Филогенетический анализ гена uge Klebsiella pneumoniae в локальном микробиологическом мониторинге

Полный текст

Введение

Klebsiella pneumoniae — это типичный представитель семейства Enterobacteriaceae, который может обладать широким спектром генетических детерминант антибиотикорезистентности и факторов вирулентности. Бессимптомные носители K. pneumoniae выделяют бактериальные клетки и являются источниками инфекционных агентов, способствуя их распространению во внутрибольничной среде. С этим микроорганизмом связывают как внутрибольничное инфицирование госпитализированных лиц в стационары хирургического, ожогового, неврологического, терапевтического профилей, так и эпидемические вспышки в неонатальных отделениях [2, 11]. Из двух эволюционно сложившихся линий K. pneumoniae наиболее частыми возбудителями инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), являются штаммы классического патотипа в отличие от гипервирулентного — с которым ассоциированы внебольничные случаи инвазивных процессов (абсцесс печени, менингит), эндофтальмита [1]. В настоящее время в литературе описано 16 генов, кодирующих синтез факторов вирулентности, имеющих разный вклад в реализацию патогенного потенциала [3, 17]. Одним из них является ген uge хромосомной локализации, кодирующий синтез уридиндифосфатгалактуронат-4-эпимеразу, который принимает участие в колонизации, инвазии и реализации патогенности штаммов K. pneumoniae [12].

Ген uge является распространенным геном фактора вирулентности и частота его встречаемости, согласно результатам некоторых исследований превышает 90% [7, 18]. Однако нет единых сведений по частоте встречаемости штаммов с uge, выделенных из разных локусов человеческого организма. По данным одних авторов, он детектировался чаще (p = 0,03) в штаммах, выделенных из мочи, чем из образцов крови и аспирата трахеи, что может указывать на возможную роль этого гена в развитии инфекций мочевыводящих путей [5]. Другие авторы описывают, что в исследовании, проведенном в 2018–2019 гг. в Бангладеш, распространенность гена uge среди штаммов, K. pneumoniae, выделенных как из проб мочи, так и аспирата трахеи была одинаковой и составила 47% [16].

В статье Su S. и соавт. (2020 г.), указано, что ген uge был детектирован во всех исследуемых штаммах, выделенных от пациентов лечебного учреждения в Северо-Восточном Китае [14]. Другая группа исследователей обнаружила ген uge в 16% изученных антибиотикорезистентных штаммах в одном из госпиталей Малайзии [8]. Сиквенс-типы, выявленные в РФ впервые в период 2017–2019 гг. также несли ген uge в 85,7% [6].

Изоляты с гиперпродукцией слизи (гипервирулентный патотип) также содержат ген uge в 85,7% случаев [10]. Реализация генетической информации определяется воздействием как внутренних, так и внешних факторов. В штаммах, выделенных из проб морской воды Сиамского залива, NaCl в концентрации 4% блокировал экспрессию указанного гена, детектированного в 47,9% [9].

Подробная характеристика генетического аппарата изолятов позволяет оценивать внутривидовое разнообразие микроорганизмов и формирование эволюционных эпидемически и клинически значимых линий K. pneumoniae. Современные методы высокопроизводительного секвенирования способствуют проведению эпидемического наблюдения за циркуляцией штаммов как в глобальном масштабе, так и на локальном уровне, однако остаются недоступными для широкого применения. Открытым остается вопрос об идентичности штаммов со сходными фенотипическими свойствами, выделенных из разного клинического материала, например, фекалии, кровь, от одного и того же человека и от разных пациентов учреждения. Это диктует необходимость проведения внутривидовой дифференциации выделенных штаммов.

В настоящей работе продемонстрирована возможность использования молекулярно-генетических методов исследования (ПЦР, секвенирование с последующим филогенетическим анализом) в оценке гетерогенности популяции штаммов K. pneumoniae, выделенных от пациентов лечебного учреждения, установлении степени генетического родства изолятов, полученных в парах мать–ребенок, и применения полученных результатов в эпидемиологическом надзоре за распространением потенциальных возбудителей ИСМП во внутрибольничной среде.

Цель исследования: оценить результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена uge штаммов K. pneumoniae в перинатальном центре.

