Immune response evaluation in the guinea pigs after immunization with the experimental Puumala virus vaccine

Cover Page

Cite item

Abstract

In the Russian Federation, the vaccine against hemorrhagic fever with renal syndrome is at the stage of preclinical and clinical trials. The aim of the study was to analyze an effect of vaccine schedule on neutralizing antibodies (nAB) dynamics in guinea pig models applied with experimental Puumala virus based hantavirus vaccine (HV). Quantitative evaluation of neutralizing antibodies was presented as antibody titer geometric mean expressed in binary logarithms (log2) by the 50% reduction of focus-forming units (FRNT50) in Vero cell in the focus reduction neutralization test. The HV dual inoculation to guinea pigs was carried out in 14 day intervals, booster injection was applied on day 182 after the onset, in the thigh muscle tissue by using 0.3 ml undiluted (HV-u/d) and in the 1/10 dilution (HV-1/10). nAB titer on day 14 after the first HV-u/d and HV-1/10 injection was measured to be at titer of 5.5±0.3 and 4.8±0.3, respectively. After the second injection, the nAB peak was as high as 9±0.2 on day 42 after the first HV-u/f injection, and 6.5±0.2 on day 14 after the HV-1/10 injection. nAB decreased down to 6.2±0.3 and 5±0.3, respectively, on day 364 after the first injection. The booster HV-u/d and HV-1/10 injection induced increase in nAB up to 9.5±0.3 and 6.5±0.3, respectively. After the booster injection, it induced significantly higher nAB observed on day 238 after the first HV-u/d injection and delayed up to the 294 day for the HV-1/10. The results of the study indicated the early formation of the immune response, long-term nAB persistence and significantly enhanced immune response after the booster injection on day 182, which indicated a potential for the booster injection a year later. The immunological efficacy and protective activity of the vaccine schedule may be finally assessed according to the results of clinical trials.

Full Text

Введение

Хантавирус Пуумала является одним из шести возбудителей геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Патогенные хантавирусы в составе рода Orthohantavirus входят в cемейство Hantaviridae, порядок Bunyavirales [11]. Более 97% всех случаев геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) в России этиологически обусловлены вирусом Пуумала, около 3% — другими 5 возбудителями ГЛПС — вирусами Хантаан, Сеул, Амур, Куркино и Сочи [10], что указывает на ведущую этиологическую роль вируса Пуумала в структуре заболеваемости ГЛПС в России.

Отсутствие тенденции к снижению заболеваемости ГЛПС, расширение ареала инфекции, отсутствие специфических средств лечения и малая эффективность неспецифической профилактики обуславливают социальную и медицинскую значимость внедрения вакцины для профилактики ГЛПС [10].

Успех вакцинации зависит от качества, величины и длительности генерируемого адаптивного иммунного ответа, что в свою очередь зависит от схемы дозирования иммуногена [5].

В последние годы наблюдается тенденция пересмотра схем дозирования вакцин, используемых на регулярной основе, как это произошло с вакциной Превенар 13® (Pfizer) для профилактики пневмококовой инфекции, с установленной оптимальной схемой введения двух доз с двухнедельным интервалом и третьей в качестве бустера [6]. Подобному пересмотру подверглись схемы введения вакцин Imovax® (Sanofi Pasteur) против полиомиелита, RabAvert® (Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH) против бешенства человека с целью сокращения количества доз вакцины с 5 до 4 доз [9]; для Gardasil®9 (Merck), четырехвалентной Gardasil® (Merck) и двухвалентной Cervarix® (GlaxoSmithKline) против вируса папилломы человека — с 3 доз до 2 в возрасте до 15 лет [8].

В этой связи целесообразно подбирать оптимальную схему дозирования вакцин для поддержания приемлемого уровня защитных гуморальных антител до выхода на клинические испытания, позволив избежать пересмотра схемы вакцинации в будущем. Как было показано в предыдущих исследованиях, уровень нАТ у мышей BALB/c после иммунизации кандидатными вакцинами для профилактики ГЛПС после двух иммунизаций с двухнедельными интервалами не отличался от такового после трех иммунизаций с тем же интервалом. В результате оптимальной схемой дозирования для последующих экспериментов было принято применение двукратной иммунизации с третьей в виде бустерного введения [7].

