Генетический профиль карбапенем-устойчивых штаммов Acinetobacter baumannii

Полный текст

Введение

Представители вида Acinetobacter baumannii, характеризующиеся устойчивостью к карбапенемам, являются актуальными возбудителями инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи [20]. В 2009 г. Американским обществом инфекционистов они включены в так называемый список ESKAPE, объединяющий представителей проблемных условно-патогенных микроорганизмов — возбудителей нозокомиальных и внебольничных инфекций [6]. A. baumannii являются этиологическим агентом инфекций дыхательных путей (вентилятор-ассоциированная пневмония), системы кровотока, мочевыделительной системы, раневых поверхностей, а также центральной нервной системы [6, 7, 8, 9, 19, 20]. Согласно сведениям российской он-лайн платформы AMRmap (https://amrmap.ru) [1], в 2021 г. штаммы A. baumannii были зарегистрированы в качестве этиологических агентов инфекционных заболеваний в 8,39% случаев.

Известно, что бактерии A. baumannii обладают природной устойчивостью к антибиотикам различных классов и основными препаратами этиотропной терапии ацинетобактерной инфекции являются карбапенемы. В последние два десятилетия наблюдается увеличение частоты встречаемости клональных линий штаммов A. baumannii, характеризующихся устойчивостью к карбапенемам, что является серьезной клинической проблемой в глобальном масштабе [7, 8, 9, 19]. Многочисленные исследования последних лет показали, что наибольшее эпидемическое распространение получили карбапенем-устойчивые штаммы A. baumannii, относящиеся к нескольким определенным клональным линиям (они получили название всемирных эпидемических клонов international clones — IC) и ассоциированные с госпитальными инфекциями [9, 23]. В настоящее время выделяют девять глобальных клональных линий (IC1–IC9), среди которых доминирующими являются штаммы, относящиеся к первым трем международным клональным линиям, а абсолютное лидерство принадлежит представителям IC2 [9, 23].

Использование полногеномного секвенирования позволяет получить расширенную молекулярно-характеристику карбапенем-устойчивых штаммов A. baumannii, определить их клональную принадлежность, охарактеризовать структуру резистома и вирулома, изучить генетическое окружение детерминант устойчивости, провести сравнительный генетический анализ, определить филогенетические связи.

Материалы и методы

Объектом исследования являлись семь карбапенемустойчивых штаммов A. baumannii, полученных от пациентов, находящихся на стационарном лечении в медицинских организациях г. Нижнего Новгорода. Антибиотикограмма штаммов A. baumannii представлена в табл. 1.

 

Таблица 1. Антибиотикограмма штаммов A. baumannii

Table 1. A. baumannii strain antibiogram

Антибактериальный препарат Antibiotic agents	Штамм A. baumannii A. baumannii strain
	NNAb_1	NNAb_2022.1	NNAb_2023.1	NNAb_2023.2	NNAb_2023.3	NNAb_2023.4	NNAb_2023.5
Амикацин/Amikacin	R	R	R	R	R	R	R
Гентамицин/Gentamicin	R	R	R	R	R	R	R
Тобрамицин/Tobramycin	R	R	R	R	R	R	R
Ципрофлоксацин/Ciprofloxacin	R	R	R	R	R	R	R
Левофлоксацин/Levofloxacin	R	R	R	R	R	R	R
Имипенем/Imipenem	R	R	R	R	R	R	R
Меропенем/Meropenem	R	R	R	R	R	R	R
Дорипенем/Doripenem	R	R	R	R	R	R	R
Триметоприм/сульфаметоксазол Trimethoprim/sulfamethoxazole	R	R	R	R	R	R	R
Полимиксин Е (колистин) Polymyxin E (colistin)	S	S	S	S	S	S	S

 

