Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI92210.15789/2220-7619-2019-3-4-476-484ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИSuppression of hepatitis b virus by a combined activity of CRISPR/Cas9 and HBx proteinsПодавление цикла вируса гепатита в под действием нуклеолитических систем CRISPR/Cas9 и белка HBxBrezginS. A.БрезгинС. А.
Russian Federation

Junior Researcher, Laboratory of Viral Hepatitis;

PhD Student, Laboratory of Clinical Pharmacology No. 73,

Moscow

младший научный сотрудник лаборатории вирусных гепатитов;

аспирант лаборатории № 73 клинической фармакологии,

Москва

sb@rcvh.ruKostyushevaA. P.КостюшеваА. П.
Russian Federation

Junior Researcher, Laboratory of Viral Hepatitis,

111123, Moscow, Novogireevskaya str., 3A

младший научный сотрудник лаборатории вирусных гепатитов,

111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3А

ak@rcvh.ruSimirskyV. N.СимирскийВ. Н.

PhD (Biology), Senior Researcher,

Moscow

к.б.н., старший научный сотрудник,

Москва

simir@mail.ruVolchkovaE. V.ВолчковаЕ. В.
Russian Federation

PhD, MD (Medicine), Professor, Professor of the Department of Infectious Diseases, Head of the Department of Infectious Diseases on Faculty of Preventive Medicine,

Moscow

д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней, зав. кафедрой инфекционных болезней медико-профилактического факультета,

Москва

ChistyakovD. S.ЧистяковД. С.

Laboratory Technician, 

Moscow

лаборант,

Москва

KostyushevD. S.КостюшевД. С.

Researcher, 

Moscow

научный сотрудник,

Москва

dchistakoff@gmail.comChulanovV. P.ЧулановВ. П.

PhD, MD (Medicine), Head of the Laboratory of Viral Hepatitis;

Professor of the Department of Infectious Diseases, Faculty of Preventive Medicine,

Moscow

д.м.н., зав. лабораторией вирусных гепатитов;

профессор кафедры инфекционных болезней медико-профилактического факультета,

Москва

vladimir.chulanov@rcvh.ruCentral Research Institute of Epidemiology, RospotrebnadzorФБУН Центральный НИИ эпидемиологии РоспотребнадзораInstitute of Immunology FMBAФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА РоссииKoltzov Institute of Developmental Biology of Russian Academy of SciencesИнститут биологии развития имени Н.К. Кольцова РАНI.M. Sechenov Moscow State Medical UniversityГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова МЗ РФ1511201993-44764842412201813032019Copyright ©; 2019, Brezgin S.A., Kostyusheva A.P., Simirsky V.N., Volchkova E.V., Chistyakov D.S., Kostyushev D.S., Chulanov V.P.Copyright ©; 2019, Брезгин С.А., Костюшева А.П., Симирский В.Н., Волчкова Е.В., Чистяков Д.С., Костюшев Д.С., Чуланов В.П.2019Brezgin S.A., Kostyusheva A.P., Simirsky V.N., Volchkova E.V., Chistyakov D.S., Kostyushev D.S., Chulanov V.P.Брезгин С.А., Костюшева А.П., Симирский В.Н., Волчкова Е.В., Чистяков Д.С., Костюшев Д.С., Чуланов В.П.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/922

Chronic hepatitis B is a severe liver disease associated with persistent infection with hepatitis B virus. According to recent estimations, 250 million people in the world are chronically infected, including 3 million chronically infected people in Russia. Antiviral therapeutics (nucleos(t)ide analogues and PEGylated interferon) suppress viral transcription and replication, but do not eliminate the virus from infected cells. The key reason for HBV persistency is a stable form of the viral genome (covalently closed circular DNA, cccDNA) that exists as a minichromosome protected from novel cccDNA-targeting therapeutics. Novel therapeutic approaches aimed at elimination or inactivation of cccDNA are urgently needed. CRISPR/Cas9 systems induce double strand breaks in target sites of DNA sequences. Experiments with CRISPR/Cas9 demonstrated high antiviral activity and efficient cleavage of cccDNA, but a small part of cccDNA pool remains intact. One of the main reasons of incomplete cccDNA elimination might be the structural organization of cccDNA, which persists in a heterochromatinized, very compacted form and is not be accessible to CRISPR/Cas9 systems. Viral protein HBx unwinds cccDNA and regulates cccDNA epigenetically by recruiting transcription-remodeling factors. In this work, we analyzed effects of CRISPR/Cas9 in combination with an HBxencoding plasmid or plasmids encoding mutant forms of HBx (HBxMut, which does not interact with pro-apoptotic factors Bcl-2 и Bcl-xL, and HBxNesm is localized exclusively in the nucleus and does not generate reactive oxygen species and double strand breaks in the genome). We showed that HBx improves CRISPR/Cas9 efficiency, decreasing pregenomic RNA transcription level over 98%. Moreover, we analyzed optimal ratios of plasmids encoding CRISPR/ Cas9 and HBx proteins for better antiviral efficacy. Furthermore, we discovered that HBx proteins do not have an effect on proliferation and viability of the transfected cells. In conclusion, CRISPR/Cas9 with HBx proteins exhibit high antiviral effect.