Морские свинки (Cavia porcellus) представляют собой ценную и подтвержденную экспериментальную модель животных из-за ряда биологических сходств с людьми [2]. Использование морских свинок позволяет сократить количество экспериментальных животных, при этом позволяет увеличить длительность эксперимента до 3 лет. Для возбудителей ГЛПС отсутствует лабораторная модель инфекции, поэтому иммуногенную активность вакцинного препарата определяют по индукции нейтрализующих вирус антител. Таким образом целесообразность проведения экспериментов по оценке иммуногенности вакцинного препарата на морских свинках обусловлена возможностью оценить продолжительность иммунного ответа и влияние бустерного введения вакцины.

Целью данного исследования было изучение динамики нейтрализующих антител в сыворотках крови морских свинок в ответ на введение хантавирусного вакцинного препарата на основе вируса Пуумала с разной схемой дозирования иммуногена.

Материалы и методы

Хантавирусный вакцинный препарат (ХВП) был получен на основе штамма PUU-ТKD-VERO вируса Пуумала (ПУУ) по ранее описанной технологии [1]. Хроматографически очищенный на сорбенте Capto Core 700 (GE Healthcare) полуфабрикат с титром вируса 3,7±0,5 lg ФОЕ/мл и 2 × 104 копий РНК/мл инактивировали бета-пропиолактоном в разведении 1/6000. ХВП вводили по 0,3 мл в мышечную ткань бедра морских свинок в неразведенном виде (ХВП-н/р) и в разведении 1/10 (ХВП-1/10). Самки морских свинок были случайным образом распределены по 3 в каждой группе, содержались согласно ГОСТ 33216-2014. Иммунизировали свинок по схеме: 2 иммунизации (I-ИМ, II-ИМ) с двухнедельным интервалом и бустерное введение (БВ) на 182 день, забор крови каждые 14 дней от момента первой иммунизации пункцией сердца. Каждая проба сыворотки крови трехкратно исследована в реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток Vero E6. Результат представлен в виде среднегеометрического значения титра (СГТ) нАТ в двоичных логарифмах по 50% редукции числа фокусобразующих единиц (ФОЕ) [3]. Для количественной оценки РНК в вакцинном материале использовали ПЦР в режиме реального времени со штаммоспецифичными праймерами Ufa F_R, и зондом Ufa Z [4].

Статистический анализ. Полученные результаты анализировали в программе GraphPad Prism 9.4.1. Статистическую значимость различий определяли с помощью одностороннего ANOVA с тестом множественных сравнений Тьюка.

Результаты

В контрольных группах, так же, как и в экспериментальных группах, нАТ до иммунизации не выявлены в сыворотках крови, начиная с разведения 1/2. За приемлемый уровень нАТ принимали СГТ выше 4,32±0,2 log2 (рис.). Нейтрализующие антитела были выявлены у всех животных во всех экспериментальных группах в ответ на введение ХВП.

 

Рисунок. Средние титры нАТ в сыворотках крови морских свинок после первой (I-ИМ), второй (II-ИМ) иммунизаций и бустерного введения (БВ)

Figure. Mean nAB titers in guinea pigs blood sera after the first (I-IM), second (II-IM) and booster (BV) inoculation

Примечание. Средние титры нАТ в сыворотках крови морских свинок после первой (I-ИМ), второй (II-ИМ) иммунизаций и бустерного введения (БВ). Образцы крови получали в указанные временные интервалы. В дни 0, 14 и 182 образцы крови собирали перед иммунизацией. Экспериментальные группы: А — ХВП-н/р; ХВП-н/р-БВ; Б — ХВП-1/10; ХВП-1/10-БВ и контрольная группа (КГ). Титры нАТ определяли методом РН/ФОЕ50. ns — несущественно, ****p < 0,0001. Данные показывают средние геометрические титры нАТ против вируса Пуумала в группе с 95% доверительными интервалами.

Note. Mean nAT titers in guinea pigs blood sera after the first (I-IM), second (II-IM) immunizations and booster administration (BV). Blood samples were collected at the indicated time intervals. On days 0, 14 and 182, blood samples were collected prior to immunization. Experimental groups: A — HV-u/d; HV-u/d-BV; B — HV-1/10; HV-1/10-BV and control group (CG). nAT titers were measured by the FRNT50 method. ns — not significant, ****p < 0.0001. The data are shown as geometric mean nAb titers against Puumala virus in the group with 95% confidence intervals.

