Longitudinal tracking of T-cell repertoire reveals long-lasting CD4⁺ yellow fever specific clone cluster

Full Text

Введение

Проблема острых вирусных инфекций продолжает быть актуальной [2]. Основная сложность изучения иммунного ответа человека на острые вирусные инфекции, это отсутствие возможности постановки контролируемого эксперимента. Наиболее удачной моделью острой вирусной инфекции является вакцинация от желтой лихорадки (ЖЛ). Изобретатель вакцины, Макс Тейлер, получил Нобелевскую премию в 1951 г. «За открытия, связанные с желтой лихорадкой, и борьбу с ней» [6]. В основе вакцины аттенуированный вирус, который, как и дикий тип вируса, вызывает виремию, позволяя изучать иммунный ответ в условиях максимально близких к вирусной инфекции.

Т-клетки играют важную роль в противовирусной защите, участвуя во множестве процессов от элиминации вирусных частиц до формирования иммунологической памяти. Специфическое распознавание антигена Т-клетками происходит в ходе взаимодействия Т-клеточного рецептора (TCR) с процессированным антигеном, встроенным в главный комплекс гистосовместимости (MHC). Участок, принимающий наибольшее участие во взаимодействии с антигеном (CDR3) находится на TCRb цепи и отличается крайней вариабельностью, формирующейся в процессе V(D)J рекомбинации. Применение технологий секвенирования нового поколения совместно с стратегиями пробоподготовки позволяет преодолевать основную сложность исследования репертуара — огромное разнообразие последовательностей TCR [5]. Все вместе создает необходимую базу для изучения изменений Т-клеточного репертуара в ответ на вакцинацию от желтой лихорадки.

Динамика Т-клеточного ответа на первичную вакцинацию от желтой лихорадки характеризуется выраженной экспансией как CD8⁺, так и CD4⁺ Т-клеток на 14 день после вакцинации [11]. Репертуар ЖЛ-специфических Т-клеток подробно изучен для доноров, обладающих аллелем HLA-A02 [7], самым распространенным аллелем среди европейских доноров [8]. Найдена аминокислотная последовательность TCRb CDR3 региона, распознающего иммуногенный эпитоп NS4B вирусного белка, представленного на HLA-A02, а также исследован ответ на вторичную вакцинацию [4]. Несмотря на это, данных о ЖЛ-специфическом Т-клеточном ответе доноров, не несущих аллель HLA-A02, намного меньше. При этом естественные резервуары желтой лихорадки географически не пересекаются с регионами широкого распространения HLA-A02 аллеля [3], поэтому исследование ЖЛ-специфических Т-клеток доноров, не несущих аллель HLA-A02 имеет особую клиническую значимость.

В данной работе мы подробно рассматриваем специфический Т-клеточный ответ на вакцинацию от желтой лихорадки у донора, не обладающего аллелем HLA-A02.

Материалы и методы

Образцы крови. Вакцинацию проводили живой аттенуированной вакциной YF17D, забор крови проводился в сертифицированной диагностической лаборатории. Мононуклеарные клетки периферической крови были выделены с помощью стандартного протокола центрифугирования в градиенте плотности (фиколл, 1,077 г/см³, ПанЭко, Россия) из 8 мл крови для каждой повторности. Выделение субпопуляций CD4⁺ и CD8⁺ осуществляли с использованием магнитной сепарации и позитивной селекции Dynabeads (Invitrogen, США) из 4 мл крови в каждой временной точки. РНК выделяли стандартным протоколом для Trizol реагента.

HLA-типирование. Стартовый материал для HLA-типирования брали из аликвоты РНК выделенной из мононуклеарных клеток периферической крови. Синтез кДНК библиотеки происходил с использованием праймеров на участки высокой консервативности HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB, HLA-DRB локусов. Полученную библиотеку секвенировали на платформе Illumina MiSeq в режиме 2 × 250 пн, полученные данные обрабатывались в среде R с помощью автоматизированного алгоритма.

Приготовление библиотек TCRb, секвенирова ние. Библиотеки TCRb подготавливались по ранее разработанному протоколу [7] c незначительными доработками. Основной особенностью нашей пробоподготовки является внедрение уникальных молекулярных баркодов с использованием эффекта смены матрицы ревертазой на 5’-конце, что позволяет подсчитать количество молекул мРНК на старте и исправить ошибки ПЦР при последующей обработке. Библиотеки были секвенированы на платформе Illumina NovaSeq в режиме 2 × 150 пн.

Обработка полученных данных. Сырые данные секвенирования были обработаны с помощью специального программного обеспечения MIGEC [10] и MiXCR [1], которое позволяет скорректировать ошибки секвенирования, подсчитать количество уникальных молекул мРНК, а также провести выравнивание V, D и J сегментов. Для дальнейшего анализа полученных таблиц клонсетов были использованы пакеты tidyverse, data. table в среде программирования R studio. Для построения графиков использовался пакет ggplot2.

