Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI85110.15789/2220-7619-2019-5-6-773-778ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИNext-generation sequencing of drug resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates in low-incidence countriesСеквенирование следующего поколения лекарственноустойчивых клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis в странах с низким уровнем заболеваемостиSodjaE.СодьяЭ.
Slovenia

Sodja Eva, PhD, Research Associate, National Reference Laboratory for Mycobacteria

Golnik 36, 4204 Golnik, Slovenia.

Phone: +386 4 2569 409. Fax: +386 4 2569 117.

Содья Эва, кандидат наук, научный сотрудник Национальной микобактериологической референс-лаборатории

Голник 36, 4204 Голник, Словения.

Тел.: +386 4 2569 409. Факс: +386 4 2569 117.

eva.sodja@klinika-golnik.siToplakN.ТоплакН.
Slovenia

PhD, Field Application Specialist for Molecular Biology, Research Team of Omega d.o.o.

кандидат наук, специалист в области молекулярной биологии, научная группа Omega d.o.o.

natasa.toplak@omega.siKorenS.КоренС.
Slovenia

PhD, Manager of Life Science Perkin Elmer and Field Application Specialist, Research Team of Omega d.o.o.

кандидат наук, менеджер Life Science Perkin Elmer и научной группы Omega d.o.o.

simon.koren@omega.siKovačM.КовачМ.
Slovenia

Manager of Thermo Fisher Scientific Sales Team and Research Team of Omega d.o.o.

кандидат наук, менеджер по продажам Thermo Fisher Scientific и научной группы Omega d.o.o.

minka.kovac@omega.siTrudenS.ТруденС.
Slovenia

MSc, Analytics, National Reference Laboratory for Mycobacteria

магистр, специалист Национальной микобактериологической референс-лаборатории

sara.truden@klinika-golnik.siŽolni-DovčM.Жолнир-ДовчМ.
Slovenia

PhD, Head of National Reference Laboratory for Mycobacteria

кандидат наук, зав. Национальной микобактериологической референс-лабораторией

manca.zolnir@klinika-golnik.siUniversity Clinic of Respiratory and Allergic Diseases GolnikУниверситетская клиника респираторных и аллергических болезней, ГолникOmega d.o.o., LjubljanaOmega d.o.o., Любляна0112201995-67737781812201808092019Copyright ©; 2019, Sodja E., Toplak N., Koren S., Kovač M., Truden S., Žolni-Dovč M.Copyright ©; 2019, Содья Э., Топлак Н., Корен С., Ковач М., Труден С., Жолнир-Довч М.2019Sodja E., Toplak N., Koren S., Kovač M., Truden S., Žolni-Dovč M.Содья Э., Топлак Н., Корен С., Ковач М., Труден С., Жолнир-Довч М.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/851

Drug resistant tuberculosis (TB), especially multidrug (MDR) and extensively drug-resistant (XDR) TB, is still a serious problem in global TB control. Slovenia and North Macedonia are low-incidence countries with TB incidence rates of 5.4 and 10.4 in 2017, respectively. In both countries, the percentage of drug resistant TB is very low with sporadic cases of MDR-TB. However, global burden of drug-resistant TB continues to increase imposing huge impact on public health systems and strongly stimulating the detection of gene variants related with drug resistance in TB. Next-generation sequencing (NGS) can provide comprehensive analysis of gene variants linked to drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Therefore, the aim of our study was to examine the feasibility of a full-length gene analysis for the drug resistance related genes (inhA, katG, rpoB, embB) using Ion Torrent technology and to compare the NGS results with those obtained from conventional phenotypic drug susceptibility testing (DST) in TB isolates. Between 1996 and 2017, we retrospectively selected 56 TB strains from our National mycobacterial culture collection. Of those, 33 TB isolates from Slovenian patients were isolated from various clinical samples and subjected to phenotypic DST testing in Laboratory for Mycobacteria (University Clinic Golnik, Slovenia). The remaining 23 TB isolates were isolated from Macedonian patients and sent to our laboratory for assistance in phenotypic DST testing. TB strains included were either mono-, poly- or multidrug resistant. For control purposes, we also randomly selected five TB strains susceptible to first-line anti-TB drugs. High concordance between genetic (Ion Torrent technology) and standard phenotypic DST testing for isoniazid, rifampicin and ethambutol was observed, with percent of agreement of 77%, 93.4% and 93.3%, sensitivities of 68.2%, 100% and 100%, and specificities of 100%, 80% and 88.2%, respectively. In conclusion, the genotypic DST using Ion Torrent semiconductor NGS successfully predicted drug resistance with significant shortening of time needed to obtain the resistance profiles from several weeks to just a few days.