Материалы и методы

В период с 01.01.2020 по 09.03.2023 исследована 5351 проба фекалий, 10 249 проб отделяемого из цервикального канала, 104 пробы отделяемого из зева, 1928 образцов крови, 998 образцов мочи. В ходе локального еженедельного микробиологического мониторинга выделен 551 штамм K. pneumoniae от новорожденных детей (545 из фекалий и 6 из крови) и 168 — от женщин (144 штамма из отделяемого цервикального канала, 4 — из зева, 20 — из мочи). Проанализировано 56 нуклеотидных последовательностей гена uge K. pneumoniae, в том числе депонированной в GenBank под номером MZ395252 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank).

Клинический материал для исследования собирали и транспортировали в стерильных контейнерах и пробирках с транспортной средой. Для культивирования бактерий посев материала выполняли на среду Эндо (ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск), кровяно-сывороточный агар (основа —Conda, Испания; эритроциты барана, ЗАО «ЭКОлаб»; сыворотка крови крупного рогатого скота, ООО «БиолоТ»). Идентификацию K. pneumoniae и определение антибиотикочувствительности проводили на автоматическом анализаторе «VITEK 2 compact» (bioMérieux, Франция, входит в перечень оборудования ЦКП «Инновационный научно-лабораторный центр перинатальной и репродуктивной медицины» ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России) согласно инструкции производителя.

ДНК бактериальных клеток выделяли из взвеси 18-часовой культуры с использованием набора ДНК-экспресс (ООО «Синтол») согласно инструкции производителя. Ген uge детектировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров (5'-TCTTCACGCCTTCCTTCACT-3', 5'-GATCATCCGGTCTCCCTGTA-3') и реагентов производства ООО «Синтол». Визуализацию ПЦР продуктов осуществляли в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I в режиме реального времени на детектирующем амплификаторе «ДТ лайт» (ДНК-Технологии). В состав раствора для амплификации входили 50 мкл реакционной смеси: 2,5х ПЦР буфер Б (KCl, ТрисНCl (pH 8,8), 6,25 мМ MgCl2), Syn-Taq ДНК-полимераза, глицерол, Tween 20; дезоксинуклеозидтрифосфаты, 7 мкл dd H2O, 25 мМ MgCl2, по 1 мкл каждого праймера и 2,5 мкл образца ДНК. Режим амплификации: первоначальная денатурация в течение 5 мин при температуре 95°C, последующие 35 циклов: 94°C — 15 с; отжига праймеров при температуре 55°C для uge в течение 20 с; элонгации при температуре 72°C в течение 30 с; завершающим этапом каждого цикла была детекция продуктов амплификации.

Секвенирование гена uge проводили по методу Сенгера [13]. Полученные последовательности типировали с использованием Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Выравнивание нуклеотидных последовательностей на часть референсного генома KPHS_35510, кодирующего уридиндифосфат-галактуронат-4-эпимеразу [Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae HS11286, (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/11848582)]. Последующий филогенетический анализ проводили с использованием программы Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA), версия 6 [15].

Филограмма была построена по алгоритму «ближайшего соседа» (Neighbor-Joining) и включала нуклеотидные последовательности, депонированные в GenBank.

Расчет эволюционных дистанций между последовательностями производили согласно двухпараметрической модели М. Кимуры (Kimura 2-parameter). Статистическую значимость топологии филограмм оценивали методом повторных выборок на основании анализа 1000 псевдореплик. Достоверными считали построения дендрограммы при индексе в узлах не менее 70.

Результаты

Частота встречаемости штаммов K. pneumoniae в клиническом материале от пациентов представлена в табл. 1.

 

Таблица 1. Частота встречаемости штаммов K. pneumoniae в образцах фекалий новорожденных детей и пробах отделяемого цервикального канала в 2020–2023 гг.

Table 1. The 2020–2023 prevalence of K. pneumoniae strains in neonatal fecal and cervical canal discharge samples

Материал Material	2020			2021			2022			2023
	Кол-во проб Number of samples	K. pneum.		Кол-во проб Number of samples	K. pneum.		Кол-во проб Number of samples	K. pneum.		Кол-во проб Number of samples	K. pneum.
		абс. abs.	%		абс. abs.	%		абс. abs.	%		абс. abs.	%
Фекалии Feces	1796	220	12,2	1669	213	12,8	1477	55	3,7	409	57	13,9
Отделяемое цервикального канала Cervical discharge	3239	58	1,8	3578	42	1,7	2775	36	1,3	657	8	1,2

 

Как видно из представленных в таблице данных, частота встречаемости штаммов K. pneumoniae среди пациентов отделений родовспоможения акушерско-гинекологического профиля составила в среднем 1,4% в 2020–2023 гг. среди женщин. В стационарах педиатрического профиля выделение штаммов в диапазоне 12–14% регистрируется в 2020, 2021 и 2023 гг. В 2022 г. зарегистрировано четырехкратное снижение выявляемых штаммов K. pneumoniae.

