Изучение каталазной активности микросимбионтов женского репродуктивного тракта хронобиологическим методом

Полный текст

Введение

Микробный биоценоз как совокупность бактериально-грибковых ассоциаций функционирует за счет различных биологических механизмов, обеспечивающих рост, размножение микросимбионтов, распределение их в экотопе и различные взаимодействия внутри популяции. Регулирование и формирование микробиоценоза в системе ассоциативного симбиоза основано на явлении антагонизма с одной стороны, продукция бактериями бактериоцинов, с другой — синтез лизоцима, органических кислот и перекиси водорода макроорганизмом [1].

В связи с этим возникает вопрос о влиянии биологически активных веществ доминантной, ассоциативной микробиоты на отдельные ферменты, обеспечивающие защиту микросимбионтов от стрессовых воздействий со стороны, как микробной ассоциации, так и макроорганизма. Одним из таких ферментов является каталаза, защищающая бактериальную клетку от действия перекиси водорода эндогенного и экзогенного происхождения [11].

Решение вопроса о способности микроорганизмов влиять на активность каталазы позволило бы расширить представления о роли различных видов автохтонных и аллохтонных микросимбионтов в формировании микробных биоценозов организма человека. На наш взгляд, хронобиологический подход к изучению данной проблемы открывает новые возможности в раскрытии механизмов межмикробных взаимодействий, а также позволяет разработать дополнительные критерии состояния здоровья пациента.

Цель — изучить каталазную активность микросимбионтов женского репродуктивного тракта при нормоценозе и кандидозном дисбиозе хронобиологическим методом.

Материалы и методы

Для выявления межмикробных взаимодействий микроорганизмов было изучено 10 микросимбиоценозов женского репродуктивного тракта (5 — нормоценозов и 5 — кандидозных дисбиозов), изолировано 45 культур микроорганизмов, представителей облигатно- и факультативно анаэробной микробиоты пациентов в возрасте от 19 до 35 лет (Решение Комитета по этике при ФГБОУ ВО Тюменского государственного медицинского университета № 102 от 22.10.2021 г.). Женщины имели регулярный менструальный цикл, в анамнезе отсутствовали гинекологические оперативные вмешательства, аборты, выкидыши, гормональная терапия, инфекционные заболевания, передаваемые половым путем (ВИЧ-инфекция, сифилис, гонорея, трихомониаз, хламидиоз). Видовая идентификация микросимбионтов проводилась методом времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) по протеиновым профилям.

Микробная ассоциация при нормобиозе биотопа включала Lactobacillus crispatus (L. crispatus), Enterococcus faecalis (E. faecalis) и Enterococcus faecium (E. faecium). При дисбиозе преобладали Lactobacillus iners (L. iners), Lactobacillus jensenii (L. jensenii), Enterococcus faecalis (E. faecalis) и Enterococcus faecium (E. faecium), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli (E. coli), Сandida albicans (С. albicans).

Активность каталазы определяли спектрофотометрическим методом по убыли пероксида водорода в течение суток с 3-часовым интервалом [3] в зимнее время года, IV фаза Луны. К 0,2 мл взвеси микроорганизмов добавляли 1 мл раствора перекиси водорода с концентрацией 0,0120 М, инкубировали 10 мин при комнатной температуре, затем прибавляли 0,2 мл раствора хлористоводородной кислоты с концентрацией 2 М и 1 мл раствора калия йодида с концентрацией 0,025 М, перемешивали, центрифугировали в режиме 3000 об/мин и 15 мин, после чего измеряли оптическую плотность надосадочной жидкости не позднее 10 мин после центрифугирования при длине волны 492 нм. Контрольный опыт готовили по аналогичной процедуре, без добавления взвеси микроорганизмов. Раствор сравнения при спектрофотомерии — вода очищенная.