 

Через 2 недели после I-ИМ наблюдали статистически значимый подъем титра нАТ по сравнению с контрольной группой. Более выраженный иммунный ответ наблюдали в группе ХВП-н/р (СГТ = 5,5±0,3) в сравнении с ХВП-1/10 (СГТ = 4,8±0,3) с достоверной статистической разницей в титре нАТ (p < 0,0001) (рис.).

После II-ИМ в группе ХВП-н/р максимальное нарастание нАТ зафиксировано на 56 день (СГТ = 9±0,2) с постепенным снижением титра к 238 дню до 6,2±0,2. На этом уровне антитела оставались до 322 дня с последующим снижением до 5,2±0,3 к концу срока наблюдения. Бустерное введение ХВП на 182 день стимулировало иммунный ответ: максимальные титры антител, зафиксированные через 56 дней (238 дней после I-ИМ), достоверно превышали таковые после II-ИМ (СГТ = 9,48±0,3) (p = 0,001). К концу срока наблюдения уровень нАТ снижался до 7±0,3, статистически достоверно превышая таковой без бустерного введения ХВП-н/р (рис., А).

В группе ХВП-1/10 после II-ИМ максимальное нарастание нАТ зафиксировано на 28 день (СГТ = 6,5±0,3), к 56 дню наблюдалось снижение титра нАТ и далее, в течение 10 месяцев, наблюдалось некое плато с низким титром нАТ (СГТ = 5±0,3). Десятикратное снижение антигенной нагрузки все еще индуцировало иммунный ответ, хотя и на предельно низких значениях титра нАТ (рис., Б). Бустерное введение ХВП-1/10 характеризовалось медленным подъемом нАТ в течение 4-х месяцев до максимальных титров 7,5±0,2 (на 294 день после I-ИМ), которые оставались достоверно ниже таковых после бустерного введения ХВП-н/р. Также постепенно снижался титр нАТ и к концу наблюдения составил 5±0,2, сравнявшись с титром нАТ после двукратного введения ХВП-н/р без бустерного введения.

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

  1. Интенсивность гуморального иммунного ответа прямо пропорциональна дозе вводимого иммуногена.
  2. Выраженная динамика нарастания нАТ после бустерного введения в сравнении с ответом после I-ИМ и II-ИМ указывает на формирование устойчивой иммунной памяти.
  3. Бустерное введение иммуногена можно рассматривать через год от начала иммунизации, принимая во внимание тот факт, что нАТ все еще выявляются в эти сроки после двукратной иммунизации. Подтверждение этого положения должно быть получено в ходе клинических испытаний.
  4. Для определенных групп населения (дети, пожилые люди, лица, имеющие хронические заболевания) возможно будет целесообразным использование низких доз иммуногена. Ограничением является величина протективной дозы вакцинного препарата, определить которую возможно только по результатам клинических испытаний.
×

About the authors

S. S. Kurashova

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: svetlanak886@yandex.ru

PhD (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Hemorrhagic Fevers

Russian Federation, Moscow

M. V. Balovneva

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of the Russian Academy of Sciences

Email: mashasm@yandex.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Hemorrhagic Fevers

Russian Federation, Moscow

A. A. Ishmukhametov

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of the Russian Academy of Sciences; Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: ishmukhametov@chumakovs.su

RAS Full Member, PhD, MD (Medicine), Professor, General Director, Head of the Department of Organization and Research of Immunobiological Technologies

Russian Federation, Moscow; Moscow

R. D. Teodorovich

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of the Russian Academy of Sciences

Email: rostislavteo@mail.ru

Researcher, Laboratory of Hemorrhagic Fevers

Russian Federation, Москва

Yu. V. Popova

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of the Russian Academy of Sciences

Email: popova_jv@chumakovs.su

Researcher, Laboratory of Hemorrhagic Fevers

Russian Federation, Moscow

E. A. Tkachenko

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of the Russian Academy of Sciences

Email: evgeniytkach@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Scientific Supervisor

Russian Federation, Moscow

T. K. Dzagurova

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of the Russian Academy of Sciences

