Method for phenotypic identification of Acinetobacter seifertii bacteria

Full Text

Введение

В 2015 г. был обоснован таксономический статус нового вида Acinetobacter seifertii [8]. Ранее штаммы этого вида были известны как геноварианты «близкие к 13U», и их предварительно относили к комплексу Acinetobacter calcoaceticus–Acinetobacter baumannii (комплекс ACB). Они четко отличались от других видов комплекса АСВ по генетическим критериям. Фенотипические тесты выявили некоторые особенности бактерий вида, но не позволяли надежно отличать этот вид от других представителей комплекса АСВ. Бактерии A. seifertii выделяли из клинического материала в различных регионах: Дании, Чехии, США [8], Японии [6], Боливии [4]. Ретроспективное исследование в четырех медицинских центрах на Тайване в течение 8 лет (2010–2017 гг.) выявило 80 больных с инфекцией кровотока, вызванной A. seifertii [7]. Внутригоспитальная летальность среди таких больных составляла 30%. Изоляты A. seifertii были чувствительны к левофлоксацину (86,2%) и только 37,5% чувствительны к колистину, 16,3% устойчивы к карбапенемам. Следовательно, бактерии A. seifertii могут вызывать тяжелые инфекции, имеют особенности чувствительности к антибиотикам, что требует их надежной идентификации. В настоящее время идентификация бактерий A. seifertii общедоступными традиционными фенотипическими тестами проводится только до уровня принадлежности их к комплексу АСВ или к группе A. baumannii (группа Ав), что точнее, так как бактерии A. calcoaceticus редко присутствуют в клиническом материале. Идентификация до уровня вида проводится методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-ToF MS) или молекулярно-генетическими методами.

Цель исследования: повысить точность видовой идентификации бактерий A. seifertii традиционным фенотипическим методом.

Материалы и методы

Штаммы бактерий. Объектом исследований были 5 штаммов бактерий A. seifertii, из них 3 (№ 3459, № 22884, № 8597) были выделены в микробиологической лаборатории Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова в 2019, 2023, 2024 гг. и 2 штамма (№ 1901, № 2218) выделены и находятся в коллекции культур НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера. В сравнительных исследованиях использовали клинические штаммы Acinetobacter spp., выделенные в Военно-медицинской академии в 2023–2024 гг.: A. baumannii (n = 152), в том числе 37 штаммов биовара tryptophandestruens; A. nosocomialis (n = 12), A. pittii (n = 6). Из них по 2 штамма A. nosocomialis и A. pittii находятся в коллекции культур НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера. Изучали также 3 штамма A. calcoaceticus, выделенных из воды реки Невы. Все указанные штаммы были идентифицированы методом MALDI-ToF масс-спектрометрии в Военно-медицинской академии. Указанные штаммы бактерий находятся в рабочей коллекции культур профессора Е.П. Сиволодского на кафедре микробиологии Военно-медицинской академии.

Питательные среды и реактивы. Для культивирования бактерий использовали Колумбийский агар (НИЦФ, Санкт-Петербург) и Колумбийский агар с 5% крови барана.

Методика постановки тестов для фенотипической идентификации бактерий группы Ав. Отношение бактерий к окраске по Граму, морфологию и подвижность изучали микроскопическим методом. Наличие каталазы устанавливали тестом с 3% раствором перекиси водорода. Цитохромоксидазу определяли тестом с 1% водным раствором тетраметилпарафенилендиамина по появлению синей окраски бактерий через 20 с. Для проведения теста на ферментацию и окисление D-глюкозы использовали среду Хью–Лейфсона. Нитратредуктазу выявляли в течение 3 ч, используя среды и реактивы микрообъемной тест-системы «Рапид-Энтеро» (производства НИИЭМ имени Пастера). Утилизацию субстратов в качестве единственных источников углерода проводили на плотной минимальной солевой среде с минеральным источником азота по методике, изложенной ранее [2]. Применяли следующие субстраты: ацетат натрия, D-глюкоза, L-фенилаланин, этанол отечественного производства; L-арабиноза и D-ксилоза (Reanal, Венгрия), трикабаллиловая кислота (Merck, Германия).

Питательная среда и методика идентификации бактерий A. seifertii с использованием теста утилизации D-ксилозы. Приготовление и контроль питательной среды. В 1 л дистиллированной воды вносят (г/л): D-ксилозу (CAS 58-86-6) 2,0; NH₄Cl 5,0; NH₄NO₃ 1,0; Na₂SO₄ 2,0; K₂HPO₄ 3,0; KH₂PO₄ 1,0; MgSO₄ 0,1; бромтимоловый синий 1,6% водный раствор 4 мл; агар бактериологический 15,0; растворяют все ингредиенты при нагревании, устанавливают рН 7,2±0,2, стерилизуют при 112°С в течение 20 мин, разливают в чашки Петри. Питательная среда прозрачная, зеленого цвета, пригодна к использованию в течение 30 суток при хранении от 4 до 8°С. Бактериологический контроль питательной среды проводят при ее изготовлении, используя контрольные клинические штаммы бактерий A. baumannii (положительный контроль) и A. seifertii (отрицательный контроль). Суточные агаровые культуры контрольных штаммов суспендируют по половине петли диаметром 2 мм в 0,1 мл 0,85% раствора хлорида натрия в лунке планшета, засевают по петле суспензии бактерий штрихом на сектор питательной среды, инкубируют посевы в аэробных условиях при 30°С в течение 24–48 ч, затем учитывают результат: питательная среда пригодна к использованию при наличии роста по штриху посева газона бактерий A. baumannii и отсутствии роста A. seifertii. Другие варианты питательной среды: среда без D-ксилозы (для контроля основы среды) и питательная среда с ацетатом натрия (2,0 г/л) для контроля отсутствия ауксотрофности изготовляются и контролируются таким же образом. Питательная среда для контроля основы среды пригодна к применению, если на ней отсутствует рост бактерий A. baumannii, A. seifertii; питательная среда для контроля отсутствия ауксотрофности пригодна к использованию, если на ней растут бактерии A. baumannii и A. seifertii.

Методика теста. Исследуемый материал — чистая культура бактерий, у которой выявлена совокупность признаков бактерий группы Ав: грамотрицательные коккобактерии, растущие при 30, 37, 41°С, аэробы, неподвижные, оксидазоотрицательные, каталазоположительные, не ферментируют, но окисляют D-глюкозу с образованием кислоты, не имеют нитратредуктазы, утилизируют в качестве единственного источника углерода ацетат натрия (контроль отсутствия ауксотрофности), этанол, трикарбаллиловую кислоту; большинство штаммов утилизируют L-фенилаланин, все штаммы не утилизируют D-глюкозу. Суспендируют исследуемую суточную агаровую культуру по половине петли диаметром 2 мм в 0,1 мл 0,85% раствора хлорида натрия, засевают по одной петле взвеси бактерий штрихом на сектор питательной среды с D-ксилозой и питательной среды без D-ксилозы (контроль основы среды), инкубируют посевы при 30°С в аэробных условиях в течение 24–48 ч, затем учитывают результат. Отсутствие роста бактерий на питательной среде с D-ксилозой и среде без D-ксилозы при наличии их роста на питательной среде с ацетатом натрия при предварительном отборе культур указывает на отсутствие у них ауксотрофности и принадлежность их к виду A. seifertii по признаку отсутствия утилизации D-ксилозы.

Питательная среда и методика определения уреазы быстрой активности микрообъемным методом в планшетах. Использовали среду с мочевиной (рН 7,0±0,1) следующего состава (г/л): Na₂HPO₄ 1,1; KH₂PO₄ 1,1; NaCl 5,0; 0,4%-ный водно-щелочной раствор фенолового красного 5 мл; мочевина (CAS 57-13-6) 10,0–15,0; вода дистиллированная 1 л. Ингредиенты, кроме мочевины, растворяли в 1 л дистиллированной воды, разливали по 50 мл во флаконы, стерилизовали при 121°С 20 мин, затем добавляли во флаконы по 0,5–0,75 г самостерилизованной мочевины. Прозрачную, желтой окраски среду использовали в течение 30 суток при хранении от 4 до 8°С. Для постановки теста среду с мочевиной вносили по 0,1 мл в лунки стерильного планшета; суточную агаровую культуру исследуемых штаммов бактерий засевали полной петлей диаметром 2 мм в лунку со средой и перемешивали. Таким же образом засевали в отдельные лунки суточные агаровые культуры контрольных штаммов уреазопозитивного A. nosocomialis (положительный контроль) и уреазоотрицательного A. baumannii (отрицательный контроль), одну лунку не засевали (один контроль среды можно использовать для всех штаммов, исследуемых в данный день). Посевы выращивали аэробно (без внесения в лунки вазелинового масла) при 37°С в течение 3 ч, после чего учитывали результат: изменение исходной желтой окраски на красную в лунке с посевом исследуемого штамма указывает на выявление уреазы быстрой активности при наличии такого же результата в лунке положительного контроля. В лунках отрицательного контроля и без посева контрольная среда сохраняет исходную желтую окраску.