Для выделения ДНК использовали набор «АмплиПрайм ДНКсорб-В» (ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Подготовку ДНК-библиотеки для секвенирования осуществляли с использованием набора ShotGun «SG GM» (Raissol, Россия) и комплекта индексированных праймеров для двойного баркодирования (Raissol, Россия). Секвенирование проводили на приборах «iSeq 100» (Illumina, США) и «GenoLab M» (GeneMind Biosciences Co., Китай). Выравнивание и cборку нуклеотидных последовательностей de novo осуществляли с использованием web-сервиса Assembly (https://www.bv-brc.org/app/Assembly2) и программного обеспечения SPAdes версия v3.13.0. Аннотирование геномных последовательностей штаммов A. baumannii проводили с использованием сервиса Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok). С помощью сервисов базы данных Acinetobacter baumannii typing database (https://pubmlst.org/bigsdb?db = pubmlst_abaumannii_seqdef) осуществляли типирование штаммов по схеме MLST. Для поиска детерминант патогенности и резистентности использовали поисковые сервисы базы данных Virulence Factor of Pathogenic Bacteria (http://www.mgc.ac.cn/VFs) и Resistance Gene Identifier (https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi). Определение мобильных элементов, ассоциированных с детерминантами резистентности, осуществляли с помощью web-сервисов IS-finder (https://www-is.biotoul.fr) и VRprofile2 (https://tool2-mml.sjtu.edu.cn/VRprofile/home.php). C использованием сервиса BLASTN проводили поиск гомологичных нуклеотидных последовательностей.

Web-сервис REALPHY (https://realphy.unibas.ch/realphy) использовали для выравнивания нуклеотидных последовательностей геномов штаммов A. baumannii. Построение дендрограмм проводили с помощью программы MEGA 7.0.26 [17] алгоритм Neighbor joining с бутсрап поддержкой 100 повторов.

Результаты

Общая структура генома исследуемых штаммов A. baumannii, полученная в результате биоинформатического анализа результатов полногеномного секвенирования, представлена в табл. 2.

 

Таблица 2. Общая структура генома штаммов A. baumannii

Table 2. Genome pattern of A. baumannii strains

Показатели Feature	Штамм A. baumannii A. baumannii strain
	NNAb_1	NNAb_2022.1	NNAb_2023.1	NNAb_2023.2	NNAb_2023.3	NNAb_2023.4	NNAb_2023.5
Размер генома, тыс. п.н. Genome size, kb	4 008	4 012	3 878	3 955	3 993	4 030	3 978
Количество белок-кодирующих последовательностей Number of protein-coding sequences	3 849	3 841	3 663	3 777	3 756	3 863	3 765
Количество тРНК Number of tRNA	58	55	80	74	67	68	72
Количество рРНК Number of rRNA	3	3	6	4	4	4	5
Количество профагов Number of prophages	5	5	5	4	7	6	6
Плазмида, тыс. п.н. Plasmid, kb	11	15	11	11	15	14	11
	64,4					62,5
Сиквенс-тип (схема Pasteur/схема Oxford) Sequence type (Pasteur scheme/Oxford scheme)	2/2062,2063	78/1757	2/2062,2063	2/2062,2063	78/1757	2/2062,2063	2/2062,2063
Международная клональная линия International clonal lineage (IC)	2	6	2	2	6	2	2
KL-тип KL-type	235	130	235	–	130	235	235
OCL-тип OCL-type	1	1	1	1	1	1	1

 

В результате типирования по схемам МLST установлено, что два штамма принадлежат сиквенс-типу (ST) 78^Pas (схема Pasteur) [9] и 1757^Oxf (схема Oxford) [4]. Другие пять штаммов по схеме Pasteur принадлежат ST2, а по схеме Oxford одновременно принадлежат двум ST (2062, 2063), поскольку в геноме обнаружились две копии гена gdhB, кодирующего дегидрогеназу В, с разными аллельными вариантами.

Проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генома штаммов A. baumannii, принадлежащих генотипу ST2^Pas/ST2062,2063^Oxf (рис. 1А). Установлено, что все исследуемые штаммы группируются в один кластер с высокой степенью поддержки, в который входит также штамм, выделенный от больного в г. Нижний Новгород в 2022 г. На соседней ветке располагаются штаммы, выделенные в Москве в 2019–2018 гг. [12].