Email: dzaguron@gmail.com

PhD, MD (Medicine), Head of the Laboratory of Hemorrhagic Fevers

Russian Federation, Moscow

References

  1. Бархалева О.А., Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К. Вакцина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2011. Т. 41, № 1. С. 27–30. [Barkhaleva О.А., Vorobyeva М.S., Ladizhenskaya I.P., Tkachenko E.A., Dzagurova T.K. Vaccine against hemorrhagic fever with kidney syndrome. BIOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie = Biopreparations, 2011, vol. 1, pp. 27–30. (In Russ.)]
  2. Рыбакова А.В., Макарова М.Н. Использование морских свинок в биомедицинских исследованиях // Международный вестник ветеринарии. 2018. № 1. С. 132–137. [Rybakova A.V., Makarova M.N. The use of guinea pigs in biomedical research. Mezhdunarodnyi vestnik veterinarii = International Veterinary Bulletin, 2018, vol. 1, pp. 132–137 (In Russ.)]
  3. Dzagurova T.K., Klempa B., Tkachenko E.A., Slyusareva G.P., Morozov V.G., Auste B., Kruger D.H. Molecular diagnostics of hemorrhagic fever with renal syndrome during a Dobrava virus infection outbreak in the European part of Russia. J. Clin. Microbiol., 2009, vol. 47, no. 12, pp. 4029–4036. doi: 10.1128/JCM.01225-09
  4. Egorova M.S., Kurashova S.S., Ishmukhametov A.A., Balovneva M.V., Devyatkin A.A., Safonova M.V., Ozherelkov S.V., Khapchaev Yu.Kh., Balkina A.S., Belyakova A.V., Dzagurova T.K., Tkachenko E.A. Real-time PCR assay development for the control of vaccine against hemorrhagic fever with renal syndrome. Probl. Viral., 2021, vol. 66, no. 1, pp. 65–73. doi: 10.36233/0507-4088-30
  5. Ghimire T.R. The mechanisms of action of vaccines containing aluminum adjuvants: an in vitro vs in vivo paradigm. Springerplus, 2015, vol. 4, no. 1, pp. 1–18.
  6. Goldblatt D., Southern J., Andrews N. J., Burbidge P., Partington J., Roalfe L., Pinto V.M., Thalasselis V., Plestedd E., Richardson H., Snape M.D., Miller E. Pneumococcal conjugate vaccine 13 delivered as one primary and one booster dose (1+1) compared with two primary doses and a booster (2+1) in UK infants: a multicentre, parallel group randomised controlled trial. Lancet Infect. Dis., 2018, vol. 18, no. 2, pp. 171–179. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30654-0
  7. Kurashova S.S., Ishmukhametov A.A., Dzagurova T.K., Egorova M.S., Balovneva M.V., Nikitin N.A., Evtushenko E.A., Karpova O.V., Markina A.A., Aparin P.G., Tkachenko P.E., Lvov V.L., Tkachenko E.A. Various adjuvants effect on immunogenicity of Puumala virus vaccine. Front. Cell. Infect. Microbiol., 2020, vol. 10: 545371. doi: 10.3389/fcimb.2020.545371
  8. Meites E., Szilagyi P.G., Chesson H.W., Unger E.R., Romero J.R., Markowitz L.E. Human papillomavirus vaccination for adults: updated recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Am. J. Transplant., 2019, vol. 19, no. 11, pp. 3202–3206. doi: 10.1111/ajt.15633
  9. Mittal M.K. Revised 4-dose vaccine schedule as part of postexposure prophylaxis to prevent human rabies. Pediatr. Emerg. Care, 2013, vol. 29, no. 10, pp. 1119–1121. doi: 10.1097/PEC.0b013e3182a63125
  10. Tkachenko E.A., Ishmukhametov A.A., Dzagurova T.K., Bernshtein A.D., Morozov V.G., Siniugina A.A., Kurashova S.S., Balkina A.S., Tkachenko P.E., Kruger D.H., Klempa B. Hemorrhagic fever with renal syndrome Russia. Emerg. Infect. Dis., 2019, vol. 25, no. 12, pp. 2325–2328. doi: 10.3201/eid2512.181649
  11. Vaheri A., Strandin T., Hepojoki J., Sironen T., Henttonen H., Mäkelä S., Mustonen J. Uncovering the mysteries of hantavirus infections. Nat. Rev. Microbiol., 2013, vol. 11, no. 8, pp. 539–550.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. Figure. Mean nAB titers in guinea pigs blood sera after the first (I-IM), second (II-IM) and booster (BV) inoculation

Download (139KB)

Copyright (c) 2022 Kurashova S.S., Balovneva M.V., Ishmukhametov A.A., Teodorovich R.D., Popova Y.V., Tkachenko E.A., Dzagurova T.K.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies