Development of reassortant influenza vaccines: classical reassortment or reverse genetics?

Full Text

Введение

Способность вирусов гриппа к реасортации была установлена в середине XX в. благодаря новаторским работам таких ученых, как Frank Burnet и George Hirst, и с тех пор активно используется в научных исследованиях и практике, в частности, при подготовке гриппозных вакцин. Современные гриппозные вакцины представляют собой трех- и даже четырехкомпонентный препарат, состоящий из вирусов гриппа А(H1N1), А(H3N2) и вируса(ов) гриппа В одной или двух генетических линий. Важной особенностью гриппозных вакцин, отличающей их от любых других иммунобиологических препаратов, является то, что они не имеют постоянного состава штаммов. В связи с изменчивостью антигенных свойств вируса гриппа, для поддержания высокого уровня профилактической эффективности производство нуждается в регулярном и своевременном обеспечении новыми актуальными вакцинными штаммами.

Реассортантные вакцинные штаммы составляют основу современных живых (ЖГВ) [57] и инактивированных (ИГВ) [56] гриппозных вакцин. Эти вакцины представляют собой реассортанты, полученные при скрещивании актуального циркулирующего вируса гриппа с донорским штаммом (холодоадаптированным донором аттенуации для живых гриппозных вакцин или донором высокой урожайности для инактивированных вакцин). В настоящее время для подготовки штаммов реассортантных гриппозных вакцин используются методы классической реассортации и обратной генетики [19, 58]. Метод классической реассортации не всегда позволяет получить реассортантный вирус с вакцинной формулой генома 6:2 (белки HA и NA — от эпидемического («дикого») родителя, а PB2, PB1, PA, NP, M и NS — от донорского штамма). Этому мешает ряд причин, начиная с уникальных свойств конкретного эпидемического вируса и заканчивая констелляцией генов [12, 26, 27, 49]. Все это увеличивает объем работы и отнимает много времени. Метод обратной генетики представляет собой альтернативный подход к созданию реассортантных вакцинных штаммов, который позволяет гарантированно и быстро получать реассортантные вирусы заданной формулы генома, свободные от мутаций, неизбежно появляющихся в геноме в результате пассирования вирусов в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) [8, 19].

В настоящем обзоре рассматриваются преимущества и недостатки подготовки реассортантных гриппозных вакцин методами обратной генетики и классической реассортации в РКЭ.

Реассортантные гриппозные вакцины. Оптимальный состав генома вакцинного штамма

Живые реассортантные гриппозные вакцины

Современные живые реассортантные гриппозные вакцины представляют собой реассортанты, полученные при скрещивании актуального циркулирующего вируса гриппа с аттенуированным холодоадаптированным (ХА) донором аттенуации. Всего четыре ХА (приспособленных к репликации при низких температурах — 25–26°C) вируса используются в мире в качестве доноров для лицензированных ЖГВ: два отечественных донора — A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и В/СССР/60/69 [1] и два донора для вакцины американской компании MedImmune — A/Ann Arbor/6/60ca (H2N2) и B/Ann Arbor/1/66ca [10].

Для получения реассортантного вакцинного штамма для ЖГВ с вакцинной формулой генома 6:2 из восьми сегментов РНК от «дикого» вируса в геноме реассортанта оставляют только гены, кодирующие HA и NA, ответственные за антигенную новизну и иммуногенность вакцины. Остальные шесть сегментов, отвечающих за безопасность ЖГВ, получают от ХА донора аттенуации; они передают кандидату ЖГВ температурную чувствительность (неспособность к репликации при температурах выше оптимального диапазона), ХА фенотип и способность к активной репликации в РКЭ при оптимальной температуре [45, 46]. Такой состав генома считается оптимальным для живой гриппозной вакцины. Вакцинный вирус сохраняет способность размножаться в эпителии верхних дыхательных путей и индуцировать в ходе бессимптомной инфекции все основные звенья приобретенного иммунитета.

Классический метод получения реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ с формулой генома 6:2 включает в себя скрещивание в РКЭ при 32°C родительских вирусов (ХА донора аттенуации и эпидемического вируса, взятых в равных инфекционных дозах), селективные пассажи в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной до 25–26°C температуре с последующим клонированием предельными разведениями [45, 46]. Теоретически при скрещивании двух штаммов вируса гриппа возможно формирование 256+2 различных комбинаций генов. Использование двух мощных селектирующих факторов — антисыворотки к донору аттенуации и пониженной температуры инкубации — приводит к существенному снижению количества нежелательных комбинаций, однако в ряде случаев их число продолжает оставаться достаточно большим, о чем речь пойдет ниже.

