Противовирусная активность полиаллиламина в отношении вирусов гриппа и ОРВИ в различных клеточных культурах

Полный текст

Введение

На сегодняшний день трудно назвать в мире страну, в которой не были бы отмечены случаи заболевания гриппом [4, 9, 10]. Радикальных химиопрепаратов для лечения гриппа и ОРВИ на данный момент не существует. Основными факторами отсутствия таких химических соединений является природная изменчивость вирусной популяции, высокая вариабельность генома и генетическая предрасположенность к многочисленным точечным мутациям. В связи с этим, необходимо осуществлять поиск химиопрепаратов с широким спектром действия: как в отношении поверхностных антигенных белков, так и вирусной мембраны. К таким соединениям можно отнести различные ПЭ, в частности, ПАА, которые обладают повреждающим действием на вторичную структуру белка, ферментов и вирусную мембрану. При этом для ПАА выявлена противовирусная активность в отношении нескольких вирусов [1, 2, 3, 5]. В данной работе проведено исследование цитотоксичности и противовирусной активности ПАА в различных концентрациях в отношении трех штаммов вируса гриппа и двух респираторных вирусов HPIV-3 и RSV на нескольких клеточных линиях различного происхождения. Показан вирусингибирующий эффект в совокупности с невысокой цитотоксичностью ПАА в отношении всех вирусов, культивируемых в пермиссивных клеточных линиях, причем наибольшая противовирусная активность наблюдалась в культуре клеток легочного происхождения А549.

Материалы и методы

Вирусы и клетки. В исследовании использовали следующие вирусы из коллекции вирусных штаммов ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова:

• HPIV-3;
• RSV;
• вирус гриппа А/Bangkok/1/1979(Н3N2);
• вирус гриппа А/ВЧП/Вейбридж(Н7N7);
• вирус гриппа А/Маллард/Пенсильвания/ 10218/84(H5N2).

Вирусы накапливали в следующих клеточных культурах: вирусы гриппа — в клетках MDCK, RSV и HPIV-3 — в клетках МА-104. Для оценки цитотоксичности и вирусингибирующего действия ПАА использовали также клеточные линии А549, L-41, НЕр-2 и Vero. Конечная концентрация клеток находилась в диапазоне от 1,6 × 10⁵ до 2,4 × 10⁵ кл/мл.

ПЭ. В работе использовали полиэлектролит — ПАА гидрохлорид с молекулярной массой Mw = 6000 Da (Sigma, США) (рис. 1).

 

Рисунок 1. Структурная формула полиаллиламина гидрохлорида

 

Определение инфекционного титра вирусов. Из вируссодержащей жидкости готовили серию десятикратных разведений на среде для культивирования клеток. Этими разведениями инфицировали клетки пермиссивной линии, рассеянные в 96-луночные планшеты. Далее планшеты инкубировали в атмосфере СО₂ при 36°С в течение 72–120 ч в зависимости от вируса. По окончании инкубации оценивали наличие цитопатогенного действия в лунках. Инфекционный титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча в модификации Томпсона и выражали в lgТЦД₅₀/мл [6].

Оценка цитотоксичности ПАА. Клетки используемых линий рассевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 14–24 ч до формирования монослоя, занимающего от 80 до 90% ростовой поверхности. Конечная концентрация растворов ПАА составляла 2–80 мкМ. В лунки планшетов вносили ПАА в указанном диапазоне концентраций и инкубировали 24 или 48 ч при 36°С в атмосфере 5% СО₂. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-теста [8] по истечению времени инкубации. В основе этого колориметрического метода лежит способность клеток метаболизировать тетразолиевый краситель МТТ, изменяя его окраску. Интенсивность окрашивания определяли спектрофотометрически через 24 и 48 часов при длине волны 590 нм. На основании полученных данных рассчитывали 50% цитотоксическую концентрацию (СС₅₀).