Данные были обработаны по методу наименьших квадратов (косинор-анализ) при заданной значимости достоверности p < 0,05 [9]. Для каждого штамма впоследствии определены основные параметры ритмов с периодами Т = 12 и Т = 24 часа: мезор (M) — среднее значение гармонической кривой наилучшей аппроксимации функции (косинусоиды), амплитуда ритма (A) — расстояние от экстремума до мезора и акрофаза (f) — момент времени ожидаемого экстремума функции.

Статистическую обработку материалов осуществляли с использованием программ: Primer of Biostatics Version 4.03 by Stanton A. Glantz, 1998; Microsoft Office Excel 2010.

Результаты и обсуждение

Микробиота женского репродуктивного тракта — уникальная модель для изучения межмикробных взаимоотношений при ассоциативном симбиозе, так как это равновесная динамическая система организма человека и населяющей его доминантной и ассоциативной микрофлоры. Важнейшими представители облигатной доминантной микробиоты влагалища являются Lactobacillus spp., поддерживающие нормальный микроэкологический статус занимаемого биотопа.

По данным авторитетных исследований, у многих строгих и аэротолерантных анаэробов отсутствует продукция каталазы [2]. К их числу относят молочнокислые бактерии, у которых дисмутацию образующихся ионов кислорода обеспечивают ионы магния, находящиеся в клетках в высоких концентрациях [4].

В пилотных экспериментах традиционный тест на расщепление 3% перекиси водорода культурами L. crispatus, L. iners, L. jensenii, E. faecalis, E. faecium показал отрицательный результат. Отсутствие каталазы у молочнокислых бактерий и энтерококков связано с тем, что они не могут синтезировать гем-простетическую группу фермента, но способны к синтезу апофермента [6]. У отдельных видов молочнокислых бактерий обнаружена каталаза, не содержащая гемовой группы — псевдокаталаза [8].

Высокочувствительный хронобиологический метод позволил выявить активность такого фермента у всех изучаемых культур микросимбионтов. Доминантная и ассоциативная микробиота, выделенная от здоровых женщин, характеризовалась циркадианными (околосуточными) ритмами каталазной активности с одним пиком в ранние утренние часы — 5:00. Вклад циркадианного ритма составил 79,3–84,5% (р < 0,05). Для всех культур Lactobacillus spp. и Enterococcus spp. характерен одинаковый профиль ритма. Мезор и амплитуда каталазной активности как стабильные ритмометрические параметры не зависели от вида микроорганизма в популяции. Чем больше амплитуда, тем труднее индуцировать сдвиг акрофазы [10]. Результаты представлены на рис. 1.

 

Рисунок 1. Суточная динамика активности каталазы микросимбионтов женского репродуктивного тракта у здоровых женщин

Примечание. По оси абсцисс — время суток, часы; по оси ординат — активность каталазы, мкмоль/мин.

Figure 1. Diurnal dynamics of microsymbiont catalase activity in healthy female reproductive tract

Note. X-axis — time of day, hours; Y-axis — catalase activity, mmol/min.

 

Следовательно, при доминировании в биотопе анаэробных прокариот L. сrispatus 10⁶–10⁷ КОЕ/мл, E. faecalis и E. faecium 10²–10³ КОЕ/мл, способных переносить контакт с кислородом и его производными в относительно небольших масштабах, роль каталазы незначительная, с одним пиком активности в утренние часы. Перекись водорода разлагается спонтанно или с участием неферментативных катализаторов, и микроорганизмы справляются с ней в этих условиях. Таким образом, при осуществлении энергетического метаболизма анаэробного типа для устранения токсических эффектов кислорода достаточно одной ферментной преграды в виде супероксиддисмутазы [5].

У микросимбионтов, характерных для дисбиоза женского репродуктивного тракта и обычно обнаруживаемых в большом количестве на фоне снижения Lactobacillus spp. регистрировались ультрадианные ритмы с 12- и 8-часовыми гармониками каталазной активности с акрофазой в утренние и вечерние часы (8:00; 20:00). Минимальные значения продукции фермента у всех культур фиксировались в 12:00 и 17:00 часов (рис. 2).

 

Рисунок 2. Суточная динамика активности каталазы микросимбионтов женского репродуктивного тракта у женщин с кандидозным дисбиозом

Примечание. По оси абсцисс — время суток, часы; по оси ординат — активность каталазы, мкмоль/мин.

Figure 2. Diurnal dynamics of microsymbiont catalase activity in female reproductive tract during candidiasis dysbiosis

Note. X-axis — time of day, hours; Y-axis — catalase activity, mmol/min.

 

Экспериментально доказано повышение среднесуточных показателей синтеза фермента в 6–8 раз у всех ассоциантов в микросимбиоценозе (р < 0,05) в опытной группе при дисбиотических изменениях изучаемого биотопа, по сравнению с контрольной группой. Таким образом, мезор и амплитудно-фазовая стабильность являются диагностическими критериями состояния биотопа пациента.

При увеличении в популяции факультативно-анаэробных прокариот E. faecalis, E. faecium, K. рneumonia, S. аureus, E. coli, С. аlbicans в 10⁵–10⁶ КОЕ/мл и снижение числа L. iners, L. jensenii до 10³–10⁴ КОЕ/мл неферментативные пути устранения перекиси водорода становятся не эффективными. Для разложения субстрата, необходима каталаза, проявляющая активность с периодичностью в 8–12 часов. Таким образом, в условиях активного взаимодействия клеток с кислородом, делающего возможным аэробную жизнь, система ферментной защиты от его токсических эффектов сформирована с участием супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы в качестве необходимых компонентов.

Вероятно, в биотопе женщин с 3–4 степенью чистоты влагалища анаэробные бактериальные клетки координируют экспрессию фактора патогенности, обеспечивающую многообразные формы существования с помощью системы QS [7] за счет облигатно- и факультативно-аэробных прокариот [6].

Выводы

Хронобиологический метод позволил выявить активность фермента у всех микросимбионтов, выделенных из женского репродуктивного тракта.

Доказано, что вклад ритма изучаемого показателя при различной степени чистоты влагалища отражает адаптационные возможности патогенов к условиям существования и может служить методическим ключом при изучении механизмов их регуляции.

Мезор и амплитудно-фазовая стабильность каталазной активности микросимбионтов являются универсальными ритмометрическими параметрами, оценивающими состояние пациента, и не зависят от видовой принадлежности культуры.

Благодарности

Коллектив авторов выражает благодарность Тюменскому ГМУ за предоставленное финансирование и директору ФБУН ТНИИКИП Роспотребнадзора Т.Ф. Степановой за проведенную идентификацию культур.

 

Исследование проведено в рамках гранта Тюменского ГМУ в области биомедицинских и биофармацевтических технологий № 8210053 от 12 августа 2021 г.

The study was supported by the grant of Tyumen State Medical University in biomedical and biopharmaceutical technologies No. 8210053 (August 12, 2021).

Об авторах

Марина Викторовна Николенко

ФГБОУ ВО Тюменский государственный медицинский университет Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: nikolenko-marina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1099-0656

д.б.н., профессор кафедры микробиологии, зав. лабораторией микробиома, регенеративной медицины и клеточных технологий

Россия, Тюмень

Екатерина Михайловна Васева

ФГБОУ ВО Тюменский государственный медицинский университет Минздрава России

Email: yuga-21@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5556-3180

к.фарм.н., доцент кафедры фармацевтических дисциплин 

Россия, Тюмень

Наталья Викторовна Барышникова

ФГБОУ ВО Тюменский государственный медицинский университет Минздрава России

Email: barnv7600@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6458-4920

старший преподаватель кафедры микробиологии 

Россия, Тюмень

Ольга Ивановна Малишевская

ФГБОУ ВО Тюменский государственный медицинский университет Минздрава России

Email: olgaivan1988@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8709-5281

к.фарм.н., доцент кафедры фармацевтических дисциплин

Россия, Тюмень

Список литературы

Дополнительные файлы