Филогенетический анализ показал, что нуклеотидные последовательности достоверно сгруппировались в 14 кластеров (рис.).

 

Рисунок. Филогенетическое дерево штаммов K. pneumoniae, построенное при анализе нуклеотидных последовательностей гена uge (362 нт)

Figure. Phylogenetic tree for K. pneumoniae strain uge gene nucleotide sequences (362 nt)

 

Штаммы, входящие в один кластер являются генетически более близкими между собой, в сравнении с изолятами, расположенными в разных кластерах.

Первый кластер объединяет штаммы с повышенной вирулентностью серотипа К-1, описанные в исследовании Лев А.И. (2018 г.). В него вошел продуцирующий бета-лактамазу расширенного спектра действия (БЛРС) изолят из Екатеринбурга, имеющий ген rmpA, ассоциированный с гиперпродукцией слизи, выделенный в 2021 г. из пробы фекалий, полученной от 19-летней беременной женщины на 31–32 неделе гестации, госпитализированной в родовое отделение.

Во второй кластер вошли карбапенемаза продуцирующие (blakpc+) штаммы, выделенные из отделяемого цервикального канала 31-летней женщины на 31 неделе беременности. Следует отметить, что нуклеотидные последовательности не являются идентичными, что согласуется с разной фенотипической характеристикой: колонии одного изолята были малинового цвета, а другого — розового.

Несмотря на то что БЛРС-продуцирующие штаммы 662, 665, выделенные из отделяемого цервикального канала 38-летней пациентки на сроке беременности 31 неделя, при посеве последа и из кала ее ребенка в возрасте 4 суток, не сформировали отдельный кластер, идентичность их нуклеотидных последовательностей анализируемого бактериального гена составила 100%.

Третий кластер включает идентичные штаммы, выделенные из мочи беременной женщины (даты сбора: 28.01.2021 и 26.03.2021) и фекалий ее новорожденного ребенка, собранных на 5 сутки после рождения. При этом следует отметить, что при посеве отделяемого цервикального канала (27.04.2021, 25.03.2021, 07.05.2021), посеве крови и содержимого трахеобронхиального дерева новорожденного ребенка на 1 сутки жизни рост микроорганизмов не обнаружен.

Штаммы, сгруппировавшиеся в четвертом, шестом, девятом, десятом, одиннадцатом и тринадцатом кластерах, описаны нами ранее под VI, I, II, V, IV, VII номерами соответственно [4]. Девятый (II) и одиннадцатый (IV) кластеры, так же как и охарактеризованные ранее, содержат штаммы, выделенные в 2019 г., они пополнились штаммами, выделенными из фекалий новорожденного ребенка и из отделяемого цервикального канала в 2021, 2022 гг. Штаммы, генетически близкие изолятам из четвертого (VI), шестого (I), десятого (V) и тринадцатого (VII) кластеров не удалось выделить на протяжении 2020–2023 гг.

Штамм, выделенный из фекалий новорожденного ребенка в возрасте 6 суток, родившегося на 35 неделе, вместе с генетически близким штаммом КХ954850, обнаруженным в мокроте пациента с пневмонией (Оболенск), сформировали пятый кластер.

K. pneumoniae 601, колонизировавшая кишечник новорожденного ребенка в возрасте 12 суток, рожденного на 34 неделе гестации, оказалась со штаммами KX954849, KP760055, выделенными из пробы мочи (Оболенск, 2013 и 2014 гг.), в седьмом кластере.

Восьмой кластер демонстрирует генетическое родство штаммов, выделенных из разных локусов (кровь, фекалии) одного пациента, что позволяет с высокой долей вероятности предполагать о проникновении возбудителя в кровеносное русло путем трансцитоза через кишечную стенку. Это еще раз подтверждает необходимость проведения локального микробиологического мониторинга в отделениях недоношенных новорожденных детей для установления видов микроорганизмов, колонизирующих кишечный биотоп, как наиболее вероятных возбудителей позднего сепсиса для выбора адекватной тактики антибиотикотерапии.

Группа бактерий № 639, 629, 628, 643 не сформировала отдельный кластер, но содержит идентичные последовательности изолятов, выделенных из отделяемого цервикального канала, последа, крови обоих детей из двойни. Следует отметить, что штаммы из гемокультуры выделены на первые сутки жизни детей, что подтверждает внутриутробное инфицирование и определяет этиологический агент раннего неонатального сепсиса, закончившегося летально для обоих новорожденных.