Оценка клеточной протективной активности ПАА. Клетки пермиссивных линий высевали на 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 14–24 ч до формирования монослоя, занимающего от 80 до 90% ростовой поверхности, ПАА вносили в указанном выше диапазоне концентраций в лунки планшетов с монослоем клеток в объеме 0,2 мл. Состояние клеточного монослоя оценивали методом фазово-контрастной микроскопии с помощью инвертированного микроскопа Биомед — 3И (Россия). Далее планшеты с клетками инкубировали в атмосфере 5% СО₂ при 36°С в течение 60 мин. Затем вносили в лунки по 0,1 мл соответствующей вируссодержащей жидкости (множественность инфекции составляла 0,01 ТЦД₅₀/кл) в среде альфа-МЕМ и инкубировали в течение 48 ч в атмосфере СО₂ при 36°С. После инкубации клетки промывали средой МЕМ и проводили анализ жизнеспособности, как описано выше. На основании полученных данных рассчитывали значения 50% ингибирующей концентрации (IC₅₀), то есть концентрации химиопрепарата, при которая приводила к 50% снижению цитопатогенного действия вируса.

Изучение противовирусного действия ПАА. Клетки пермиссивных линий высевали на 24-луночные планшеты и инкубировали 14–24 ч до формирования монослоя, занимающего от 80 до 90% ростовой поверхности. Затем вносили в лунки по 0,1 мл соответствующей вируссодержащей жидкости (множественность инфекции составляла 0,01 ТЦД₅₀/кл) в среде альфа-МЕМ и инкубировали в течение 48–72 ч в атмосфере СО₂ при 36°С. После инкубации клетки промывали средой МЕМ и вносили ПАА в указанном выше диапазоне концентраций в лунки планшетов с монослоем клеток в объеме 0,5 мл. Планшеты инкубировали в атмосфере СО₂ при 36°С в течение 48 ч. Затем в культуральной жидкости определяли инфекционный титр вируса.

Статистическая обработка результатов. Расчет значений СС₅₀ и IC₅₀ проводили с помощью программы GraphPad Prism 6.0. Индекс селективности (SI) рассчитывался как отношение СC₅₀ к IC₅₀. Указанные параметры определялись для всех вирусов Количественной оценкой вирусингибирующего действия ПАА являлась величина T (lgТЦД₅₀/мл), равная разности инфекционных титров до и после внесения ПАА в соответствующей концентрации. Статистическую обработку результатов, полученных из четырехкратных повторов каждого эксперимента, проводили стандартными методами с помощью Microsoft Excel 2010 с проверкой выборки на нормальное распределение с помощью критерия Колмогорова и расчета t-критерия, различия считали достоверными при 0,05. Противовирусный эффект считали терапевтически достоверным при T2 lgТЦД₅₀/мл.

Результаты

Оценка цитотоксичности ПАА проведена в отношении клеточных линий MDCK, A549, MA-104, L-41, HEp-2 и Vero. В табл. 1 приведены полученные результаты.

 

Таблица 1. Цитотоксичность ПАА в отношении различных клеточных линий

Table 1. PAA cytotoxicity in various cell lines

Срок инкубации, ч Incubation period, hours	СС50, мкМ | СС50, µМ
	L-41	Vero	MA-104	HEp-2	A549	MDCK
24	38±1,8	50±1,9	12±1,3	42±1,7	44±1,4	34± 1,1
72	57±1,5	74±2,1	28±1,6	65±2,0	69±1,8	61±1,6

 

Из полученных результатов видно, что наибольшей чувствительностью к токсическому действию ПАА обладала клеточная линия МА-104, для которой наблюдалась самое низкое значение СС₅₀ уже через 24 ч инкубации с химиопрепаратом. Все остальные клеточные линии обладали меньшей чувствительностью к ПАА.

Результаты оценки противовирусного действия ПАА в отношении штаммов вируса гриппа, культивируемого в клетках А549, приведены в табл. 2 и на рис. 2, представлены в виде значений IC₅₀, SI и кинетики изменения инфекционного титра, Т.

 

Таблица 2. Противовирусная активность ПАА в отношении штаммов вируса гриппа в культуре клеток А549

Table 2. PAA antiviral activity against influenza virus strains in A549 cell culture

Вирусы/Viruses	СС50, мкМ | СС50, µМ	SI
А/Bangkok/1/1979(Н3N2)	5,3±0,2	13
А/FPV/Weybridge(Н7N7)	4,6±0,1	15
А/Мallard/Pennsylvania/ 10218/84(H5N2)	3,0±0,2	23

 

Рисунок 2. Кинетика изменения инфекционного титра штаммов вируса гриппа при добавлении различных концентраций ПАА

 

Из полученных результатов видно зависимое от концентрации ПАА достоверное снижение инфекционного титра на 2,5–3 порядка для трех штаммов вируса гриппа. Наибольшую чувствительность к химиопрепарату, судя по значениям IC₅₀ и SI, проявил штамм А/Маллард/Пенсильвания/10218/84(H5N2). Для клеточной линии MDCK такое снижение инфекционности вируса наблюдалось только к 7 суткам [5], что указывает на более эффективное подавления размножения вируса гриппа в эпителиальных клетках респираторного тракта по сравнению с эпителиальными клетками другого происхождения.

