Urine excreted antibodies significance in the hemorrhagic fever with renal syndrome specific diagnosis

Full Text

Введение

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) — зоонозное заболевание вирусной природы, широко распространенное в ряде стран Евразии, в России занимает ведущее место среди всех природноочаговых болезней человека.

Возбудители ГЛПС — хантавирусы, в соответствии с современной классификацией, в составе семейства Hantaviridae входят в отряд Bunyavirales.

Около 98% случаев ГЛПС, официально зарегистрированных в Российской Федерации, вызывает вирус Пуумала. Остальные 2% случаев этиологически обусловлены вирусами Хантаан, Амур, Сеул и двумя подтипами Куркино и Сочи вируса Добрава/Белград [4, 16]. Многообразие клинических проявлений, встречающихся в дебюте болезни также при целом ряде других заболеваний, определяет высокую значимость специфической диагностики ГЛПС. Иммунологические методы являются основными в специфической лабораторной диагностике ГЛПС. Использование молекулярных методов (ПЦР) ограничивается коротким периодом виремии, невысоким количественным содержанием вирусной РНК в крови и низкой чувствительностью тест-систем.

Непрямой метод флюоресцирующих антител (МФА) оказался определяющим в открытии возбудителей ГЛПС [15] и одним из первых методов, разработанных для иммунологической диагностики хантавирусных инфекций [1, 6].

К настоящему времени в арсенале диагностических препаратов для серодиагностики хантавирусных инфекций (выявление специфических иммуноглобулинов классов М, G и А) существует большое разнообразие методов иммуноферментного анализа (ИФА), основанных на рекомбинантных антигенах, полученных в различных экспрессионных системах [8, 10, 11, 13, 18]. Разработаны диагностические тест-системы, основанные на методах иммунохроматографии и иммуноблоттинга [7, 12]. Диагностическую значимость для серодиагностики ГЛПС имеет выявление в ранней стадии заболевания специфических IgM-антител, которые в большинстве случаев не определяются через 2–3 месяца после окончания острой фазы заболевания. Вместе с тем, в некоторых случаях продуцирование IgM-антител продолжается и до 2-х лет после острой фазы болезни. Дополнительные проблемы метода ИФА обусловлены неспецифическими реакциями, проявляющимися в виде ложноположительных или ложноотрицательных результатов [9]. В то же время непрямой метод иммунофлюоресценции для выявления антител к хантавирусам остается по-прежнему наиболее специфичным, уступая в этом отношении лишь реакции нейтрализации вируса [9].

Цель исследования — уточнение диагностической значимости выявления специфических антител к хантавирусам в моче у больных с подозрением на ГЛПС.

Материалы и методы

Для определения сроков появления и исчезновения антител к хантавирусам в моче больных ГЛПС были собраны 293 пробы мочи от 68 пациентов, поступивших в ГБУЗ Республиканскую клиническую инфекционную больницу № 4 г. Уфы. От каждого больного собирали от 3 до 6 проб мочи при поступлении и далее с 2-дневным интервалом до выписки из стационара. Помимо материала от больных, были исследованы сыворотки крови и пробы мочи, взятые через 1, 2, 3, 6 месяцев от начала заболевания от 15 реконвалесцентов ГЛПС тоже из г. Уфа. Кроме того, были исследованы сыворотки крови от 53 больных ГЛПС из стационаров Москвы, Московской и Самарской областей, главным образом с целью серотипирования антител для установления видовой принадлежности хантавируса — возбудителя ГЛПС, и пробы мочи, взятые (параллельно с сыворотками крови) в различные сроки от начала болезни.