Двенадцатый кластер представлен штаммом из отделяемого цервикального канала женщины 23 лет с длительным безводным промежутком в первом периоде срочных родов (2020 г.). Наиболее генетически близкий вариант СР035196 был выделен в Лаосе в 2012 г.

Четырнадцатый кластер объединил штаммы 2020 г. от матери и ее новорожденного ребенка, которые были наиболее генетически близки изоляту CP065831, выделенному из мочи в США в 2018 г.

Сравнительный анализ аминокислотных замен гена uge в штаммах K. pneumoniae, изолированных в период 2019–2023 г. с референсной последовательностью KPHS_35510, кодирующего уридиндифосфат-галактуронат-4-эпимеразу [Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae HS11286], представлен в табл. 2. Жирным шрифтом выделены аминокислотные замены, отличающие гипервирулентные штаммы от других.

 

Таблица 2. Сравнительный анализ аминокислотных замен гена uge в штаммах K. pneumoniae, изолированных в период 2019–2023 гг.

Table 2. 2019–2023 Comparative analysis of amino acid substitutions in the K. pneumoniae uge gene strains

Ам. Am.

P157L

I163T

P166L

I167T

A170V

P173L

Q180R

F181C

G185R

C192Y

S194N

E202G

V204A

S214N

S217L

F228C

G229A

R231W

P237R

A245T

P247L

R248Q

P249Q

A251V

I255T

Y257S

H264S

Q265R

P273L

P274L

R277K

R278K

N279L

E280G

S290F

E293A

Реф Ref.

P

I

P

I

A

P

Q

F

G

C

S

E

V

S

S

F

G

R

P

A

P

R

P

A

I

Y

H

Q

P

P

R

R

N

E

S

E

1

P

I

P

T

A

P

R

F

G

C

S

E

V

S

S

F

G

R

P

A

P

R

Q

A

I

Y

H

Q

P

L

R

R

L

E

F

A

2

P

I

P

T

A

P

Q

C

G

C

S

E

V

S

S

F

G

R

P

A

P

R

P

A

I

Y

H

Q

P

L

R

R

N

E

F

A

3

L

T

L

T

A

P

Q

F

R

C

S

E

V

S

S

F

G

R

P

A

P

R

P

A

I

Y

H

Q

P

P

R

R

N

E

S

E

4

P

I

P

I

A

P

R

F

G

C

S

E

V

S

S

F

G

R

P

A

P

R

P

V

I

Y

H

Q

P

P

R

K

N

E

S

E

5

L

T

L

T

A

P

Q

C

G

C

S

E

V

S

S

F

G

R

P

A

P

R

P

A

T

Y

H

R

P

P

R

R

N

E

S

E

6

L

T

P

T

A

L

Q

C

G

C

S

E

A

S

S

F

G

W

P

A

P

R

P

A

T

Y

H

Q

L

P

R

R

N

G

S

E

7

L

T

L

T

A

P

Q

F

G

C

S

E

V

S

S

F

G

R

P

A

P

R

L

A

T

Y

H

Q

L

P

R

R

N

G

S

E

8*

P

I

P

I

A

P

R

F

G

C

S

E

V

S

S

F

G

R

P

A

P

R

P

A

T

Y

H

Q

L

P

R

R

N

K

F

A

9

L

T

P

T

A

P

Q

C

G

C

S

E

V

S

S

F

G

R

P

A

P

R

P

A

I

Y

H

R

P

P

R

R

N

E

S

E

10*

L

T

L

T

A

P

Q

F

G

C

S

E

V

S

S

F

G

R

P

A

P

R

P

A

I

Y

H

Q

L

P

R

R

N

G

S

A

11

L

T

P

T

A

P

Q

C

G

C

S

E

V

S

S

F

G

R

P

A

P

R

P

A

I

S

R

Q

P

L

R

R

N

G

S

A

12

L

I

L

T

A

P

Q

F

G

C

S

E

V

N

L

C

A

R

R

T

L

R

P

A

I

Y

H

Q

P

P

R

R

N

G

S

E

13

L

T

P

T

V

P

Q

F

G

C

S

E

A

S

S

F

G

R

P

T

L

R

P

A

I

Y

H

Q

P

P

R

K

N

E

F

A

14

L

T

L

T

A

P

Q

C

G

Y

N

G

V

S

S

F

G

R

P

A

P

R

P

A

I

Y

H

Q

P

P

R

R

N

E

S

E

Примечание. * — штамм, входящий в кластер, вызвал генерализованную инфекцию; Ам — аминокислотные замены; Реф. — референсная аминокислотная последовательность.