Вирус гепатита В (ВГВ) может вызывать хронический гепатит В (ХГВ) — тяжелое хроническое заболевание печени инфекционной природы. По последним данным официального статистического наблюдения, число больных ХГВ в мире превышает 250 млн человек, а в Российской Федерации составляет около 3 млн человек. Противовирусные препараты (аналоги нуклеоз(т)идов и пегилированный интерферон) подавляют репликацию и транскрипцию вируса, однако не способны полностью элиминировать его из организма. Причиной этого является стабильная форма генома ВГВ — кольцевая ковалентно замкнутая ДНК (ккзДНК), которая представляет из себя компактную минихромосому, экранированную от воздействия противовирусных препаратов. Необходимым шагом для излечения ХГВ является разработка новых терапевтических подходов, направленных на разрушение или инактивацию матриц ккзДНК. Системы сайтспецифических нуклеаз CRISPR/Cas9 способны вносить двуцепочечные разрывы в практически любые заданные участки ДНК. Ранние работы по использованию сайт-специфичных нуклеаз CRISPR/Cas9 для ВГВ продемонстрировали эффективное разрезание ккзДНК, однако деградации всех матриц добиться не удалось. Вероятно, причиной этого являются структурные особенности ккзДНК, которая может существовать в гетерохроматизированном состоянии, недоступном для действия белков-нуклеаз CRISPR/Cas9. Один из активаторов транскрипции, вирусный белок HBx, способен релаксировать структуру ккзДНК, привлекая к ним факторы, ремоделирующие хроматин. Белок HBx активирует транскрипцию ВГВ и способствует расплетению структуры ккзДНК, делая ее более доступной для систем CRISPR/Cas9. В данной работе было изучено влияние белка HBx дикого типа, а также мутантных, более безопасных форм НВх белка (HBxMut, который не взаимодействует с факторами Bcl-2 и Bcl-xL, и HBxNESM, который не вызывает образование активных форм кислорода и не индуцирует двуцепочечные разрывы в геноме) на эффективность систем CRISPR/Cas9. Выяснилось, что Нbх белок и его мутантные формы способны значительно увеличить эффективность систем CRISPR/Cas9, подавляя транскрипцию вирусной прегеномной РНК вплоть до 98%. Были определены оптимальные соотношения и концентрации плазмид, кодирующих элементы систем CRISPR/ Cas9 и белков HBx. Кроме того, было показано, что белки HBx в выбранном диапазоне концентраций не вызывают изменений пролиферации и жизнеспособности клеток. Таким образом, совместное действие систем сайт-специфических нуклеаз CRISPR/Cas9 и вирусного белка-активатора HBx значительно подавляет транскрипцию вируса гепатита В.