 

Рисунок 1. Филогенетическое дерево, построенное по алгоритму Neighbor joining, на основе анализа нуклеотидных последовательностей генома штаммов A. baumannii, принадлежащих ST2^Pas/ST2062,2063^Oxf (A) и ST78^Pas/CC944^Oxf (Б)

 

Дендрограмма нуклеотидных последовательностей штаммов A. baumannii ST78^Pas и клонального комплекса (CC) 944^Oxf представлена на рис. 1Б. Согласно полученным данным, исследуемые штаммы A. baumannii образуют единый кластер со штаммом A. baumannii AbCTX5 (CP060505.1), выделенным во Франции в 2015 г. [22] и относящимся к ST78^Pas/1757^Oxf.

С использованием сервиса BLASTN у исследуемых штаммов A. baumannii были определены контиги, принадлежащие плазмидной ДНК. Так, у всех исследуемых штаммов A. baumannii присутствуют последовательности pAB120-подобной (CP031446.1) плазмиды, у двух штаммов A. baumannii выявлены последовательности второй pACICU2-подобной (CP031382.1) плазмиды. Согласно схеме типирования плазмид A. baumannii, предложенной Bertini A. и соавт., 2010 [13], данные плазмиды относятся к типам GR2 и GR6 соответственно.

Структуры CRISPR отсутствовали у всех исследуемых штаммов A. baumannii, что является характерной особенностью бактерий данного вида. Так, исследования Yadav G. и соавт. [27] показали, что последовательностями CRISPR могут обладать около 14% штаммов A. baumannii.

В табл. 3 представлены генетические маркеры резистентности, выявленные в структуре генома исследуемых штаммов A. baumannii. Согласно полученным результатам, все штаммы A. baumannii обладают собственными генами бета-лактамаз, относящихся к группе ADC-цефалоспориназ, а также ОXA-51-подобных карбапенемаз.

 

Таблица 3. Генетические маркеры устойчивости штаммов A. baumannii

Table 3. Resistance genetic markers in A. baumannii strains

Штамм Strain	Детерминанты устойчивости/Determinants of resistance
	собственные/natural		приобретенные/acquired		Мутации в хромосомных генах Mutations in chromosomal genes
	модификация АБ AB modification	системы эффлюкса efflux systems	модификация АБ AB modification	системы эффлюкса efflux systems
NNAb_1	blaADC-30, blaOXA-66, ant(3'')-IIс	Семейство RND — adeACFGHIJKLNR; Семейство MATE — pmpM; Семейство MFS — amvA, abaFQ; Семейство ABC — soxR; Семейство SMR — abeS	blaOXA-23 aadA, aph(3'')-Ib, aph(6)-Id, aac(6')-Ib, aph(3')-Ia, mph(E), msr(E), armA, sul1, sul2, catB8, arr-2	сmlA5	gyrA (S83I), parC (S84L, V104I, D105E)
NNAb_2022.1	blaADC-152, blaOXA-90, ant(3'')-IIс		blaOXA-72, blaCTX-M-115, mph(E), msr(E), armA, sul1	qacEdelta1	gyrA (S83I), parC (S84L, V104I, D105E)
NNAb_2023.1	blaADC-30, blaOXA-66, ant(3'')-IIс		blaOXA-23, aph(3'')-Ib, aph(6)-Id, aac(6')-Ib, aadA1, mph(E), msr(E), armA, sul1, sul2, catB8, arr-2	сmlA5, qacEdelta1
NNAb_2023.2	blaADC-30, blaOXA-66, ant(3'')-IIс		blaOXA-23, aph(3'')-Ib, aph(6)-Id, aac(6')-Ib, aadA1, mph(E), msr(E), armA, sul1, sul2, catB8, arr-2	сmlA5, qacEdelta1	gyrA (S83I), parC (S84L, V104I, D105E)
NNAb_2023.3	blaADC-152, blaOXA-90, ant(3'')-IIс		blaOXA-72, blaCTX-M-115, blaCARB-16, aac(6')-Ian, aph(3')-Ia, aadA5, mph(E), msr(E), armA, sul1	cmlA5, floR, qacEdelta1	gyrA (S83I), parC (S84L, V104I, D105E)
NNAb_2023.4	blaADC-30, blaOXA-66, ant(3'')-IIс		blaOXA-23, aph(3'')-Ib, aph(6)-Id, aac(6')-Ib, aadA1, mph(E), msr(E), armA, sul1, sul2, catB8, arr-2	cmlA5, qacEdelta1	gyrA (S83I), parC (S84L, V104I, D105E)
NNAb_2023.5	blaADC-30, blaOXA-66, ant(3'')-IIс		blaOXA-23, aph(3'')-Ib, aph(6)-Id, aac(6')-Ib, aadA1, mph(E), msr(E), armA, sul1, sul2, catB8, arr-2	cmlA5, qacEdelta1	gyrA (S83I), parC (S84L, V104I, D105E)

Примечание. АБ — антибактериальный препарат.