Note. * — a strain in the cluster caused a generalized infection; Am — amino acid substitutions; Ref. — reference amino acid sequence.

 

Обсуждение

В среднем частота встречаемости штаммов K. pneumoniae среди пациентов учреждения родовспоможения, установленная в ходе микробиологического мониторинга составила 1,4% в 2020–2023 г. среди женщин, 12,5% в 2020–2021 гг., 3,7% в 2022 г. и 13,9% в 2023 г. среди детей. Отмечается одинаковая распространенность штаммов из отделяемого цервикального канала и четырехкратное снижение выявление штаммов из фекалий детей в 2022 г. по сравнению с 2020, 2021 гг. с последующим увеличением частоты обнаружения до 13,9% в первом квартале 2023 г.

Согласно проведенным нами исследованиям, ген фактора вирулентности K. pneumoniae uge, в изучаемых штаммах регистрируется на уровне 64,3%. В наших предыдущих публикациях мы описывали результаты филогенетического анализа гена uge штаммов K. pneumoniae, выделенных до 2021 г. [4]. В данном исследовании представляем результаты мониторинга штаммов и изучение их гетерогенности за пятилетний период (2019–2023 гг.).

Существуют кластеры, объединяющие геноварианты бактерий, выделенные в 2019 г. и не пополнившиеся новыми изолятами, что подтверждает эффективность проводимых противоэпидемических мероприятий, усиленных в период распространения новой коронавирусной инфекции, исключающих передачу инфекционного агента от источника восприимчивому организму во внутрибольничной среде.

Определены аминокислотные замены в гене uge P249Q, N279L, отличающие гипервирулентные штаммы от тех, которые имеют меньшую степень патогенности, что может быть использовано в индикации клинически значимых изолятов.

Колонизация кишечника новорожденного ребенка, штаммом, идентичным выделенному из мочи его матери и не обнаруженному при исследовании отделяемого цервикального канала, свидетельствует о проникновении в организм ребенка бактерий из мочевыделительной системы матери.

В одной паре мать–ребенок штаммы K. pneumoniae принадлежали разным кластерам. Изолят, выделенный 06.09.2021 г. из фекалий новорожденного ребенка (7 суток), группировался со штаммами, выделенными от пациентки родового отделения 12.12.2020 г. и в Лаосе в 2013 г. (CP035196). K. pneumoniae, выявленная 04.06.2021 г. в моче женщины, достоверно группировалась со штаммами, вошедшими в 13 кластер. Следует отметить, что в период с 04.06.2021 г. по 06.09.2021 г. в ходе бактериологического исследования K. pneumoniae не обнаружена ни в моче, ни в отделяемом цервикального канала описанной пациентки.

Таким образом, продемонстрирована возможность совершенствования локального микробиологического мониторинга с применением молекулярно-генетических методов исследования и использования результатов секвенирования и филогенетического анализа гена uge K. pneumoniae в эпидемиологическом надзоре за внутрибольничным распространением штаммов. Оценка изменения внутривидовой популяционной структуры возбудителей ИСМП необходима для своевременного и обоснованного реагирования на ухудшение эпидемиологической ситуации.

Об авторах

Александр Владимирович Устюжанин

ФГБУ НИИ охраны материнства и детства Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: ust103@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8521-7652

кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник отделения иммунологии, микробиологии, патоморфологии и цитодиагностики

Россия, 620089, Екатеринбург, ул. Репина, 1

Гузель Нуховна Чистякова

ФГБУ НИИ охраны материнства и детства Минздрава России

Email: 7@niiomm.ru
ORCID iD: 0000-0002-0852-6766

доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения иммунологии, микробиологии, патоморфологии и цитодиагностики

Россия, 620089, Екатеринбург, ул. Репина, 1

Ирина Ивановна Ремизова

ФГБУ НИИ охраны материнства и детства Минздрава России

Email: remizovaii@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4238-4642

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отделения иммунологии, микробиологии, патоморфологии и цитодиагностики

Россия, 620089, Екатеринбург, ул. Репина, 1

Анна Алексеевна Маханёк

ФГБУ НИИ охраны материнства и детства Минздрава России

Email: makhanechek@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-2834-6754

младший научный сотрудник отделения иммунологии, микробиологии, патоморфологии и цитодиагностики

Россия, 620089, Екатеринбург, ул. Репина, 1

Список литературы

Дополнительные файлы