Идентификация бактерий биовара A. baumannii bv. tryptophandestruens по хромогенной биотрансформации бензоата натрия. Исследования осуществляли по методике, изложенной в [2].

Идентификация видов бактерий методом MALDI-ToF масс-спектрометрии. Использовали MALDI-ToF масс-спектрометр Microflex с базой данных MALDI Biotyper (Bruker Daltoniсs Inc., Германия) и/или прибор BactoSCREEN (НПФ «Литех», Россия) в соответствии с инструкциями по применению.

Результаты

Предварительно все исследуемые штаммы Acinetobacter spp. были изучены с помощью фенотипических тестов по указанной выше методике на их принадлежность к группе Ав. Было установлено, что они неподвижные, грамотрицательные коккобактерии, которые растут при 30, 37, 41°С, не имеют цитохромоксидазы и нитратредуктазы, но содержат каталазу, не ферментируют, но окисляют D-глюкозу с образованием кислоты; утилизируют ацетат натрия, трикарбаллиловую кислоту, этанол; большинство штаммов утилизирует L-фенилаланин; все штаммы не утилизируют D-глюкозу.

Изучали в сравнении отношение бактерий всех видов группы Ав к тестам, которые наиболее перспективны для их идентификации: утилизацию L-арабинозы и D-ксилозы; наличие уреазы быстрой активности по методике, изложенной в разделе «Материалы и методы». Исследования показали, что все штаммы вида A. seifertii однозначно не утилизируют D-ксилозу в качестве единственного источника углерода, а бактерии всех других видов группы Ав однозначно утилизируют D-ксилозу. Бактерии A. seifertii также однозначно не утилизируют L-арабинозу, но значительная часть штаммов вида A. baumannii 29,6±3,7% (45 штаммов из 152) также не утилизировала L-арабинозу. При этом все 37 штаммов биовара A. baumannii bv. tryptophandestruens не утилизировали L-арабинозу. Все штаммы других видов группы Ав однозначно утилизируют L-арабинозу. Бактерии вида A. nosocomialis однозначно имеют уреазу быстрой активности, которую также имеют большинство штаммов вида A. seifertii (4 из 5 штаммов). Бактерии остальных изученных видов группы Ав однозначно не имеют уреазы быстрой активности (табл.).

 

Таблица. Характеристика отличительных признаков бактерий A. seifertii и других видов комплекса A. calcoaceticus — A. baumannii

Table. Characteristics of the distinctive features of A. seifertii bacteria and other species of the A. calcoaceticus — A. baumannii complex

Вид бактерий Species of bacteria	Число штаммов Number of strains	Число штаммов, утилизирующих Number of strains, utilizing			Число штаммов с уреазой** Number of strains with urease**
		Ацетат натрия* Sodium acetate*	D-ксилоза D-xyloze	L-арабиноза L-arabinose
A. baumannii, из них биовар tryptophandestruens A. baumannii, of these a biovar tryptophandestruens	152 37	+ +	+ +	107 (70, 4%) –	– –
A. seifertii	5	+	–	–	4 (80, 0%)
A. nosocomialis	12	+	+	+	+
A. pittii	6	+	+	+	–
A. calcoaceticus	3	+	+	+	–

Примечание. «+» — все штаммы положительные; «–» — все штаммы отрицательные; % — процент положительных штаммов; * — контроль отсутствия ауксотрофности штаммов; ** — уреаза быстрой активности.

Note. “+” — all strains are positive; “–” — all strains are negative; % — percentage of positive strains; * — control of the absence of auxotrophy of strains; ** — urease of rapid activity.