Note. AB is an antibiotic.

 

Для исследуемых штаммов A. baumannii характерно наличие приобретенных генов бета-лактамаз и ферментов, связанных с модификацией макролидов (mph(E), msr(E)), хлорамфениколов (catB8), аминогликозидов (aadA, aph(3'')-Ib, aph(6)-Id, aac(6')-Ib, aph(3')-Ia, armA), сульфаниламидов (sul1, sul2).

С помощью сервисов VRprofile2 и BLAST у исследуемых штаммов A. baumannii, принадлежащих ST2^Pas, определены нуклеотидные последовательности, несущие гены антибиотикорезистентности, которые являются высокогомологичными последовательности композитного транспозона Tn6279 (KT317075.1) [15]. Также установлено, что у штаммов A. baumannii сиквенс-типа 2 гены aph(3'')-Ib, aph(6)-Id, sul2 ассоциированы с IS91-подобным мобильным элементом, относящимся к группе ISCR2 (aph(3'')-Ib→aph(6)-Id→ISCR2→sul2). Кассетную организацию также имеют гены cmlA5 и arr2, которые расположены в составе короткого контига. Следует отметить, что у представителей A. baumannii ST2^Pas детерминанты резистентности в структуре плазмидной ДНК выявлены не были.

У штаммов A. baumannii ST78^Pas гены устойчивости макролидам, аминогликозидам, сульфаниламидам также ассоциированы с мобильными инсерционными элементами и образуют следующую генетическую структуру: mph(E)→msr(E)→ISEc29→armA→∆IS5→IS91-like→ sul1→qacE∆1, у штамма A. baumannii NNAb_2023.3 после гена qacE∆1 присутствует дополнительно ген аминогликозидазы aadA5. В структуре резистома штаммов A. baumannii ST78^Pas определен ген blaCTX-M-115, перед которым расположены последовательности ISKpn26 и ∆ISEcp1. У штамма A. baumannii NNAb_2023.3 в нуклеотидной последовательности генома также присутствует ген blaCARB-16. Последний расположен в составе короткого контига, в последовательности которого мобильные элементы отсутствуют.

Анализ структуры плазмидной ДНК штаммов A. baumannii ST78^Pas показал наличие гена карбапенемазы blaOXA-72.

У всех исследуемых штаммов A. baumannii выявлены мутации в генах gyrA и parC, ассоциированных с устойчивостью к фторхинолонам.

В структуре вирулома штаммов A. baumannii определены гены, кодирующие белки системы секреции II (gspDEFK) и VI типов (vgrG/tssI, clpV/tssH, tssM); белки, участвующие в синтезе липополисахарида (lpxABCD, lpsB), пилей IV типа (кластер генов pil), фимбрий Csu и Ata-адгезина. Среди факторов инвазии определены гены фосфолипаз С и D, гены белка-сидерофора ацинетобактина (basD, bauA, basB) и системы захвата железа HemO. Также выявлены детерминанты, ответственные за биопленкообразование (pgaAB, bap).