Исследования на присутствие антихантавирусных антител (суммарно IgM и IgG) проводили методом МФА с использованием поливалентного «Диагностикума ГЛПС» («Диагностикум геморрагической лихорадки с почечным синдромом культуральный, поливалентный для непрямого метода иммунофлюоресценции» производства ФГАНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН») по инструкции производителя. Для серотипирования антител использовали культуральные моновалентные антигенные препараты, приготовленные на основе вирусов Пуумала и Добрава/Белград. Мочу для исследования в МФА предварительно концентрировали в 10 раз. Для этого 1 мл мочи центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин, после чего верхние 900 мкл аккуратно удаляли и оставшиеся 100 мкл ресуспендировали. Сконцентрированный образец мочи исследовали в двукратных разведениях, начиная с исходного. Значения количественных данных выражали в виде средних величин ± стандартное отклонение. Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 9.0 (San Diego, CA 92108). Для оценки взаимосвязи величин титра антител в сыворотке крови и моче определяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена — r_S. В зависимости от знака (+) или (–) корреляцию оценивали как прямую или обратную соответственно. Силу взаимосвязи определяли по величине коэффициента r_S. Сила взаимосвязи при r_S < 0,19 — очень слабая, r_S = 0,2–0,29 — слабая; r_S = 0,3–0,49 — умеренная.

Результаты и обсуждение

В результате серологического типирования антител в сыворотках крови больных ГЛПС было установлено, что все исследованные нами случаи ГЛПС были вызваны вирусом Пуумала.

Для определения динамики титра антител в моче проанализировано 345 проб мочи, взятых от 110 больных с 3 по 30 день болезни, в том числе 293 пробы мочи, взятых в динамике от 68 больных (инфекционная больница № 4 г. Уфы). На 3, 4 и 5 день болезни антитела в моче определили у 85,7, 89,4 и 93,1% больных соответственно. С 6 дня болезни антитела в моче определялись у 100% обследованных больных. За период пребывания в стационаре антитела в моче перестали обнаруживаться на 11 день болезни у 1 из 22, на 20 день — у 1 из 40 и у 2 из 26 пациентов на 30-й день болезни (табл. 1).

 

Таблица 1 Динамика выявления хантавирусных антител в моче больных ГЛПС

Table 1. Dynamics of urine hantavirus-specific antibodies in HFRS patients

День болезни Day after desease oncet		3	4	5	6	7	8	9	10	11	12–15	16–20	21–25	26–30
Обследовано проб Samples examined		7	19	29	20	31	24	29	26	22	64	40	22	26
АТ* Ab*	aбс. abs.	6	17	27	20	31	24	29	26	21	64	39	22	24
	%	86	89	93	100	100	100	100	100	96	100	97,5	100	92,3

Примечание. АТ — количество проб с хантавирусными антителами.

Note. Ab — number of samples positive for hantavirus antibodies.

 

Ранее было показано, что с использованием «Диагностикума ГЛПС» специфические антитела в моче больных ГЛПС, сконцентрированной в 10 раз, обнаруживались в 88,9% случаев с 3 по 21 день от начала лихорадки [5].

В данном исследовании детальный анализ динамики антихантавирусных антител в моче больных ГЛПС показал, что с 6 по 11 день с начала заболевания антитела определялись у 100% больных, а с 12 по 30 день, практически до выписки из стационара, — у 98% больных (табл. 1, рис. 1).

 

Рисунок 1. Выявление антител к хантавирусам в моче больных и реконвалесцентов ГЛПС

Примечание. Во временном промежутке 12–15, 16–20, 21–25, 26–30 процент проб мочи, содержащих антихантавирусные антитела, подсчитан относительно числа проб, взятых от больных в этом периоде болезни.

 

Для определения длительности периода экскреции антител с мочой исследовали пробы мочи, взятые от 15 реконвалесцентов через 1, 2, 3 и 6 месяцев от начала заболевания. На фоне незначительного снижения титра антител в крови, присутствие антител в моче выявлено у 13 пациентов (86,7%) через 1 месяц, у 7 пациентов (46,7%) через 2 месяца и у 3 пациентов (20%) через 3 месяца. Как видно из табл. 2, присутствие антител в моче реконвалесцентов ГЛПС к 6-му месяцу от начала заболевания не было установлено.