hepatitis B viruscircular covalently closed DNACRISPR/Cas9specificityHBx proteinmutant forms of HBx proteinвирус гепатита Вкольцевая ковалентно замкнутая ДНКCRISPR/Cas9белок HBxмутантные формы белка HBxРабота выполнена при поддержке гранта РНФ № 16-15-10426.1. Allweiss L., Dandri M. The Role of cccDNA in HBV Maintenance. Viruses, 2017, vol. 9, no. 6: 156. doi: 10.3390/v90601562. Belloni L., Pollicino T., De Nicola F., Guerrieri F., Raffa G., Fanciulli M., Levrero M. Nuclear HBx binds the HBV minichromosome and modifies the epigenetic regulation of cccDNA function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, vol. 106, no. 47, pp. 19975– 19979. doi: 10.1073/pnas.09083651063. Bock C.T., Schwinn S., Locarnini S., Fyfe J., Manns M.P., Trautwein C., Zentgraf H. Structural organization of the hepatitis B virus minichromosome. J. Mol. Biol., 2001, vol. 307, no. 1, pp. 183–196. doi: 10.1006/jmbi.2000.44814. Cha M.-Y., Kim C.-M., Park Y.-M., Ryu W.-S. Hepatitis B virus X protein is essential for the activation of Wnt/beta-catenin signaling in hepatoma cells. Hepatology, 2004, vol. 39, no. 6, pp. 1683–1693. doi: 10.1002/hep.202455. Dong C., Qu L., Wang H., Wei L., Dong Y., Xiong S. Targeting hepatitis B virus cccDNA by CRISPR/Cas9 nuclease efficiently inhibits viral replication. Antiviral Res., 2015, vol. 118, pp. 110–117. doi: 10.1016/j.antiviral.2015.03.0156. Forgues M., Marrogi A.J., Spillare E.A., Wu C.G., Yang Q., Yoshida M., Wang X.W. Interaction of the hepatitis B virus X protein with the Crm1-dependent nuclear export pathway. J. Biol. Chem., 2001, vol. 276, no. 25, pp. 22797–22803. doi: 10.1074/jbc.M1012592007. Ganem D., Prince A.M. Hepatitis B virus infection — natural history and clinical consequences. N. Engl. J. Med., 2004, vol. 350, no. 11, pp. 1118–1129. doi: 10.1056/NEJMra0310878. Geng X., Huang C., Qin Y., McCombs J.E., Yuan Q., Harry B.L., Xue D. Hepatitis B virus X protein targets Bcl-2 proteins to increase intracellular calcium, required for virus replication and cell death induction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012, vol. 109, no. 45, pp. 18471–18476. doi: 10.1073/pnas.12046681099. Kim S., Lee H.-S., Ji J.-H., Cho M.-Y., Yoo Y.-S., Park Y.-Y., Cho H. Nuclear expression of hepatitis B virus X protein is associated with recurrence of early-stage hepatocellular carcinomas: role of viral protein in tumor recurrence. J. Pathol. Transl. Med., 2016, vol. 50, no. 3, pp. 181–189. doi: 10.4132/jptm.2016.03.1810. Konerman M.A., Lok A.S. Interferon treatment for hepatitis B. Clin. Liver Dis., 2016, vol. 20, no. 4, pp. 645–665. doi: 10.1016/j.cld.2016.06.00211. Liu Y., Zhao M., Gong M., Xu Y., Xie C., Deng H., Wang Z. Inhibition of hepatitis B virus replication via HBV DNA cleavage by Cas9 from Staphylococcus aureus. Antiviral Res., 2018, vol. 152, pp. 58–67. doi: 10.1016/j.antiviral.2018.02.01112. Lucifora J., Xia Y., Reisinger F., Zhang K., Stadler D., Cheng X., Volz T. Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis B virus cccDNA. Science, 2014, vol. 343, no. 6176, pp. 1221–1228.13. Nassal M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut, 2015, vol. 64, no. 12, pp. 1972–1984. doi: 10.1136/gutjnl-2015-30980914. Ramanan V., Shlomai A., Cox D.B.T., Schwartz R.E., Michailidis E., Bhatta A., Bhatia S.N. CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus. Sci. Rep., 2015, vol. 5: 10833. doi: 10.1038/srep1083315. Seeger C., Sohn J.A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Mol. Ther. Nucleic Acids, 2014, vol. 3: e216. doi: 10.1038/mtna.2014.6816. Seeger C., Sohn J.A. Complete spectrum of CRISPR/Cas9-induced mutations on HBV cccDNA. Mol. Ther., 2016, vol. 24, no. 7, pp. 1258–1266. doi: 10.1038/mt.2016.9417. Shi H., Lu L., Zhang N.-P., Zhang S.-C., Shen X.-Z. Effect of interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha on hepatitis B virus following lamivudine treatment. World J. Gastroenterol., 2012, vol. 18, no. 27, pp. 3617–3622. doi: 10.3748/wjg.v18.i27.361718. Uusi-Mäkelä M.I.E., Barker H.R., Bäuerlein C.A., Häkkinen T., Nykter M., Rämet M. Chromatin accessibility is associated with CRISPR-Cas9 efficiency in the zebrafish (Danio rerio). PLoS One, 2018, vol. 13, no. 4: e0196238–e0196238. doi: 10.1371/journal. pone.019623819. Verkuijl S.A., Rots M.G. The influence of eukaryotic chromatin state on CRISPR-Cas9 editing efficiencies. Curr. Opin. Biotechnol., 2018, vol. 55, pp. 68–73. doi: 10.1016/j.copbio.2018.07.00520. WHO. Global hepatitis report 2017. World Health Organization, 2017.21. Yue D., Zhang Y., Cheng L., Ma J., Xi Y., Yang L., Xiang R. Hepatitis B virus X protein (HBx)-induced abnormalities of nucleic acid metabolism revealed by 1 H-NMR-based metabonomics. Sci. Rep., 2016, vol. 6: 24430. doi: 10.1038/srep24430