Следующим этапом исследования явилось изучение вирусингибирующего действия ПАА в отношении HPIV-3 и RSV в различных культурах клеток. В табл. 3 приведены количественные характеристики вирусингибирующего действия ПАА: снижение инфекционного титра вирусов (T) при различных значениях IC₅₀ в соответствующей клеточной линии.

 

Таблица 3. Вирус ингибирующее действие ПАА в отношении респираторных вирусов в различных клеточных линиях

Table 3. PAA virus inhibitory effect against respiratory viruses in various cell lines

Культура клеток Cell line	HPIV-3		RSV
	СС50, мкМ СС50, µМ	∆T, lgТЦД50/мл ∆T, lgТCID50/ml	СС50, мкМ СС50, µМ	∆T, lgТЦД50/мл ∆T, lgТCID50/ml
A549	4,9±0,4	2,6	4,2±0,3	2,9
Vero	16,2±1,2	0,4	9,3±0,4	1,2
L-41	10,5±0,9	1,3	7,6±0,2	1,8
МА-104	9,6±0,6	1,4	6,8±0,5	2,2
HEp-2	6,4±0,8	1,6	5,2±0,2	2,4

 

Обсуждение

Как видно из приведенных результатов, вирусингибирующее действие ПАА было различным для пяти респираторных вирусов и зависело от типа клеточной линии. Для использованных культур клеток максимальное вирусингибирующее действие проявлялось в культуре A549 для обоих вирусов. Поскольку клеточная линия А549 эпителиального происхождения из респираторного тракта человека, максимальный противовирусный эффект от ПАА следует ожидать при размножении респираторных вирусов в легких человека и соответственно при лечении вирусных пневмоний. Минимальное подавление вирусной активности наблюдалось для клеточной линии Vero, что может быть связано с тем, что данная клеточная линия является дефицитной по выработке интерферонов [7]. В результате этого в данной клеточной линии не могут быть в полной мере реализованы реакции неспецифического иммунитета, такие как индукция интерферона с последующим связыванием его с рецепторами, активацией интерферонстимулирующих генов, запускающих иммунный ответ.

Таким образом, используемый в работе химиопрепарат ПАА проявлял выраженную противовирусную активность в отношении вируса гриппа и других респираторных вирусов в различных клеточных линиях, что связано, как было ранее нами показано в отношении вируса гриппа [5], с наличием множественного механизма противовирусного действия, заключающегося не только в инактивации связанного поверхностных антигенных белков, но и с структурными изменениями вирусной мембраны. Следует отметить, что наибольшая противовирусная активность ПАА наблюдалась в клеточной линии А549, имеющей легочное происхождение и максимально приближенной к природной мишени этих вирусов. На основании полученных результатов, можно заключить, что применение химиопрепарата ПАА возможно в качестве как профилактического, так и лечебного средства против гриппа и ОРВИ.

Исследования выполнены без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

Н. А. Контаров

ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет); ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: kontarov@mail.ru

к.б.н., доцент кафедры медицинской и биологической физики; ведущий научный сотрудник отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе 

Россия, Москва; Москва

А. А. Бахромеева

ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: kontarov@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории детских вирусных инфекций отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

Россия, Москва

Е. И. Долгова

ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: kontarov@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории детских вирусных инфекций отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

Россия, Москва

И. В. Погарская

ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: kontarov@mail.ru

к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории детских вирусных инфекций отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе

Россия, Москва

Е. О. Контарова

ФНКЦ Федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства (Больница № 83)

Email: kontarov@mail.ru

к.м.н., врач лучевой диагностики

Россия, Москва

Н. В. Юминова

ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: kontarov@mail.ru

д.б.н., зам. руководителя отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе и профессор отдела аспирантуры

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы