Серотонин и адреналин как ингибиторы образования внеклеточных ловушек нейтрофилов в эксперименте
- Авторы: Скупневский С.В.1, Савельев Р.В.1
-
Учреждения:
- Институт биомедицинских исследований — филиал ФГБУН Федерального научного центра «Владикавказский научный центр Российской академии наук»
- Выпуск: Том 14, № 4 (2024)
- Страницы: 823-826
- Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
- Дата подачи: 20.12.2023
- Дата принятия к публикации: 08.08.2024
- Дата публикации: 31.10.2024
- URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/17558
- DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-SAA-17558
- ID: 17558
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Регуляция процесса нетоза нейтрофилов как провоцирующего фактора развития воспалительных и аутоиммунных заболеваний может составить основу высокоэффективной таргетной терапии. Цель — изучить модифицирующее действие серотонина и адреналина в отношении нетоза при фагоцитозе у крыс. Материалы и методы. Крысы линии Wistar, разделенные на контрольную (растворитель, 0,9% раствор NaCl) и опытные (серотонин и адреналин 1,43 и 0,143 мг/кг массы тела соответственно) группы. Внутрибрюшинное введение затравок — за 90 мин до забора крови, в которой определяли фагоцитарную активность (фагоцитарный индекс и фагоцитарное число) и степень суицидального нетоза нейтрофилов: с полной и частичной деконденсацией хроматина. Сравнение групп проводили с использованием парного критерия Стьюдента (для численных значений) и Мак-Немара (для дихотомических переменных). Степень линейной зависимости между выборками оценивали по критерию Пирсона (rxy). Результаты. Введение адреналина способствовало ингибированию нетоза на 41,5% относительно контроля (p < 0,001), серотонина — на 27,6% (p < 0,001). Соотношение нейтрофилов с полной деконденсацией хроматина и частичной для контрольной группы составило 1,0:0,9; для серотонина оно изменилось до 1,0:1,7, а для адреналина равнялась 1,0:1,4. Фагоцитарный индекс после введения серотонина возрос относительно контрольной группы на 4,9%, в то время как на фоне адреналина он снизился на 12,4% (p < 0,01). Выявлена высокая положительная корреляционная связь между нетозом и фагоцитарным индексом для контрольной и опытной с адреналином: rxy = 0,823–0,997. Для фагоцитарного числа и нетоза в тех же группах высокая отрицательная корреляция (rxy = –0,714–(–0,871)) и заметная положительная — для серотонина (rxy = 0,638). Заключение. Серотонин и адреналин в терапевтических дозировках способны оказывать выраженное ингибирующее действие в отношении нетоза, что может открывать перспективы к повышению эффективности терапии иммуновоспалительных и онкологических заболеваний. Использование серотонина является более предпочтительным, поскольку он обладает дополнительным иммуномодулирующим действием и не вызывает прямой стимуляции α- и β-адренорецепторов.
Полный текст
Введение
Важная роль формирования внеклеточных ловушек нейтрофилов (neutrophil extracellular traps, NET) при фагоцитозе микроорганизмов, а также в патогенезе аутоиммунных заболеваний (ревматоидный артрит, системная красная волчанка, псориаз и др. [1]) определяет высокий интерес исследователей к изучению механизмов данного феномена. В работе Волкова Д.В. и соавт. [2] отмечается, что внеклеточные ловушки нейтрофилов оказывают стимулирующее влияние на рост и метастазирование солидных опухолей и в то же время за счет пространственной преграды значительно снижают эффективность CAR-T-лимфоцитарной терапии (Chimeric Antigen Receptor T-Cell). И.И. Долгушин и Е.А. Мезенцева приводят результаты исследований нетоза, способствующего переходу P. aeruginosa от высокорепликативного планктонного существования к пленочному, что предотвращает проникновение возбудителя в головной мозг мышей при инокуляции бактерий на роговицу животных и выявляет один из эволюционно закрепленных защитных механизмов [4]. Изначальное представление о том, что нетоз — одна из новых форм клеточной гибели, в последнее время значительно расширилось, поскольку обосновано его непосредственное участие в воспалении и аутоиммунитете за счет индукции образования антител, иммунных комплексов, активных форм кислорода (АФК), азота, а также выброса аларминов в виде ядерной, митохондриальной ДНК и другого внутриклеточного содержимого [3].