Лекарственноустойчивый туберкулез (ЛУ-ТБ), особенно ТБ с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) и ТБ с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ-ТБ), до сих пор представляет серьезную проблему глобального контроля ЛУ-ТБ. Словения и Северная Македония являются странами с низким низким уровнем заболеваемости ЛУ-ТБ, которые в 2017 г. составили 5,4 и 10,4 на 100 тыс. населения, соответственно. В обеих странах доля ЛУ-ТБ крайне низка, выявляются лишь спорадические случаи МЛУ-ТБ. Однако глобальный уровень ЛУ-ТБ продолжает расти, оказывая существенное влияние на систему здравоохранения, а также способствуя обнаружению генетических вариантов, связанных с ЛУ-ТБ. Секвенирование следующего поколения (next generation sequencing [NGS]) может предоставить возможность глубокого анализа генетических вариаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью Mycobacterium tuberculosis. Целью настоящего исследования была оценка применимости анализа таких генов (inhA, katG, rpoB, embB) с использованием технологии Ion Torrent и сравнения данных NGS и стандартного фенотипического определения лекарственной чувствительности (drug susceptibility testing [DST]) изолятов ЛУ-ТБ. Было проведено ретроспективное исследование 56 ЛУ-ТБ штаммов, полученных в течение 1996–2017 гг. из Национальной коллекции культур микобактерий (Голник, Словения). Из них, 33 изолята было получено от пациентов из Словении из различных клинических образцов, подвергнутых фенотипическому тестированию DST в Лаборатории микобактерий (University Clinic Golnik, Slovenia). Остальные 23 изолята были выделены от пациентов из Северной Македонии, и переданы в нашу лабораторию для помощи в проведении тестирования DST. ЛУТБ штаммы обладали моно-, полиили множественной лекарственной устойчивостью. В качестве контрольных образцов были использованы случайным образом отобранные пять штаммов, чувствительных к противотуберкулезным препаратам первого ряда. В результате, показана высокая степень соответствия между генетическими (Ion Torrent) данными и результатами стандартного фенотипического DST для изониазида, рифампицина и этамбутола, с показателем согласия 77, 93,4 и 93,3%, чувствительностью — 68,2, 100 и 100%, специфичностью — 100, 80 и 88,2% соответственно. Таким образом, генотипическое тестирование лекарственной устойчивости с применением NGS в формате полупроводниковой технологии Ion Torrent успешно выявило лекарственную устойчивость с резким сокращением времени, необходимого для получения профиля резистентности — с нескольких недель до двух дней.