Нуклеотидные последовательности генома исследуемых штаммов A. baumannii депонированы в базу данных GenBank (NCBI) под номерами JAVVDE000000000.1, JAVVDF000000000.1, JAVVDG000000000.1, JAVVDH000000000.1, JAVVDI000000000.1, JAZBGN000000000.1

Обсуждение

Согласно полученным нами данным, все исследуемые штаммы A. baumannii принадлежат к международным клональным линиям IC2 и IC6. Известно, что штаммы IC2 занимают доминирующее положение среди карбапенем-устойчивых штаммов A. baumannii во всем мире, их распространение приходится на конец 70-х гг. XX в. [23]. Необходимо отметить, что исследуемые штаммы A. baumannii согласно схеме Oxford принадлежат сиквенс-типу 2062,2063. Штаммы ST2062,2063 впервые были выявлены в 2014 г. в Непале, затем Таиланде, Индии и в 2018 г. в России [12]. Представители данного генотипа встречаются редко: так, в базе данных PubMLST имеется информация лишь о 15 штаммах из 6804, принадлежащих ST2^Pas (на февраль 2024 г.). По данным Mayanskiy N. и соавт. [18] в 2017 г. в России наиболее часто встречались представители клональной группы 92 по схеме Oxford. Клональная линия IC6, к которой принадлежат представители ST78^Pas, относится к числу недавно появившихся. Так, штамм A. baumannii ST78^Pas впервые был выявлен в 2006 г. в Италии [13], затем представители данного генотипа были обнаружены в США, Бразилии [11], Франции [22] и России [18, 24]. Согласно схеме Oxford, исследуемые штаммы A. baumannii относятся к ST1757. На февраль 2024 г. в базе данных PubMLST имеется информация только о двух штаммах данного сиквенс-типа, выделенных во Франции (2015 г.) и в России (г. Казань, 2017). Согласно анализу eRURST сиквенс-тип 1757^Oxf входит в состав клонального комплекса (СС), образуемого ST944. Показано, что штаммы ST78^Pas/СС944^Oxf занимают второе ранговое место по распространенности на территории России [2, 3]. С использованием сервиса Kaptive установлено, что по ОС-локусу все штаммы A. baumannii принадлежат геногруппе 1, к которой относятся большинство полирезистентных штаммов A. baumannii, при этом по K-локусу, штаммы разделились на геногруппы 130 и 235, не являющиеся широко распространенными по данным литературы [12, 26].

Анализ структуры вирулома исследуемых штаммов A. baumannii показал отсутствие существенных различий, что согласуется с данными литературы, полученными при проведении крупномасштабных исследований [12, 26].

Структура резистома исследуемых штаммов A. baumannii ST2^Pas содержит набор детерминант устойчивости, характерный для представителей данной клональной линии [2, 3, 12, 16, 20, 26]. Так, установлено, что последовательности, несущие гены aph(3')-Ia, armA, mph(E), msr(E), aaсA4, aadA1, catB8, sul1, qacE∆1, являются высокогомологичными последовательности транспозона Tn6279, впервые описанного у штаммов A. baumannii A071 и A. baumannii A091 [15]. В структуру данного композитного транспозона входит последовательность Tn6020-подобного транспозона, несущего aph(3')-Ia, и Tn1548-подобного транспозона с генами armA, msr(E), mph(E) и генами aaсA4, aadA1, catB8, sul1, qacE∆1 в составе интегрона первого класса. У исследуемых штаммов длина Tn6279-подобного участка короче на 2409 п.н. и отсутствует последовательность ISAba24.

Установлено, что у исследуемых штаммов A. baumannii ST2^Pas гены aph(3'')-Ib, aph(6)-Id, sul2 сгруппированы и ассоциированы с IS91-подобным мобильным элементом, относящимся к группе ISCR2. Известно, что данная генетическая структура входит в состав транспозона Tn6172, который может быть локализован в плазмиде pA297-3 (KU744946.1) [14]. При сравнительном анализе определено, что у исследуемых штаммов A. baumannii участок с генами аминогликозидаз идентичен последовательности Tn6172 лишь на 65%, так как отсутствует участок, несущий ISAba1 и кластер генов tni. Совместная локализация генов cmlA5 и arr2 часто встречается у штаммов A. baumannii. В первую очередь, данные гены у штаммов A. baumannii обнаруживаются в составе интегрона 1-го класса [10, 21], который может быть локализован, как в структуре плазмидной ДНК (pVB82_1, pPM194229_1 и др.), так и входить в состав композитного транспозона, например Tn1548-like-2 [15].