Кандидаты для отечественной ЖГВ на основе доноров A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и В/СССР/60/69 получают путем классической реассортации в РКЭ [30, 46, 47, 53]. Кандидаты в ЖГВ, основанные на американских донорах A/Ann Arbor/6/60ca (H2N2) и B/Ann Arbor/1/66ca, конструируют с тем же составом генома 6:2, но используют для этого методы обратной генетики [6, 10, 32]. Независимо от метода получения, кандидаты в ЖГВ сохраняют полный набор аттенуирующих мутаций и, как следствие, типичный для вакцинных штаммов ЖГВ температурочувствительный и холодоадаптированный фенотип.

Инактивированные реассортантные гриппозные вакцины

Штаммы для ИГВ готовят методом классической реассортации [35]. В отличие от ЖГВ, требования к штаммам для ИГВ более гибкие и допускают разнообразные сочетания генов от «дикого» вируса и донорского штамма. В качестве доноров внутренних генов используют высокоурожайные вирусы A/PR/8/34 (H1N1), A/Texas/1/77 (H3N2), B/Lee/40 или реассортантные вакцинные штаммы для ИГВ [35]. В последнем случае в состав генома реассортанта для ИГВ могут входить гены от трех разных родительских вирусов [35]. При подготовке вакцинных штаммов для ИГВ должны соблюдаться два важных условия: 1) гены, кодирующие поверхностные белки HA и NA, принадлежат эпидемическому вирусу и 2) в состав генома входят гены (донора или эпидемического вируса), обеспечивающие высокую урожайность реассортанта. В частности, для получения реассортантов-кандидатов в ИГВ типа А с высокими титрами гемагглютинина необходим М-ген от донора A/PR/8/34 (H1N1) [7, 14, 20], а для кандидатов в ИГВ типа В – ген NP от донора B/Lee/40 [28, 36].

Особенности классической реассортации

При классической реассортации в РКЭ природа создает реассортанты, содержащие оптимальные жизнеспособные сочетания родительских генов; как правило, 6:2 реассортанты получаются достаточно легко. Однако иногда при классическом скрещивании в РКЭ желаемый состав генома 6:2 оказывается неоптимальным. Определенные композиции генома, и в том числе 6:2, могут оказаться функционально несовместимыми и имеют пониженную жизнеспособность. Как результат, в вирусном потомстве будут преобладать другие, более жизнеспособные комбинации. Целый ряд публикаций подтверждает это предположение. Так, Subbarrao и др. [49] не удалась реассортация вирусов гриппа человека A(H1N1) с вирусами гриппа чаек A(H13N6) с желаемым составом генома 6:2. Реассортанты вирусов гриппа A(H5N2) [42] или A(H1N1)pdm09 [17, 54] с формулой генома 5:3, полученные классическим способом, оказались более высокоурожайными, чем их 6:2 аналоги. Gilbertson и др. [15] продемонстрировали, что 5:3 реассортанты, содержащие ген PB1 от «дикого» вируса A(H1N1)pdm09, а HA и NA — от вирусов A(H5N1) или A(H7N9), обеспечивали более высокую урожайность, чем 6:2 варианты. Авторы предположили, что PB1 ген «дикого» вируса A(H1N1)pdm09 обеспечивает реассортантным вирусам преимущества в росте. В 2009 г. для улучшения репликационных свойств кандидатов в ИГВ были подготовлены два классических реассортантных вируса для ИГВ с формулой генома 5:3 (X-181 и X-181A) с тремя генами (PB1, HA и NA) от пандемического вируса A/California/07/2009 (H1N1)pdm09 и пятью — от донора A/PR/8/34 [17, 54]. Вероятно, для данных пар родительских вирусов формула 6:2 не была оптимальной.

5:3 реассортант для ЖГВ (гены HA, NA и М происходили от родителя «дикого» типа) по данным РТГА оказался более иммуногенным для мышей, чем его 6:2 аналог [59]. Классическая реассортация не привела и к получению 6:2 кандидатов в ЖГВ на основе вирусов гриппа птиц H5N2 или H5N1 и ХА донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2); авторами были получены только 7:1 реассортанты, унаследовавшие от «дикого» родителя единственный ген — НА [12, 26, 27]. Однако в клинических испытаниях живые гриппозные вакцины против потенциально пандемического гриппа H5N1, подготовленные на основе таких 7:1 реассортантов, были безопасны и иммуногенны [40, 41], не уступая в выраженности иммунного ответа сезонным ЖГВ.