 

Обсуждение

В данном исследовании впервые был обнаружен признак, отличающий бактерии A. seifertii от других изученных видов группы Ав — отсутствие утилизации D-ксилозы в качестве единственного источника углерода. Утилизация D-ксилозы не изучалась при описаниях фенотипических характеристик всех видов бактерий комплекса АСВ, включая вид Acinetobacter dijkshoorniae (более поздний гетеротипический синоним Acinetobacter lactucae). К сожалению, мы не имели для изучения штаммов A. dijkshoorniae, но в описании этого вида отмечено, что он утилизирует L-арабинозу [5]. При описании вида A. seifertii [8] авторы отметили как типичный для этого вида признак отсутствие утилизации L-арабинозы при однозначной утилизации L-арабинозы штаммами A. nosocomialis. Однако штаммы других видов утилизировали L-арабинозу неоднозначно: A. baumannii (84%), A. pittii (85%). Наши результаты подтверждают однозначность отсутствия утилизации L-арабинозы бактериями A. seifertii и однозначность ее утилизации бактериями A. nosocomialis. Однако у бактерий A. baumannii мы обнаружили значительно больше негативных по утилизации L-арабинозы штаммов: 29,6±3,7% (45 из 152), которые включали все 37 штаммов A. baumannii bv. tryptophandestruens. Широкое распространение этого биовара A. baumannii [2, 3] определяет ненадежность идентификации A. seifertii по признаку отсутствия утилизации L-арабинозы. Мы показали, что большинство штаммов A. seifertii (4 из 5 штаммов) обладают уреазой быстрой активности, которая характерна для всех штаммов A. nosocomialis. В этом проявляется единство генетической близости геновида «близкого к 13TU» (прежнее название вида A. seifertii) и фенотипической «близости к 13TU» (13TU прежнее название вида A. nosocomialis) по признаку наличия уреазы быстрой активности. Но тест отсутствия утилизации D-ксилозы более точно различает бактерии вида A. seifertii (уреазоположительные и уреазоотрицательные штаммы) от вида A. nosocomialis, все штаммы которого уреазопозитивны и утилизируют D-ксилозу. Примером служит идентификация штамма «A. baumannii» № 3459, выделенного из клинического материала в 2019 г. и идентифицированного при выделении методом MALDI-ToF MS с применением базы данных 2019 г. FLDI-Biotyper масс-спектрометром Microflex (Brucker Daltonics, Германия). Этот штамм был единственным среди штаммов A. baumannii по необычному сочетанию уреазы быстрой активности и отсутствию утилизации L-арабинозы [1]. В 2023 г. штамм № 3459 был изучен тестом на утилизацию D-ксилозы, который показал отсутствие утилизации D-ксилозы и принадлежность штамма к виду A. seifertii. Исследование штамма методом MALDI-ToF MS c обновленной в 2023 г. базой данных, содержащей информацию о виде A. seifertii, подтвердило принадлежность его к A. seifertii. Следовательно, тест на утилизацию D-ксилозы более точно выявляет A. seifertii, чем тест на утилизацию L-арабинозы. Разработан метод идентификации бактерий A. seifertii по совокупности фенотипических признаков бактерий группы Ав с использованием теста на утилизацию D-ксилозы, представленный в разделе «Материалы и методы».

Заключение

Впервые выявлен признак бактерий A. seifertii, который позволяет надежно отличить этот вид от других видов бактерий групп Ав — отсутствие утилизации D-ксилозы. Установлено также, что тест на утилизацию D-ксилозы в сочетании с тестом выявления уреазы быстрой активности позволяет точно идентифицировать бактерии A. nosocomialis. Разработан метод идентификации бактерий A. seifertii по совокупности фенотипических признаков бактерий группы Ав с использованием теста на утилизацию D-ксилозы.

Благодарности

Авторы благодарят врача-бактериолога микробиологической лаборатории Центральной клинико-диагностической лаборатории Горелову Галину Васильевну и старшего лаборанта кафедры микробиологии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова Белогурову Татьяну Борисовну за помощь в исследованиях.

About the authors

E. P. Sivolodskii

Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Email: lykraeva@yandex.ru

DSc (Medicine), Professor of the Department of Microbiology

Россия, St. Peterburg

L. A. Kraeva

Military Medical Academy named after S.M. Kirov; St. Petersburg Pasteur Institute

Author for correspondence.
Email: lykraeva@yandex.ru

DSc (Medicine), Head of the Laboratory of Medical Bacteriology, St. Petersburg Pasteur Institute; Professor of the Department of Microbiology, Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Россия, St. Petersburg; St. Petersburg

E. V. Melnikova

Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Email: lykraeva@yandex.ru

Head of the Laboratory of Microbiology, Central Clinical Diagnostic Laboratory

Россия, St. Peterburg

References

Supplementary files