tuberculosisMycobacterium tuberculosisdrug resistant tuberculosismultidrug resistant tuberculosisnext-generation sequencingIon Torrentphenotypic drug susceptibility testingтуберкулезMycobacterium tuberculosisлекарственноустойчивый туберкулезтуберкулез с множественной лекарственной устойчивостьюсеквенирование следующего поколенияIon Torrentфенотипическое определение лекарственной чувствительности1. Cegielski J.P., Kurbatova E., van der Walt M., Brand J., Ershova J., Tupasi T., Caoili J.C., Dalton T., Contreras C., Yagui M., Bayona J., Kvasnovsky C., Leimane V., Kuksa L., Chen M.P., Via L.E., Hwang S.H., Wolfgang M., Volchenkov G.V., Somova T., Smith S.E., Akksilp S., Wattanaamornkiet W., Kim H.J., Kim C.K., Kazennyy B.Y., Khorosheva T., Kliiman K., Viiklepp P., Jou R., Huang A.S., Vasilyeva I.A., Demikhova O.V.; Global PETTS Investigators, Lancaster J., Odendaal R., Diem L., Perez T.C., Gler T., Tan K., Bonilla C., Jave O., Asencios L., Yale G., Suarez C., Walker A.T., Norvaisha I., Skenders G., Sture I., Riekstina V., Cirule A., Sigman E., Cho S.N., Cai Y., Eum S., Lee J., Park S., Jeon D., Shamputa I.C., Metchock B., Kuznetsova T., Akksilp R., Sitti W., Inyapong J., Kiryanova E.V., Degtyareva I., Nemtsova E.S., Levina K., Danilovits M., Kummik T., Lei Y.C., Huang W.L., Erokhin V.V., Chernousova L.N., Andreevskaya S.N., Larionova E.E., Smirnova T.G. Multidrug-resistant tuberculosis treatment outcomes in relation to treatment and initial versus acquired second-line drug resistance. Clin. Infect. Dis., 2016, vol. 62, no. 4, pp. 418–430.2. European Centre for Disease Prevention and Control. Molecular typing for surveillance of multidrug-resistant tuberculosis in the EU/EEA – January 2016. Stockholm: ECDC, 2016.3. European Centre for Disease Prevention and Control/WHO Regional Office for Europe. Tuberculosis surveillance and monitoring in Europe 2018. 2016 data. 206 p. URL: https://www.ecdc.europa.eu/sites/portal/files/documents/ecdc-tuberculosis-surveillance-monitoring-Europe-2018-19mar2018.pdf4. Global tuberculosis report 2017. Geneva: World Health Organization, 2017. 295 p. URL: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/329368/9789241565714-eng.pdf?ua=15. Hazbón M.H., Bobadilla del Valle M., Guerrero M.I., Varma-Basil M., Filliol I., Cavatore M., Colangeli R., Safi H., Billman-Jacobe H., Lavender C., Fyfe J., García-García L., Davidow A., Brimacombe M., León C.I., Porras T., Bose M., Chaves F., Eisenach K.D., Sifuentes-Osornio J., Ponce de León A., Cave M.D., Alland D. Role of embB codon 306 mutations in Mycobacterium tuberculosis revisited: a novel association with broad drug resistance and IS6110 clustering rather than ethambutol resistance. Antimicrob. Agents Chemother., 2005, vol. 49, no. 9, pp. 3794–3802. doi: 10.1128/AAC.49.9.3794-3802.20056. Hazbón M.H., Brimacombe M., Bobadilla del Valle M., Cavatore M., Guerrero M.I., Varma-Basil M., Billman-Jacobe H., Lavender C., Fyfe J., García-García L., León C.I., Bose M., Chaves F., Murray M., Eisenach K.D., Sifuentes-Osornio J., Cave M.D., Ponce de León A., Alland D. Population genetics study of isoniazid resistance mutations and evolution of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents. Chemother., 2006, vol. 50, no. 8, pp. 2640–2649. doi: 10.1128/AAC.00112-067. Kim S.Y., Park Y.J., Kim W.I., Lee S.H., Ludgerus Chang C., Kang S.J., Kang C.S. Molecular analysis of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from South Korea. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2003, vol. 47, no. 3, pp. 497–502.8. Mokrousov I., Otten T., Vyshnevskiy B., Narvskaya O. Detection of embB306 mutations in ethambutol-susceptible clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from Northwestern Russia: implications for genotypic resistance testing. J. Clin. Microbiol., 2002, vol. 40, no. 10, pp. 3810–3813.9. Park J., Jang W., Kim M., Kim Y., Shin S.Y., Park K., Kim M.S., Shin S.J. Molecular drug resistance profiles of Mycobacterium tuberculosis from sputum specimens using ion semiconductor sequencing. Microbiol. Methods, 2018, vol. 145, pp. 1–6. doi: 10.1016/j.mimet.201710. Park J., Shin S.Y., Kim K., Park K., Shin S., Ihm C. Determining Genotypic Drug Resistance by Ion Semiconductor Sequencing With the Ion AmpliSeq™ TB Panel in Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Isolates. Ann. Lab. Med., 2018, vol. 38, no. 4, pp. 316–323. doi: 10.3343/alm.2018.38.4.31611. Sandgren A., Strong M., Muthukrishnan P., Weiner B.K., Church G.M., Murray M.B. Tuberculosis drug resistance mutation database. PLoS Med., 2009, vol. 6, no. 2: e2. doi: 10.1371/journal.pmed.100000212. Seifert M., Catanzaro D., Catanzaro A., Rodwell T.C. Genetic mutations associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review. PLoS One, 2015, vol. 10, no. 3: e0119628. doi: 10.1371/journal.pone.011962813. Somerville W., Thibert L., Schwartzman K., Behr M. A. Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a question of containment. J. Clin. Microbiol., 2005, vol. 43, pp. 2996–2997. doi: 10.1128/JCM.43.6.2996-2997.200514. Unissa A.N., Subbian S., Hanna L.E., Selvakumar N. Overview on mechanisms of isoniazid action and resistance in Mycobacterium tuberculosis. Infect. Genet. Evol., 2016, vol. 45, pp. 474–492. doi: 10.1016/j.meegid.2016.09.00415. Zaw M.T., Emran N.A., Lin Z.J. Mutations inside rifampicin-resistance determining region of rpoB gene associated with rifampicin-resistance in Mycobacterium tuberculosis. Infect. Public. Health., 2018, vol. 11, no. 5, pp. 605–610. doi: 10.1016/j.jiph.2018.04.00516. Zignol M., Cabibbe A.M., Dean A.S., Glaziou P., Alikhanova N., Ama C., Andres S., Barbova A., Borbe-Reyes A., Chin D.P., Cirillo D.M., Colvin C., Dadu A., Dreyer A., Driesen M., Gilpin C., Hasan R., Hasan Z., Hoffner S., Hussain A., Ismail N., Kamal S.M.M., Khanzada F.M., Kimerling M., Kohl T.A., Mansjö M., Miotto P., Mukadi Y.D., Mvusi L., Niemann S., Omar S.V., Rigouts L., Schito M., Sela I., Seyfaddinova M., Skenders G., Skrahina A., Tahseen S., Wells W.A., Zhurilo A., Weyer K., Floyd K., Raviglione M.C. Genetic sequencing for surveillance of drug resistance in tuberculosis in highly endemic countries: a multi-country population-based surveillance study. Lancet. Infect. Dis., 2018, vol. 18, no. 6, pp. 675–683. doi: 10.1016/S1473-3099(18)30073-2