М²-микроглии. По всей вероятности, затухание инфекционного процесса через возвращение к исходному фенотипу М0 оказывает меньшее повреждающее действие на нейроны, что может быть связано, например, с усилением фагоцитарной активности М²-клеток.

Заключение

В данном исследовании были описаны изменения цитокинового профиля после инфицирования ВПГ-1 у двух линий мышей с разной восприимчивостью к данному вирусу. Возможно, формирование различных фенотипов микроглии можно объяснить различной экспрессией рецепторов врожденного иммунитета, участвующих в активации внутриклеточных каскадных путей и изменении экспрессии генов цитокинов. Микроглия играет ключевую роль в развитии нейродегенерации. Более детальное изучение фенотипов этих клеток, механизмов переключения и их функций, а также определение взаимосвязи с другими факторами развития нейродегенерации позволит приблизиться к пониманию патогенеза деменций и других нейропатологий. Отдельного внимание заслуживает изучение лигандов рецепторов врожденного иммунитета, под действием которых происходит активация микроглии, а также изучение синтеза антимикробных пептидов, который регулируется активацией тех же рецепторов врожденного иммунитета [1, 4].

Благодарности

Авторы выражают благодарность НИИВС им. И.И. Мечникова и кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Сеченовского университета, на базе которых были проведены данные исследования.

Об авторах

Ирина Дмитриевна Булгакова

ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова; ФГАОУ ВО Первый московский медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Автор, ответственный за переписку.
Email: bulgakova_i_d@staff.sechenov.ru

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии, аспирант и ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии им. акад. А.А. Воробьева института общественного здоровья им. Ф.Ф. Эрисмана

Россия, 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а; Москва

В. В. Зверев

Email: bulgakova_i_d@staff.sechenov.ru

академик РАН, доктор биологических наук, профессор, научный руководитель, зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии им. акад. А.А. Воробьева института общественного здоровья им. Ф.Ф. Эрисмана

Россия, 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а; Москва