Определяется роль нетоза в таргетной терапии атерогенного воспаления, которая способна значительным образом снизить риски атеротромботических осложнений [10]. Все это определяет актуальность поиска эффективных и безопасных средств для управления процессами выброса хроматина и формирования NET.
Цель — изучить модифицирующее действие серотонина и адреналина в отношении нетоза при фагоцитозе у крыс.
Материалы и методы
Исследование провели на 9 крысах линии Wistar массой 270–290 г, разделенных на три равные группы. Первая группа — контроль (внутрибрюшинное (в/б) введение растворителя — физиологического раствора эквиобъемно с опытными группами). Вторая группа (опытная) — в/б введение серотонина (серотонина адипинат, раствор для введения (ООО «ЛОРР+К», Россия) из расчета 1,43 мг/кг массы тела (м.т.). Третья группа (опытная) — в/б введение адреналина (эпинефрина гидрохлорид) (ФГУП «Московский эндокринный завод», Россия) из расчета 0,143 мг/кг м.т.
Через 90 мин после введения препаратов под общим рауш-наркозом у животных из сердца отбирали кровь, которую стабилизировали гепарином с конечной концентрацией антикоагулянта 50 МЕ/мл. Образцы крови, подогретые до 37°С, смешивали в соотношении 10:1 с суспензией туши, разведенной 1:1000 физиологическим раствором и инкубировали в термостате в течение 30 мин при 37°С для оценки индуцированного нетоза и при 38°С для оценки фагоцитарной активности [7]. После инкубации кровь тщательно перемешивали и делали мазки на аппарате «Vision» (Австрия). Микропрепараты высушивали при комнатной температуре и фиксировали 25 мин при 37°С в парах формалина. Окрашивали 0,5% раствором метиленового синего в течение 2–3 мин. Оценивали процент суицидального нетоза с частичной и полной деконденсацией хроматина (ЧДХ и ПДХ), анализируя по 150 нейтрофилов на крысу. Определяли фагоцитарную активность (100 клеток на крысу), рассчитывая фагоцитарный индекс (ФИ, количество клеток, вступивших в фагоцитоз) и фагоцитарное число (ФЧ, среднее количество частиц, поглощенных клетками) с помощью микроскопа «Минимед-2». Сравнение гипотез проводили для двух связанных групп (контроль/опыт) по: парному критерию Стьюдента — для количественного признака с нормальным распределением — фагоцитарного числа; критерию Мак-Немара — для качественного дихотомического признака — нетоза (и его разновидностей: ПДХ/ЧДХ) и фагоцитарного индекса. Нормальность распределения выборки значений ФЧ проверяли по критерию Шапиро–Уилка (при уровне значимости α = 0,05). Коэффициент корреляции рассчитывали по критерию Пирсона (rxy). Данные обрабатывали в Excel, вычисляя среднее значение и стандартное отклонение М±σ (для численного значения); достоверность различий проверяли с помощью онлайн калькулятора (https://medstatistic.ru/calculators.html).
В работе с лабораторными животными придерживались правил и этических норм содержания и ухода, описанных в руководстве National Research Council, 2011 г. и ГОСТ Р53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики» с разрешения этического комитета при Институте биомедицинских исследований РАН.
Результаты и обсуждение
В ходе исследования был установлен выраженный нетоз-ингибирующий и фагоцитоз-модулирующий эффекты адреналина и серотонина в условиях in vivo (табл.).
Таблица. Результаты исследования фагоцитарной активности и индуцированного нетоза у крыс
Table. Results of rat phagocytic activity and induced NETosis
Группа Group | NET, % | ПДХ, % TCD, % | ЧДХ, % PCD, % | ФИ, % PhA, % | ФЧ, М±σ PhI | rxy (ФИ/ NET) (PhA/NET) | rxy (ФЧ/NET) (PhI/NET) |
Контроль/Control | 21,7 | 11,3 | 10,4 | 47,7 | 1,8±0,4 | 0,997 | –0,714 |
Серотонин/Serotonin | 15,7*** | 5,9*** | 9,8*** | 52,6 | 2,0±0,3 | –0,418 | 0,638 |
Адреналин/Adrenaline | 12,7*** | 5,3*** | 7,4*** | 35,3** | 1,5±0,2 | 0,823 | –0,871 |
Примечание. *** — p < 0,001; ** — p < 0,01 относительно контрольной группы по критерию Мак-Немара; статистические различия ФЧ «контроль/опыт» незначимые по парному критерию Стьюдента.