Биологические свойства «дикого» родительского вируса, влияющие на эффективность его классической реасортации с донорским штаммом

Эпидемические вирусы гриппа обладают целым рядом уникальных биологических свойств, таких как температуроустойчивость/температурочувствительность репродукции при температурах, находящихся за верхними пределами температурного оптимума (38–40°С) [3, 4], чувствительность гемагглютинина к рН и высоким температурам [11, 33, 48], непосредственным образом связанная с его стабильностью, холодочувствительность/холодоустойчивость репродукции при температурах, находящихся за нижними пределами температурного оптимума (25–26°С) [4], чувствительность к неспецифическим гамма-ингибиторам сыворотки крови [3, 24, 31, 43], способность агглютинировать эритроциты определенных видов животных (современные вирусы гриппа A(H1N1)pdm09 и В агглютинируют эритроциты широкого спектра видов животных и птиц, таких как куры, индейки, лошади, морские свинки и человека 0 (I) группы крови, в то в ремя как вирусы A(H3N2) вступают в реакцию гемагглютинации только с эритроцитами морской свинки и человека) [18, 51, 55].

Из-за особенностей селектирующих факторов классического скрещивания эпидемических вирусов с ХА донорами аттенуации живой гриппозной вакцины, два момента оказывают существенное влияние на эффективность реассортации — холодочувствительность/холодоустойчивость репродукции эпидемических вирусов и их чувствительность к неспецифическим гамма-ингибиторам сыворотки крови. Под эффективностью реассортации в данном контексте мы подразумеваем эффективность (%) выхода реассортантов с формулой генома 6:2.

В схему подготовки реассортантов для инактивированной гриппозной вакцины входят пассажи только при оптимальной температуре инкубации [35], поэтому здесь фактор устойчивости/чувствительности «дикого» родительского вируса к пониженной температуре роли не играет. В данном случае остается только одно свойство «дикого» родительского вируса, которое может повлиять на эффективость реассортации — его ингибиторочувствительность.

Чувствительность вирусов «дикого» типа к неспецифическим термостабильным сывороточным гамма-ингибиторам

Среди биологических свойств вирусов гриппа особое место занимает их чувствительность к неспецифическим термостабильным гамма-ингибиторам сыворотки [24, 31, 43]. Из-за различной рецепторной специфичности вирусы гриппа «дикого» типа проявляют заметные различия в ингибиторочувствительности. Вирусы гриппа А(H3N2), которые преимущественно связываются с рецепторами альфа-2,6, высокочувствительны к сывороточным термостабильным гамма-ингибиторам, в то время как штаммы А(H1N1) с альфа-2,3 или смешанной альфа-2,3/альфа-2,6 специфичностью проявляют устойчивый к гамма-ингибиторам фенотип [21, 37, 38]. Что касается вирусов гриппа В, то до 1970–80-х гг. подавляющее их большинство обладало ингибитороустойчивым фенотипом. После разделения в 1980-х гг. вирусов гриппа В на две генетические линии, B/Victoria и B/Yamagata [39], викторианские вирусы сохранили высокий уровень устойчивости к ингибиторам, а вирусы линии B/Yamagata приобрели к ним высокую чувствительность [5].

Использование антидонорской сыворотки при приготовлении вакцинных штаммов методом классического скрещивания в РКЭ [46, 47, 53] обеспечивает избирательное преимущество реассортантов в наследовании HA и NA от антигенно релевантного вируса «дикого» типа. Однако получение 6:2 реассортантов на основе ингибиторочувствительных «диких» вирусов может быть существенно затруднено неспецифическим связыванием их НА с термостабильными гамма-ингибиторами, сохраняющимися в любой сыворотке после ее обработки рецептор-разрушающим ферментом и, таким образом, постоянно присутствующими и в сыворотке против донорского вируса [2, 21].

Данные, представленные в [2, 21], были использованы нами для построения рисунка. Анализ состава генома 883 реассортантов, полученных методом классической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах ХА доноров аттенуации с 40 вирусами гриппа «дикого» типа, обладающими разной степенью чувствительности к неспецифическим гамма-ингибиторам, выявил следующую закономерность: вне зависимости от чувствительности или устойчивости эпидемических родительских штаммов к ингибиторам все реассортанты унаследовали HA от «дикого» родителя; при этом принадлежность остальных генов варьировала. Большинство реассортантов на основе ингибитороустойчивых вирусов «дикого» типа (89%) унаследовали «дикую» NA; при этом около трети полученных реассортантов (31%) обладали вакцинной формулой генома 6:2 (рис., А).

Напротив, эффективность получения 6:2 реассортантов была значительно ниже (7%), если «дикий» родительский вирус обладал высокой степенью чувствительности к неспецифическим термостабильным гамма-ингибиторам. В этом случае наблюдалось нарушение констелляции генов, кодирующих HA и NA — только четверть всех реассортантов унаследовали от «дикого» вируса одновременно и HA, и NA, а три четверти — «дикий» HA и донорскую NA. При этом 25% составили реассортанты с формулой генома 7:1 (рис., Б).

 

Рисунок. Геномный состав реассортантов (в %), полученных методом классической реассортации ХА доноров аттенуации для ЖГВ с (А) 20 резистентными или (Б) 20 чувствительными к неспецифическим термостабильным гамма-ингибиторам «дикими» вирусами гриппа A(H1N1), A(H2N2), A(H3N2), B/Victoria и B/Yamagata (по материалам [2, 21])

Примечание. Состав генома 6:2 — HA и NA унаследованы от «дикого» родителя, а 6 внутренних генов унаследованы от донора; состав генома 5:3 — HA, NA и один из внутренних генов унаследованы от «дикого» родителя, остальные пять внутренних генов унаследованы от донора; состав генома 7:1 — HA унаследован от «дикого» родителя, все внутренние гены и NA унаследованы от донора.

 

Таким образом, чувствительность вирусов «дикого» типа к ингибиторам становится серьезным препятствием для эффективного приготовления методом классической реассортации вакцинных реассортантов 6:2 для ЖГВ, поскольку в процессе скрининга участвует иммунная сыворотка против донорского штамма, содержащая значительное количество термостабильных гамма-ингибиторов. Наоборот, устойчивость к ингибиторам гарантирует более быстрый и стабильный результат при получении вакцинных штаммов. Разработка ЖГВ на основе классического метода реассортации выиграла бы, если бы ВОЗ рекомендовала для производства вакцин вирусы с высоким уровнем устойчивости к ингибиторам. С другой стороны, чувствительные к ингибиторам вирусы предпочитают альфа-2,6-связи [38], более характерные для вирусов гриппа млекопитающих. Поэтому на данный момент вопрос, каким должен быть вакцинный штамм — чувствительным или устойчивым к ингибиторам, остается открытым.

Холодоустойчивость репродукции эпидемических вирусов при температурах, находящихся за нижними пределами температурного оптимума

В природе циркулируют не только термочувствительные вирусы, которых достаточно много, но иногда появляются и холодоустойчивые вирусы, размножающиеся при температуре инкубации, пониженной до 25–26°С [23]. Для «диких» вирусов использование термина «ХА» (холодоадаптированные) не совсем корректно, так как эти вирусы не были адаптированы к низким температурам путем искусственных лабораторных манипуляций. Уместнее было бы говорить о вирусах «дикого» типа, обладающих естественной устойчивостью к низким температурам.

ХА-фенотип природно устойчивых к холоду эпидемических вирусов гриппа нарушает те этапы процесса подготовки ХА вакцинных штаммов для ЖГВ, которые осуществляются при пониженной до 25–26°C температуре. Потеря ХА-селективного фактора может привести к значительному увеличению общего числа ХА-реассортантов, но количество реассортантов для ЖГВ с желаемым составом генома 6:2 уменьшится.

Поскольку этап холодовой инкубации в процессе подготовки вакцинных штаммов ИГВ отсутствует, свойство природной холодоадаптированности, присущее отдельным «диким» вирусам, не отражается негативно на эффективности приготовления вакцинного штамма.

Плюсы и минусы обратной генетики

Преимущества метода обратной генетики при подготовке гриппозных вакцин

Открытие полимеразной цепной реакции [44] и технологии обратной генетики на основе плазмид [16] дали возможность не только реконструировать реликтовые [50, 52] и современные эпидемические вирусы гриппа, но и быстро и бесперебойно создавать реассортантные штаммы для гриппозных вакцин [9, 16, 34]. Обратно-генетический подход имеет ряд неоспоримых преимуществ при получении вакцинных штаммов. Технологии обратной генетики позволяют искусственно манипулировать геномом вируса гриппа и являются мощным инструментом для создания «суррогатного» реассортантного вируса с любым желаемым геномным составом. Кроме того, обратно-генетический подход снижает вероятность спонтанного появления нежелательных мутаций [13, 17, 34]. Во время пандемии гриппа, когда необходимо очень быстро произвести большое количество вакцин, метод обратной генетики может быть предпочтительнее классического подхода. Более того, только он позволяет получать кандидатные реассортантные вакцины против высокопатогенных вирусов птичьего гриппа с делецией детерминант высокой патогенности в гене, кодирующем гемагглютинин (многоосновный сайт расщепления) [17].

Говоря о преимуществах обратно-генетических технологий не следует забывать, что круг гриппозных вакцин очень широк и не ограничивается только лицензированными классическими реассортантными вакцинами, ИГВ и ЖГВ. В настоящее время активно разрабатываются вакцины нового поколения, такие как разнообразные универсальные вакцины, основанные на векторных и других технологиях, и их конструирование невозможно без методов обратной генетики [25, 29].

Недостатки метода обратной генетики при подготовке реассортантных гриппозных вакцин

Все вышесказанное касалось неоспоримых преимуществ метода обратной генетики. Однако у него есть и другая сторона. Теоретически этот метод кажется быстрее, так как в этом случае нет необходимости тратить время на первые этапы классической реассортации. На самом деле качество этого метода не всегда может быть удовлетворительным; реассортанты, принудительно полученные искусственным путем, могут оказаться менее жизнеспособными, обладающими невысокой репродуктивной активностью, из-за чего могут потребоваться дополнительные пассажи вирусного потомства в РКЭ для достижения дополнительной адаптации и повышения инфекционных титров вируса [8].

Одна из причин, по которой классический метод реассортации для производства гриппозных вакцин может быть предпочтительнее подходов обратной генетики, заключается в том, что он позволяет осуществлять естественный отбор вариантов с оптимальным набором мутаций, улучшающим ростовые свойства реассортанта в РКЭ [14, 60]. Это важно, поскольку производство живых гриппозных вакцин базируется на использовании РКЭ. При реассортации, проводимой методом классического скрещивания вируса «дикого» типа с донорским штаммом, вирусное потомство проходит не менее 7 пассажей в РКЭ (скрещивание родительских вирусов, два селективных пассажа, при необходимости — 1–2 слепых пассажа, 2–3 клонирования и накопление отобранного реассортанта) [22, 30, 46, 47, 53]. Следует также учитывать и те пассажи, которые осуществляются уже на производстве. В результате вирусное потомство приобретает дополнительные адаптационные к репродукции в РКЭ мутации, что приводит к преимущественному отбору быстрорастущих реассортантов, эффективно размножающихся в РКЭ. Это можно сравнить с процессом микроэволюции вируса, в результате которой в куриных эмбрионах происходит естественный отбор наиболее жизнеспособных и наиболее приспособленных к репликации в РКЭ клонов.

Известны случаи, когда методом классической реассортации вообще не удавалось получить реассортанты с желаемой формулой генома 6:2 [26, 27, 49]. В такой ситуации на помощь может прийти обратная генетика, которая позволит принудительно сконструировать реассортант с нужной формулой генома. Однако следует учитывать, что природа не терпит насилия. Будет ли такой реассортант 6:2 достаточно хорош? Нужно ли идти против природы, если оптимальная констелляция генов для данной пары родительских вирусов не 6:2, а, например, 5:3 или 7:1? Что лучше — генно-инженерная 6:2 конструкция сомнительного качества или высокопродуктивный реассортант 7:1, полученный естественным путем? Эти вопросы все еще ждут ответов.

Заключение

Оба описанных в обзоре метода имеют свои сильные и слабые стороны, свои достоинства и недостатки. В каких случаях лучше использовать методы классической реассортации, а в каких — обратно-генетические подходы? Очевидно, что если речь идет о, например, создании векторных вакцин, когда нужно изменить ангитенную структуру вируса-носителя путем встраивания в него антигенно-значимых эпитопов чужеродного патогена, то это возможно только с использованием методов обратной генетики. В случае же создания классических гриппозных вакцин, живых или инактивированных, методы обратной генетики и классической реассортации могут эффективно дополнять друг друга.

About the authors

Irina V. Kiseleva

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: irina.v.kiseleva@mail.ru

DSc (Biology), Professor, Head of the Laboratory of General Virology; Professor, Department of Fundamental Problems of Medicine and Medical technologies

Russian Federation, St. Petersburg

Larisa G. Rudenko

Institute of Experimental Medicine

Email: irina.v.kiseleva@mail.ru

DSc (Мedicine), Professor, Head of the A.A. Smorodintsev Department of Virology

Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files