Результаты и обсуждение

На первом этапе мы провели генотипирование донора и обнаружили у него следующие HLA-аллели: A*24:02:01; A*30:01:01; B*13:02:01; B*35:02:01; C*04:01:01; C*06:02:01; DQB1*02:02:01; DQB1*03:01:01; DRB1*07:01:01; DRB1*11:04:01. Эксперимент проводили согласно следующей схеме: на день 0, до вакцинации, у донора забиралась кровь с последующим выделением PBMC и разделением на фракции CD4⁺ и CD8⁺, в этот же день проходила вакцинация донора YF17D. Далее у донора снова забиралась кровь с аналогичными шагами пробоподготовки на 15, 25, 34 и 53 день после вакцинации. На основе всех полученных образцов готовились библиотеки кДНК для дальнейшего секвенирования и реконструкции репертуаров TCR. Для того, чтобы обнаружить Т-клеточные клоны, отвечающие на вакцинацию YF17D, мы воспользовались пакетом для анализа дифференциальной экспрессии генов edgeR [9]. Мы смогли детектировать 584 клонов значимо увеличивших свою концентрацию на 15 день после вакцинации. Такие клоны занимают 3,9% от всего репертуара на 15 день (рис. 1). Что согласуется с ранее опубликованными данными, описывающими Т-клеточный ответ на первичную вакцинацию YF17D как быстро развивающийся с сильной клональной экспансией [11]. Для того, чтобы проследить за динамикой Т-клеточного ответа на вакцинацию от вируса желтой лихорадки мы рассмотрели изменение доли YF-специфических клонов от всего репертуара на 15, 25, 34 и 53 день (рис. 1).

 

Рисунок 1. Динамика Т-клеточного ответа на вакцинацию YF17D. Доля ЖЛ-специфических TCRb клонов от всего репертуара в различных точках до и после вакцинации

Figure 1. Dynamics of the T cell response towards YF17D vaccination. Fraction of the YF-specific TCRb from the whole repertoire in different timepoints

 

Ко дню 25 доля отвечающих клонов снизилась и продолжала плавно снижаться до дня 53. Проанализировав вклад клеток с разным фенотипом в Т-клеточный ответ на вакцинацию, оказалось, что ответ сдвинут в сторону CD8⁺ Т клеток (рис. 2), как и для HLA-A02 положительных доноров. При этом доля CD8⁺ T-клеток возросла к 53 дню, что может свидетельствовать об продолжительном участии в элиминации зараженных клеток и временном сдвиге CD8⁺ ответа.

 

Рисунок 2. Фенотипический состав ЖЛ-специфических клонов. Доля CD8⁺ и CD4⁺ популяций среди всех ответивших клонов в различных точках после вакцинации

Figure 2. Phenotypes of the YF-specific clones. Fraction of the CD8⁺ and CD4⁺ populations from all expanded clones in different timepoints

 

Несмотря на отсутствие известного иммуногенного эпитопа для данного набора HLA I класса, мы оценили схожесть аминокислотных последовательностей CDR3 TCRb отвечающих клонов с помощью граф анализа (рис. 3). ЖЛ-специфические клоны данного донора образуют меньше кластеров, чем клоны HLA-A02 положительных доноров [7], при этом большинство кластеров образовано CD4⁺ Т-клетками. Клоны из самого большого CD4⁺ кластера сохранялись до 53 дня после вакцинации, что может указывать на наличие иммуногенного вирусного эпитопа, представленного на HLA II класса.

 

Рисунок 3. Графы для ЖЛ-специфических клонов. Каждая точка на графе обозначает отдельный клонотип. Черным цветом обозначены CD8⁺ клоны, серым CD4⁺. Приведен консенсусный мотив для самого большого кластера

Figure 3. Graphs of the YF-specific clones. Each dot represents a clonotype. Black colour represents CD8⁺ clones, grey CD4⁺. The consensus motif of the largest cluster is shown

 

Заключение

В данной работе мы подробно рассмотрели динамику и клональный состав Т-клеточного ответа на вакцинацию от желтой лихорадки донора с нераспространенным HLA генотипом. Общая динамика ответа была схожей с опубликованными данными, на 15 день после вакцинации мы смогли детектировать 584 ЖЛ-специфических клона, которые составляли 3,9% от всего репертуара TCRb. Интересно, что несмотря на отсутствие известного иммуногенного эпитопа для HLA I класса у данного донора, среди отвечающих клонов преобладали CD8⁺ Т-клетки, увеличившие свою долю к 53 дню. Однако, аминокислотные кластеры CDR3 были образованы в большей части CD4⁺ Т-клетками, самый большой кластер был нами охарактеризован и сохранялся до 53 дня. Таким образом, были показаны важные отличия в Т-клеточном ответе, связанные с набором HLA аллелей.

About the authors

Mariia A. Salnikova

Lomonosov Moscow State University; Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS

Author for correspondence.
Email: msalniku@yandex.ru

Postgraduate Student, Department of Immunology, Faculty of Biology, Engineer-Researcher

Россия, 117997, Moscow, Miklukho-Maklaya str., 16/10; Moscow

Yu. B. Lebedev

Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS

Email: msalniku@yandex.ru

DSc (Biology), Professor, Head of the Laboratory of Comparative and Functional Genomics

Россия, Moscow

References

Supplementary files