Note. *** — p < 0.001; ** — p < 0.01 compared with control group assessed by McNemar criterion; statistical differences for PhI in control/experience parameter are insignificant according to Student’s paired criterion.
Из таблицы видно, что введение биогенных аминов приводит к общему снижению образования NET и изменению морфологии самих ловушек. Из двух сравниваемых препаратов адреналин оказал более выраженное ингибирование нетоза — на 41,5% (относительно контроля), серотонин — на 27,6%. Соотношение нейтрофилов с полной деконденсацией хроматина и частичной для контрольной группы составило 1,0:0,9, в то время как для серотонина оно изменилось до 1,0:1,7, а для адреналина равнялось 1,0:1,4.
Выгодным свойством, отличающим серотонин от адреналина, явилось стимулирование фагоцитоза, который превысил показатели контрольной группы на 4,9%, что сопровождалось дополнительно увеличением фагоцитарного числа. Для адреналина падение фагоцитарной активности составило 12,4% (относительно животных контрольной группы).
По шкале Чеддока для контрольной группы и опытной с адреналином, выявляется высокая положительная корреляционная связь между нетозом и фагоцитарным индексом. Для серотонина теснота связи — умеренная, а характер корреляции — обратный. Для фагоцитарного числа и нетоза выявлена аналогичная тенденция: отрицательная высокая корреляция для контрольной группы и эпинефрина и заметная положительная корреляция для серотонина.
Обнаруженные эффекты могут быть объяснены рядом общих биологических и химических свойств серотонина и адреналина. Во-первых, обе молекулы являются активаторами тромбоцитов, которые, как известно, выступают одним из факторов врожденного иммунитета, образуя тромбоцитарно-лейкоцитарные комплексы [6]. В частности, благодаря наличию рецепторов к патогенам (например, TLR4 (Toll-like receptor) к бактериальным липополисахаридам) кровяные пластинки могут непосредственным образом изменять активность нейтрофилов, влияя на реактивность клеточного звена иммунитета [9]. Во-вторых, исследуемые биогенные амины проявляют выраженные антиоксидантные свойства и могут купировать образование АФК — пускового звена в механизме дегрануляции и выброса хроматина нейтрофилами.
Изменение фагоцитарной активности, изученное в ходе эксперимента, находится в полном соответствии с данными из научной литературы, где показано, что серотонин повышает общую фагоцитарную активность [8], а катехоламины, наоборот, ее снижают [5]. Результаты корреляционного анализа проявляют механизм образования ловушек нейтрофилов с серотонином, отличный от контрольной группы и опытной, подвергнутой воздействию адреналина. Отличительным признаком животных, получавших серотонин, является повышение фагоцитарной активности на фоне снижения NET.
Таким образом, серотонин и адреналин в терапевтических дозировках способны оказывать выраженное ингибирующее действие в отношении нетоза, что может открывать перспективы к повышению эффективности терапии иммуновоспалительных и онкологических заболеваний. Использование серотонина является более предпочтительным, поскольку он обладает дополнительным иммуномодулирующим действием, повышая фагоцитарную активность нейтрофилов, и не вызывает прямой стимуляции α- и β-адренорецепторов.
Об авторах
Сергей Валерьевич Скупневский
Институт биомедицинских исследований — филиал ФГБУН Федерального научного центра «Владикавказский научный центр Российской академии наук»
Автор, ответственный за переписку.
Email: dreammas@yandex.ru
д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории субклеточных структур отдела молекулярных и клеточных механизмов аутоиммунных заболеваний
Россия, РСО-Алания, г. ВладикавказР. В. Савельев
Институт биомедицинских исследований — филиал ФГБУН Федерального научного центра «Владикавказский научный центр Российской академии наук»
Email: dreammas@yandex.ru
старший лаборант лаборатории субклеточных структур отдела молекулярных и клеточных механизмов аутоиммунных заболеваний
Россия, РСО-Алания, г. ВладикавказСписок литературы
- Бедина С.А., Мозговая Е.Э., Трофименко А.С., Мамус М.А., Спицина С.С., Зборовская И.А. Внеклеточные ловушки нейтрофилов: динамика образования, ассоциированная с переходом от ремиссии к активному ревматоидному артриту // Сибирское медицинское обозрение. 2022. № 6. С. 86–92. [Bedina S.A., Mozgovaya E.E., Trofimenko A.S., Mamus M.A., Spitsyna S.S., Zborovskaya I.A. Neutrophil extracellular traps: formation dynamics associated with the transition from remission to active rheumatoid arthritis. Sibirskoe meditsinskoe obozrenie = Siberian Medical Review, 2022, no. 6, pp. 86–92. (In Russ.)] doi: 10.20333/25000136-2022-6-86-92
- Волков Д.В., Тец Г.В., Рубцов Ю.П., Степанов А.В., Габибов А.Г. Внеклеточные ловушки нейтрофилов (NET): перспективы таргетной терапии // Acta Naturae. 2021. № 3. С. 15–23. [Volkov D.V., Tets G.V., Rubtsov Yu.P., Stepanov A.V., Gabibov A.G. Extracellular neutrophil traps (NET): prospects for targeted therapy. Acta Naturae, 2021, no. 3, pp. 15–23. (In Russ.)]
- Воробьева Н.В. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: новые аспекты // Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. 2020. Т. 75, № 4. С. 210–225. [Vorob’eva N.V. Neutrophil extracellular traps: new aspects. Vestnik Moskovskogo universiteta. Seriya 16. Biologiya = Herald of Moscow University. Series 16. Biology, 2020, vol. 75, no. 4, pp. 210–225. (In Russ.)]
- Долгушин И.И., Мезенцева Е.А. Нейтрофильные внеклеточные ловушки в борьбе с биопленкообразующими микроорганизмами: охотники или добыча? // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020. Т. 97, № 5. C. 468–481. [Dolgushin I.I., Mezentseva E.A. Neutrophil extracellular traps in the fight against biofilm-forming microorganisms: hunters or prey? Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 2020, vol. 97, no. 5, pp. 468–481. (In Russ.)] doi: 10.36233/0372-9311-2020-97-5-9
- Кривохижина Л.В., Осиков М.В. Современные представления о регуляции неспецифической защиты в организме // Человек. Спорт. Медицина. 2005. Т. 1, № 4 (44). С. 88–94. [Krivokhizhina L.V., Osikov M.V. Modern ideas about the regulation of nonspecific protection in the body. Chelovek. Sport. Meditsina = Human. Sport. Medicine, 2005, vol. 1, no. 4 (44), pp. 88–94. (In Russ.)]
- Павлов О.В., Чепанов С.В., Селютин А.В., Сельков С.А. Тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия: иммунорегуляторная роль и патофизиологическое значение // Медицинская иммунология, 2022. Т. 24, № 5. С. 871–888. [Pavlov O.V., Chepanov S.V., Selutin A.V., Selkov S.A. Platelet-leukocyte interactions: immunoregulatory role and pathophysiological relevance. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2022, vol. 24, no. 5, pp. 871–888. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-PLI-2511
- Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2012. 944 с. [Guidelines for Conducting Preclinical Trials of Medicines. Part one / Ed. by A.N. Mironov. Moscow: Grif and K, 2012. 944 p. (In Russ.)]
- Herr N., Bode C., Duerschmied D. The effects of serotonin in immune cells. Front. Cardiovasc. Med., 2017, no. 4: 48. doi: 10.3389/fcvm.2017.00048
- Rai G. NETosis: Immunity, pathogenesis and therapeutics drug development. Academic Press, 2019. 200 p.
- Van A.K., Maegdefessel L., Soehnlein O. Therapeutic targeting of neutrophil extracellular traps in atherogenic inflammation. Thromb. Haemost., 2019, vol. 119, no. 4, pp. 542–552. doi: 10.1055/s-0039-1678664