Гуморальный иммунный ответ после иммунизации морских свинок вакцинным препаратом на основе вируса Пуумала

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) занимает в РФ ведущее место среди природноочаговых инфекций. Вакцина против ГЛПС находится на стадии доклинических и клинических испытаний. Для возбудителей ГЛПС отсутствует лабораторная модель инфекции, поэтому иммуногенность вакцины определяют по индукции нейтрализующих вирус антител (нАТ). Цель исследования — анализ влияния схемы дозирования иммуногена на динамику титра нАТ на модели морских свинок после введения экспериментального хантавирусного вакцинного препарата (ХВП) на основе вируса Пуумала. Количественная оценка нейтрализующих антител в реакции нейтрализации по 50%-му подавлению фокусобразующих единиц (РН/ФОЕ50) в культуре клеток Vero представлена в виде средней геометрической величины титра антител, выраженной в двоичных логарифмах (log2). Двукратную иммунизацию морских свинок проводили с интервалом 14 дней, бустерное введение — на 182 день, по 0,3 мл в мышечную ткань бедра в неразведенном виде (ХВП-н/р) и в разведении 1/10 (ХВП-1/10). Для определения нАТ кровь отбирали каждые 14 дней. Через 14 дней после первой иммунизации ХВП-н/р нАТ определялись в титре 5,5±0,3, а для ХВП-1/10 — 4,8±0,3 (p < 0,0001). После второй иммунизации ХВП-н/р и ХВП-1/10 максимальное увеличение нАТ наблюдали до 9±0,2 на 42 день, и 6,5±0,2 на 14 день соответственно. В дальнейшем наблюдалось снижение титра нАТ до 6,2±0,3 и 5±0,3 к 308 дню после первой иммунизации. Бустерное введение ХВП-н/р индуцировало повышение уровня нАТ до 9,5±0,3, а ХВП-1/10 — до 6,5±0,3. Стоит отметить, что после бустерного введения наблюдалась индукция статистически значимо более высоких значений нАТ на 238 день после первой иммунизации ХВП-н/р и на 294 день после ХВП-1/10, с последующей тенденцией к их снижению. Результаты исследования свидетельствуют о раннем формировании иммунного ответа, интенсивность которого зависела от дозы вводимого иммуногена. Бустерное введение иммуногена через 3 месяца от начала иммунизации существенно усиливало иммунный ответ пропорционально вводимой дозе иммуногена. Длительное персистирование нАТ после двукратной иммунизации указывает на возможность применения бустерного введения иммуногена через год. Данные эксперимента позволяют подобрать оптимальную схему вакцинации (дозу и время бустерного введения иммуногена). Иммунологическая эффективность и протективная активность такой схемы вакцинации может быть оценена только по результатам клинических испытаний.

Полный текст

Введение

Хантавирус Пуумала является одним из шести возбудителей геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Патогенные хантавирусы в составе рода Orthohantavirus входят в cемейство Hantaviridae, порядок Bunyavirales [11]. Более 97% всех случаев геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) в России этиологически обусловлены вирусом Пуумала, около 3% — другими 5 возбудителями ГЛПС — вирусами Хантаан, Сеул, Амур, Куркино и Сочи [10], что указывает на ведущую этиологическую роль вируса Пуумала в структуре заболеваемости ГЛПС в России.

Отсутствие тенденции к снижению заболеваемости ГЛПС, расширение ареала инфекции, отсутствие специфических средств лечения и малая эффективность неспецифической профилактики обуславливают социальную и медицинскую значимость внедрения вакцины для профилактики ГЛПС [10].

Успех вакцинации зависит от качества, величины и длительности генерируемого адаптивного иммунного ответа, что в свою очередь зависит от схемы дозирования иммуногена [5].

В последние годы наблюдается тенденция пересмотра схем дозирования вакцин, используемых на регулярной основе, как это произошло с вакциной Превенар 13® (Pfizer) для профилактики пневмококовой инфекции, с установленной оптимальной схемой введения двух доз с двухнедельным интервалом и третьей в качестве бустера [6]. Подобному пересмотру подверглись схемы введения вакцин Imovax® (Sanofi Pasteur) против полиомиелита, RabAvert® (Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH) против бешенства человека с целью сокращения количества доз вакцины с 5 до 4 доз [9]; для Gardasil®9 (Merck), четырехвалентной Gardasil® (Merck) и двухвалентной Cervarix® (GlaxoSmithKline) против вируса папилломы человека — с 3 доз до 2 в возрасте до 15 лет [8].