Резистом исследуемых штаммов A. baumannii ST78^Pas/ST1757^Oxf характеризуется набором детерминант схожим с описанными ранее штаммами, принадлежащими IC-6, которые были выявлены и в Бразильском регионе Амазонки [11], во Франции [22] и на территории России [2, 3, 18]. Для всех штаммов данного сиквенс-типа характерно наличие генов blaCTX-M-115 и blaOXA-72, последний находится в составе плазмиды, размер которой может варьировать от 7 до 20 тыс. п.н [25]. Сравнительный анализ плазмидной нуклеотидной последовательности исследуемых штаммов показал почти 100% совпадение с последовательностью плазмиды pAbCTX5 (CP092029.1), выявленной в филогенетически близком штамме A. baumannii AbCTX5 (CP060505.1). У штаммов A. baumannii NNAb_2022.1 и NNAb_2023.3 перед геном blaCTX-M-115 расположен ISKpn26, встроившийся в последовательность ISEcp1. Аналогичное генетическое окружение гена blaCTX-M-115 было выявлено у штаммов A. baumannii в исследованиях Vuillemenot J.B. и соавт. [25], а также в данной работе было показано, что штаммы A. baumannii ST78^Pas/ST1757^Oxf характеризовались наличием гена blaCARB-16 в отличие от штаммов A. baumannii ST78^Pas/ST944^Oxf, которые обладали геном blaTEM-1 [18]. Vuillemenot и соавт. [25] установлено, что у большинства штаммов A. baumannii гены резистентности сгруппированы на участках длиной от 19 до 80 тыс. п.н. между генами glmS и hutC [25]. Так, у штаммов A. baumannii AbCTX4 и AbCTX5 генотипа ST78^Pas/ST1757^Oxf данный участок имеет длину 80 тыс. п.н., в котором расположены гены устойчивости к аминогликозидам, макролидам, сульфаниламидам, гены бета-лактамаз CARB-16 и CTX-M-115. Сравнительный анализ показал высокий уровень идентичности нуклеотидных последовательностей исследуемых штаммов A. baumannii ST78^Pas/ST1757^Oxf (более 90%) с последовательностью данного участка штамма A. baumannii AbCTX5 (рис. 2, III обложка). Однако у штамма NNAb_2021.1 последовательность участка оказалась более короткой (около 60 тыс. п.н.), поскольку отсутствует фрагмент, несущий гены aac(6')-Ian, floR, blaCARB-16, sul2.

 

Рисунок 2. Выравнивание нуклеотидных последовательностей штаммов A. baumannii NNAb_2023.3 (A) и NNAb_2022.1 (Б) относительно последовательности участка генома штамма A. baumannii AbCTX5 (CP060505.1) длиной 83 257 п.н. (1796552–1879809), несущего детерминанты антибиотикорезистентности

 

Заключение

Таким образом, в результате проведенных исследований получены сведения о генетическом профиле штаммов A. baumannii, принадлежащих IC2 и IC6. Все исследуемые штаммы A. baumannii характеризовались сходной структурой вирулома, однако в структуре резистома были выявлены различия как между штаммами разных сиквенс-типов, так и принадлежащих к одному сиквенс-типу. Показано широкое разнообразие мобильных элементов, участвующих в распространении генов лекарственной устойчивости. Полученные данные способствуют расширению представлений о молекулярно-генетических характеристиках штаммов A. baumannii — представителях международных эпидемически значимых клональных линий.

Благодарности

Выражаем благодарность старшему научному сотруднику лаборатории микробиологии ФБУН Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной, Роспотребнадзора, д.м.н. Гординской Наталье Александровне за помощь в подборе штаммов Acinetobacter baumannii.

Об авторах

Анна Евгеньевна Алексеева

ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: a.e.alexeeva79@mail.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории метагеномики и молекулярной индикации патогенов

Россия, г. Нижний Новгород

Н. Ф. Бруснигина

ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Email: a.e.alexeeva79@mail.ru

к.м.н., доцент, зав. лабораторией метагеномики и молекулярной индикации патогенов

Россия, г. Нижний Новгород

М. А. Махова

ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Email: a.e.alexeeva79@mail.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории метагеномики и молекулярной индикации патогенов

Россия, г. Нижний Новгород

Список литературы

Дополнительные файлы