 

Таблица 2. Выявление специфических антител в крови и моче реконвалесцентов ГЛПС

Table 2. Hantavirus antibodies detection in the blood and urine of HFRS convalescents

№ пациента Patient’s no.	Титр антител (МФА) Antibody titer (IFA)
	1 месяц 1month		2 месяца 2 months		3 месяца 3 months		6 месяцев 6 months
	кровь blood	моча urine	кровь blood	моча urine	кровь blood	моча urine	кровь blood	моча urine
2	32 000	8	32 000	4	32 000	0	32 000	0
6	32 000	2	32 000	4	32 000	1	32 000	0
7	16 000	2	16 000	1	16 000	2	16 000	0
12	64 000	4	32 000	0	32 000	0	н/и | n/i	н/и | n/i
14	32 000	4	32 000	0	32 000	0	н/и | n/i	н/и | n/i
19	64 000	16	64 000	0	64 000	0	н/и | n/i	н/и | n/i
20	32 000	4	64 000	0	64 000	0	64 000	0
23	64 000	4	64 000	8	32 000	0	32 000	0
26	64 000	0	64 000	0	1024	0	1024	0
28	128 000	2	32 000	2	32 000	2	32 000	0
30	64 000	8	64 000	0	64 000	0	н/и | n/i	н/и | n/i
33	64 000	4	32 000	4	32 000	0	32 000	0
45	128 000	0	32 000	0	32 000	0	н/и | n/i	н/и | n/i
46	32 000	2	16 000	2	16 000	0	н/и | n/i	н/и | n/i
58	128 000	4	64 000	0	32 000	0	н/и | n/i	н/и | n/i
АТ в моче Ab in urine	13/15 (86,7%)		7/15 (46,7%)		3/15 (20%)		0

Примечание: н/и — не исследовали.

Note. n/i — not investigated.

 

С целью определения количественного содержания антител, экскретируемых с мочой, были исследованы методом титрования 345 проб мочи от 83 пациентов. Наиболее высокое содержание выделяемых с мочой специфических иммуноглобулинов отмечали с 5 по 11 сутки от начала лихорадки (рис. 2), что соответствует олигурическому периоду болезни.

 

Рисунок 2. Зависимость количества экскретируемых с мочой антител от времени, прошедшего с начала заболевания

Примечание. Градация на оси абсцисс имеет условный характер.

 

Для уточнения зависимости количества выделяемых с мочой антител от титра антител, циркулирующих в крови пациентов, были параллельно обследованы пробы мочи и крови, взятые в один день. Показано, что в олигурическом периоде болезни имеет место умеренная прямая положительная корреляционная зависимость (r_S = 0,4) количественного содержания антител в сыворотке крови и моче (рис. 3). Вероятно, это объясняется тем, что в этот период болезни степень повреждения эндотелия почечных капилляров максимально выражена и количество выделяемых с мочой антител, в большинстве случаев, пропорционально их содержанию в крови. В то же время выявлена незначимая отрицательная корреляционная зависимость (r_S = –0,2) количественного содержания антител, обнаруженных в сыворотке крови и моче, собранных в интервале с 11 по 28 день болезни. В этом временном интервале степень повреждения капилляров, а также функциональная способность почек имеют широкий диапазон индивидуальных различий. Так, в отдельных случаях даже при невысоких титрах антител в крови их экскреция с мочой была значительной (сильное повреждение капилляров) и наоборот, незначительное количественное содержание антител в моче наблюдалось при их высоких титрах в крови (незначительное повреждение капилляров и менее выраженное нарушение функции почек), что характерно для периода реконвалесценции.

 

Рисунок 3. Корреляционная зависимость количественного содержания антител, выявленных в сыворотке крови и моче (n = 46) с 5 по 12 сутки (олигурический период болезни)

 

Для серологической диагностики инфекционных заболеваний, в том числе ГЛПС, в настоящее время широко используются иммуноферментные тест-системы. В то же время для хантавирусных инфекций по-прежнему высокоактуальным остается применение непрямого метода иммунофлюоресценции. Диагностическая значимость этого метода обусловлена его высокой специфичностью [9, 14] и простотой исполнения. Специфические антитела к хантавирусам — возбудителям ГЛПС, очевидно, сохраняются пожизненно [3, 9]. В этой связи диагностическую значимость имеет 4-кратное нарастание титров антител в парных сыворотках крови, взятых с 2–4-дневным интервалом. Это касается как определения антител в МФА (суммарно IgM и IgG), так и антител классов IgG и IgM, выявляемых иммуноферментными методами. Ввиду того, что к 6–8 дню болезни титры антител к хантавирусам, выявляемых МФА, у большинства пациентов выходят на плато [2], при взятии первой сыворотки крови после 6 дня болезни последующее нарастание титра антител может отсутствовать. В этом случае надежным критерием острого периода хантавирусной инфекции является обнаружение антихантавирусных антител одновременно в крови и моче.

В результате настоящего исследования уточнены сроки выявления антител в моче больных ГЛПС как в остром периоде, так в периоды ранней и поздней реконвалесценции. Установлено, что в периоде реконвалесценции выделение антител с мочой продолжалось через 1, 2 и 3 месяца от начала заболевания в 86,7, 46 и 20% случаев соответственно, и лишь через 6 месяцев ни у одного из обследованных больных антитела в моче не удалось обнаружить. Вероятно, эта закономерность отражает процесс длительного восстановления функциональной способности почек. Как известно, в моче в норме присутствуют лишь следы IgG. Обнаружение специфических антител в моче больных ГЛПС свидетельствует о повышении уровня IgG, что указывает на неизбирательную гломерулопатию или смешанную клубочково-канальцевую патологию [17]. Одновременное обнаружение хантавирусных антител в крови и моче лихорадящих больных с помощью «Диагностикума ГЛПС» является достоверным диагностическим критерием острого периода хантавирусной инфекции, и позволяет установить специфический диагноз при поступлении в стационар на 3, 4, 5, 6–10 день от начала заболевания в 85,7, 89,4, 93,1 и 100% случаев соответственно, не прибегая к исследованию антител в парных сыворотках крови. Ранняя диагностика ГЛПС позволяет своевременно назначать патогенетическую терапию и определять тактику ведения пациентов, что в значительной степени предупреждает развитие тяжелых осложнений и снижает летальность при этой тяжелой инфекции.

About the authors

T. K. Dzagurova

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Author for correspondence.
Email: centrglps@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6656-1682
SPIN-code: 8373-2503

PhD, MD (Medicine), Head of the Laboratory of Hemorrhagic Fevers

Russian Federation, Moscow

R. T. Murzabaeva

Bashkir State Medical University, Ministry of Health of Russia

Email: rmurzabaeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9132-4697

PhD, MD (Medicine), Professor

Russian Federation, Ufa

F. G. Kutluguzhina

Republic Clinical Diseases Hospital

Email: fagilya1974@gnail.com
ORCID iD: 0000-0002-7908-802X

Head of the Diagnostic Department

Russian Federation, Ufa

V. G. Morozov

Medical Company “Hepatolog”

Email: viacheslavmorozov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4451-7891

PhD, MD (Medicine), Professor, Director of the Medical Company “Hepatolog”

Russian Federation, Samara

E. V. Volnyh

Novokuibyshevsk Central City Hospital

Email: e.volnykh@bk.ru

Head of the Infectious Diseases Department

Russian Federation, Novokuibyshevsk, Samara Region

S. S. Kurashova

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Email: svetlanak886@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9934-699X

PhD (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Hemorrhagic Fevers

Russian Federation, Moscow

M. V. Balovneva

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences’’ (Institute of Poliomyelitis)

Email: machasm@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2198-7521

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Hemorrhagic Fevers

Russian Federation, Moscow

P. E. Tkachenko

Sechenov First Moscow State Medical University

Email: dr.ptk@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0605-323X

PhD (Medicine), Assistant Professor, Department of Internal Diseases Propaedeutics

Russian Federation, Moscow

A. A. Ishmukhametov

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis); Sechenov First Moscow State Medical University

Email: aishmukhametov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6130-4145

RAS Full Member, PhD, MD (Medicine), Professor, General Director, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis); Head of the Department of Organization and Research of Immunobiological Technologies

Russian Federation, Moscow; Moscow

A. V. Belyakova

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Email: belyakowa.all@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4363-6394

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Hemorrhagic Fevers

Russian Federation, Moscow

E. A. Tkachenko

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Email: evgeniytkach@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6829-1241

PhD, MD (Medicine), Professor, Scientific Supervisor

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files