В этой связи целесообразно подбирать оптимальную схему дозирования вакцин для поддержания приемлемого уровня защитных гуморальных антител до выхода на клинические испытания, позволив избежать пересмотра схемы вакцинации в будущем. Как было показано в предыдущих исследованиях, уровень нАТ у мышей BALB/c после иммунизации кандидатными вакцинами для профилактики ГЛПС после двух иммунизаций с двухнедельными интервалами не отличался от такового после трех иммунизаций с тем же интервалом. В результате оптимальной схемой дозирования для последующих экспериментов было принято применение двукратной иммунизации с третьей в виде бустерного введения [7].

Морские свинки (Cavia porcellus) представляют собой ценную и подтвержденную экспериментальную модель животных из-за ряда биологических сходств с людьми [2]. Использование морских свинок позволяет сократить количество экспериментальных животных, при этом позволяет увеличить длительность эксперимента до 3 лет. Для возбудителей ГЛПС отсутствует лабораторная модель инфекции, поэтому иммуногенную активность вакцинного препарата определяют по индукции нейтрализующих вирус антител. Таким образом целесообразность проведения экспериментов по оценке иммуногенности вакцинного препарата на морских свинках обусловлена возможностью оценить продолжительность иммунного ответа и влияние бустерного введения вакцины.

Целью данного исследования было изучение динамики нейтрализующих антител в сыворотках крови морских свинок в ответ на введение хантавирусного вакцинного препарата на основе вируса Пуумала с разной схемой дозирования иммуногена.

Материалы и методы

Хантавирусный вакцинный препарат (ХВП) был получен на основе штамма PUU-ТKD-VERO вируса Пуумала (ПУУ) по ранее описанной технологии [1]. Хроматографически очищенный на сорбенте Capto Core 700 (GE Healthcare) полуфабрикат с титром вируса 3,7±0,5 lg ФОЕ/мл и 2 × 104 копий РНК/мл инактивировали бета-пропиолактоном в разведении 1/6000. ХВП вводили по 0,3 мл в мышечную ткань бедра морских свинок в неразведенном виде (ХВП-н/р) и в разведении 1/10 (ХВП-1/10). Самки морских свинок были случайным образом распределены по 3 в каждой группе, содержались согласно ГОСТ 33216-2014. Иммунизировали свинок по схеме: 2 иммунизации (I-ИМ, II-ИМ) с двухнедельным интервалом и бустерное введение (БВ) на 182 день, забор крови каждые 14 дней от момента первой иммунизации пункцией сердца. Каждая проба сыворотки крови трехкратно исследована в реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток Vero E6. Результат представлен в виде среднегеометрического значения титра (СГТ) нАТ в двоичных логарифмах по 50% редукции числа фокусобразующих единиц (ФОЕ) [3]. Для количественной оценки РНК в вакцинном материале использовали ПЦР в режиме реального времени со штаммоспецифичными праймерами Ufa F_R, и зондом Ufa Z [4].

Статистический анализ. Полученные результаты анализировали в программе GraphPad Prism 9.4.1. Статистическую значимость различий определяли с помощью одностороннего ANOVA с тестом множественных сравнений Тьюка.

Результаты

В контрольных группах, так же, как и в экспериментальных группах, нАТ до иммунизации не выявлены в сыворотках крови, начиная с разведения 1/2. За приемлемый уровень нАТ принимали СГТ выше 4,32±0,2 log2 (рис.). Нейтрализующие антитела были выявлены у всех животных во всех экспериментальных группах в ответ на введение ХВП.

 

Рисунок. Средние титры нАТ в сыворотках крови морских свинок после первой (I-ИМ), второй (II-ИМ) иммунизаций и бустерного введения (БВ)

Figure. Mean nAB titers in guinea pigs blood sera after the first (I-IM), second (II-IM) and booster (BV) inoculation

Примечание. Средние титры нАТ в сыворотках крови морских свинок после первой (I-ИМ), второй (II-ИМ) иммунизаций и бустерного введения (БВ). Образцы крови получали в указанные временные интервалы. В дни 0, 14 и 182 образцы крови собирали перед иммунизацией. Экспериментальные группы: А — ХВП-н/р; ХВП-н/р-БВ; Б — ХВП-1/10; ХВП-1/10-БВ и контрольная группа (КГ). Титры нАТ определяли методом РН/ФОЕ50. ns — несущественно, ****p < 0,0001. Данные показывают средние геометрические титры нАТ против вируса Пуумала в группе с 95% доверительными интервалами.

Note. Mean nAT titers in guinea pigs blood sera after the first (I-IM), second (II-IM) immunizations and booster administration (BV). Blood samples were collected at the indicated time intervals. On days 0, 14 and 182, blood samples were collected prior to immunization. Experimental groups: A — HV-u/d; HV-u/d-BV; B — HV-1/10; HV-1/10-BV and control group (CG). nAT titers were measured by the FRNT50 method. ns — not significant, ****p < 0.0001. The data are shown as geometric mean nAb titers against Puumala virus in the group with 95% confidence intervals.

 

Через 2 недели после I-ИМ наблюдали статистически значимый подъем титра нАТ по сравнению с контрольной группой. Более выраженный иммунный ответ наблюдали в группе ХВП-н/р (СГТ = 5,5±0,3) в сравнении с ХВП-1/10 (СГТ = 4,8±0,3) с достоверной статистической разницей в титре нАТ (p < 0,0001) (рис.).

После II-ИМ в группе ХВП-н/р максимальное нарастание нАТ зафиксировано на 56 день (СГТ = 9±0,2) с постепенным снижением титра к 238 дню до 6,2±0,2. На этом уровне антитела оставались до 322 дня с последующим снижением до 5,2±0,3 к концу срока наблюдения. Бустерное введение ХВП на 182 день стимулировало иммунный ответ: максимальные титры антител, зафиксированные через 56 дней (238 дней после I-ИМ), достоверно превышали таковые после II-ИМ (СГТ = 9,48±0,3) (p = 0,001). К концу срока наблюдения уровень нАТ снижался до 7±0,3, статистически достоверно превышая таковой без бустерного введения ХВП-н/р (рис., А).

В группе ХВП-1/10 после II-ИМ максимальное нарастание нАТ зафиксировано на 28 день (СГТ = 6,5±0,3), к 56 дню наблюдалось снижение титра нАТ и далее, в течение 10 месяцев, наблюдалось некое плато с низким титром нАТ (СГТ = 5±0,3). Десятикратное снижение антигенной нагрузки все еще индуцировало иммунный ответ, хотя и на предельно низких значениях титра нАТ (рис., Б). Бустерное введение ХВП-1/10 характеризовалось медленным подъемом нАТ в течение 4-х месяцев до максимальных титров 7,5±0,2 (на 294 день после I-ИМ), которые оставались достоверно ниже таковых после бустерного введения ХВП-н/р. Также постепенно снижался титр нАТ и к концу наблюдения составил 5±0,2, сравнявшись с титром нАТ после двукратного введения ХВП-н/р без бустерного введения.

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

  1. Интенсивность гуморального иммунного ответа прямо пропорциональна дозе вводимого иммуногена.
  2. Выраженная динамика нарастания нАТ после бустерного введения в сравнении с ответом после I-ИМ и II-ИМ указывает на формирование устойчивой иммунной памяти.
  3. Бустерное введение иммуногена можно рассматривать через год от начала иммунизации, принимая во внимание тот факт, что нАТ все еще выявляются в эти сроки после двукратной иммунизации. Подтверждение этого положения должно быть получено в ходе клинических испытаний.
  4. Для определенных групп населения (дети, пожилые люди, лица, имеющие хронические заболевания) возможно будет целесообразным использование низких доз иммуногена. Ограничением является величина протективной дозы вакцинного препарата, определить которую возможно только по результатам клинических испытаний.
×

Об авторах

С. С. Курашова

ФГАНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)

Автор, ответственный за переписку.
Email: svetlanak886@yandex.ru

к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок

Россия, Москва

М. В. Баловнева

ФГАНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)

Email: mashasm@yandex.ru

к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок

Россия, Москва

А. А. Ишмухаметов

ФГАНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита); Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: ishmukhametov@chumakovs.su

академик РАН, д.м.н., профессор, генеральный директор, руководитель кафедры организации и технологии иммунобиологических препаратов 

Россия, Москва; Москва

Р. Д. Теодорович

ФГАНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)

Email: rostislavteo@mail.ru

научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок

Россия, Москва

Ю. В. Попова

ФГАНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)

Email: popova_jv@chumakovs.su

научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок

Россия, Москва

Е. А. Ткаченко

ФГАНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)

Email: evgeniytkach@mail.ru

д.м.н., профессор, руководитель научного направления

Россия, Москва

Т. К. Дзагурова

ФГАНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)

Email: dzaguron@gmail.com

д.м.н., зав. лабораторией геморрагических лихорадок

Россия, Москва

Список литературы

  1. Бархалева О.А., Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К. Вакцина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2011. Т. 41, № 1. С. 27–30. [Barkhaleva О.А., Vorobyeva М.S., Ladizhenskaya I.P., Tkachenko E.A., Dzagurova T.K. Vaccine against hemorrhagic fever with kidney syndrome. BIOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie = Biopreparations, 2011, vol. 1, pp. 27–30. (In Russ.)]
  2. Рыбакова А.В., Макарова М.Н. Использование морских свинок в биомедицинских исследованиях // Международный вестник ветеринарии. 2018. № 1. С. 132–137. [Rybakova A.V., Makarova M.N. The use of guinea pigs in biomedical research. Mezhdunarodnyi vestnik veterinarii = International Veterinary Bulletin, 2018, vol. 1, pp. 132–137 (In Russ.)]
  3. Dzagurova T.K., Klempa B., Tkachenko E.A., Slyusareva G.P., Morozov V.G., Auste B., Kruger D.H. Molecular diagnostics of hemorrhagic fever with renal syndrome during a Dobrava virus infection outbreak in the European part of Russia. J. Clin. Microbiol., 2009, vol. 47, no. 12, pp. 4029–4036. doi: 10.1128/JCM.01225-09
  4. Egorova M.S., Kurashova S.S., Ishmukhametov A.A., Balovneva M.V., Devyatkin A.A., Safonova M.V., Ozherelkov S.V., Khapchaev Yu.Kh., Balkina A.S., Belyakova A.V., Dzagurova T.K., Tkachenko E.A. Real-time PCR assay development for the control of vaccine against hemorrhagic fever with renal syndrome. Probl. Viral., 2021, vol. 66, no. 1, pp. 65–73. doi: 10.36233/0507-4088-30
  5. Ghimire T.R. The mechanisms of action of vaccines containing aluminum adjuvants: an in vitro vs in vivo paradigm. Springerplus, 2015, vol. 4, no. 1, pp. 1–18.
  6. Goldblatt D., Southern J., Andrews N. J., Burbidge P., Partington J., Roalfe L., Pinto V.M., Thalasselis V., Plestedd E., Richardson H., Snape M.D., Miller E. Pneumococcal conjugate vaccine 13 delivered as one primary and one booster dose (1+1) compared with two primary doses and a booster (2+1) in UK infants: a multicentre, parallel group randomised controlled trial. Lancet Infect. Dis., 2018, vol. 18, no. 2, pp. 171–179. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30654-0
  7. Kurashova S.S., Ishmukhametov A.A., Dzagurova T.K., Egorova M.S., Balovneva M.V., Nikitin N.A., Evtushenko E.A., Karpova O.V., Markina A.A., Aparin P.G., Tkachenko P.E., Lvov V.L., Tkachenko E.A. Various adjuvants effect on immunogenicity of Puumala virus vaccine. Front. Cell. Infect. Microbiol., 2020, vol. 10: 545371. doi: 10.3389/fcimb.2020.545371
  8. Meites E., Szilagyi P.G., Chesson H.W., Unger E.R., Romero J.R., Markowitz L.E. Human papillomavirus vaccination for adults: updated recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Am. J. Transplant., 2019, vol. 19, no. 11, pp. 3202–3206. doi: 10.1111/ajt.15633
  9. Mittal M.K. Revised 4-dose vaccine schedule as part of postexposure prophylaxis to prevent human rabies. Pediatr. Emerg. Care, 2013, vol. 29, no. 10, pp. 1119–1121. doi: 10.1097/PEC.0b013e3182a63125
  10. Tkachenko E.A., Ishmukhametov A.A., Dzagurova T.K., Bernshtein A.D., Morozov V.G., Siniugina A.A., Kurashova S.S., Balkina A.S., Tkachenko P.E., Kruger D.H., Klempa B. Hemorrhagic fever with renal syndrome Russia. Emerg. Infect. Dis., 2019, vol. 25, no. 12, pp. 2325–2328. doi: 10.3201/eid2512.181649
  11. Vaheri A., Strandin T., Hepojoki J., Sironen T., Henttonen H., Mäkelä S., Mustonen J. Uncovering the mysteries of hantavirus infections. Nat. Rev. Microbiol., 2013, vol. 11, no. 8, pp. 539–550.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок. Средние титры нАТ в сыворотках крови морских свинок после первой (I-ИМ), второй (II-ИМ) иммунизаций и бустерного введения (БВ)

Скачать (139KB)
Метаданные

© Курашова С.С., Баловнева М.В., Ишмухаметов А.А., Теодорович Р.Д., Попова Ю.В., Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах