Sergei V. Generalov - PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Prophylactic Immunoglobulins of the Department of Preventive Drugs.
410005, Saratov, Universitetskaya str., 46.
Phone: +7 (452) 26-21-31.
Генералов Сергей Вячеславович - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории профилактических иммуноглобулинов отдела профилактических препаратов.
410005, Саратов, ул. Университетская, 46.
Тел.: 8 (452) 26-21-31.
SPIN-код: 4130-2475
PhD (Biology), Leading Researcher, Department of Immunology.
410005, Saratov, Universitetskaya str., 46.
Доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела иммунологии.
410005, Саратов, ул. Университетская, 46.
Junior Researcher, Department of Immunology.
410005, Saratov, Universitetskaya str., 46.
Младший научный сотрудник отдела иммунологии.
410005, Саратов, ул. Университетская, 46.
Researcher, Laboratory of Prophylactic Immunoglobulins of the Department of Preventive Drugs.
410005, Saratov, Universitetskaya str., 46.
Научный сотрудник лаборатории профилактических иммуноглобулинов отдела профилактических препаратов.
410005, Саратов, ул. Университетская, 46.
PhD, MD (Biology), Head Researcher, Laboratory of Prophylactic Immunoglobulins of the Department of Preventive Drugs.
410005, Saratov, Universitetskaya str., 46.
Доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории профилактических иммуноглобулинов отдела профилактических препаратов.
410005, Саратов, ул. Университетская, 46.
PhD, MD (Biology), Deputy Director of the experimental and production work.
410005, Saratov, Universitetskaya str., 46.
Доктор биологических наук, заместитель директора по экспериментальной и производственной работе.
410005, Саратов, ул. Университетская, 46.
Here, we discuss development of f low cytometry technique for determining level of rabies antibodies in immune sera and immunoglobulin preparations, which is based on measuring fluorescence level in Vero cell line added with a mix of serially diluted anti-rabies serum or immunoglobulin preparation together with Moscow 3253 attenuated rabies virus strain, adapted for reproduction in cell lines. For this, rabies sera and immunoglobulin preparation were diluted 1:20 and 1:200 with PBS, respectively, whereas rabies virus was recommended for use at dose of 0.1 ID50/cell. Cell membrane fixation and permeabilization were performed by using a Cytoperm/Cytofix reagent (BD Pharmingen, USA) containing formaldehyde able to inactivate rabies virus, thus complying with biological safety regulations. Anti-rabies FITC-conjugated immunoglobulin (FGBI ARRIAH, Russia) was recommended for staining, that does not limit using similar reagents. Then, a f low cytometer equipped with a 20 mW argon laser (488 nm emission wavelength, throughput — 500 cells per second) was used for analysis. Vero cells displaying a fluorescence intensity exceeding 10 arbitrary units were considered infected. Flow cytometry allows to precisely measure amount of experimental infected cells as well as degree of infection by evaluating cell f luorescence intensity. Amount of antibodies in the samples examined by us was calculated by building a calibration curve based on depicting data for a standard rabies immunoglobulin with activity of 30 IU/ml (NIBSC, Potters Bar, United Kingdom). A high correlation between the data obtained by us and results from other detection methods used to assess activity of anti-rabies preparations such as biological neutralization of rabies virus in white mice (0.92) and modified FAVN test (0.98) was demonstrated. The comparison of the results of the analysis of the level of rabies antibodies obtained using f low cytometry, and the results obtained in tests in vivo, was carried out for the first time. Moreover, it is worth noting that for the first time the level of anti-rabies antibodies assessed by f low cytometry and in vivo tests was compared. An opportunity to perform rapid and easy-to-do analysis on assessing amount of infected cells by measuring fluorescence intensity in f low cytometry assay would allow to apply this approach for quality control while developing and manufacturing immunobiological anti-rabies preparations.
В настоящем исследовании рассматривается разработка метода определения уровня антирабических антител в иммунных сыворотках и препарате иммуноглобулина с использованием проточной цитометрии. Метод основан на измерении уровня флуоресценции в клетках Vero, инкубированных в питательной среде с добавлением смеси разведений антирабических сывороток или препарата иммуноглобулина и аттенуированного штамма вируса бешенства «Москва 3253», адаптированного к репродукции на перевиваемых клеточных линиях. Для определения уровня антител образцы антирабических сывороток и иммуноглобулина следует разводить в солевом растворе соответственно в 20 и 200 раз. При этом рекомендуемая доза вируса должна составлять 0,1 ИД50 на 1 клетку. Для фиксации и пермеабилизации клеточной мембраны применяли реагент Cytoperm/Cytofix (BD Pharmingen, США), содержащий формальдегид. Этот компонент способен инактивировать вирус бешенства, что позволяет считать предлагаемый метод соответствующим принципам биологической безопасности. Для окрашивания предлагается использовать конъюгат антирабического иммуноглобулина с ФИТЦ (ФГБУ ВНИИЗЖ, Россия). Данное обстоятельство не ограничивает примененние аналогичных препаратов, предназначенных для этой цели. Цитометрические исследования осуществляли на проточном цитометре, снаряженным аргоновым лазером мощностью 20 МВт, при длине волны эмиссии 488 нм со скоростью 500 клеток в секунду. Инфицированными считали те клетки, значения интенсивности флуоресценции которых составили более 10 условных единиц. Использование проточной цитометрии позволяет определить точное количество инфицированных клеток в исследуемой суспензии, а также степень их инфицирования по интенсивности флуоресценции. Уровень содержания антител в исследуемых образцах учитывают по калибровочному графику, построенному на основании данных исследования стандартного образца активности антирабического иммуноглобулина, имеющего активность 30 МЕ в 1 мл (NIBSC, Великобритания). Установлена высокая степень корреляции результатов, полученных с помощью предлагаемого метода в сравнении с результатами, полученных и других методов определения активности антирабических препаратов — биологической реакции нейтрализации вируса на белых мышах (0,92) и модифицированного метода FAVN (0,98). При этом сравнение результатов анализа уровня антирабических антител, полученных с применением проточной цитометрии, и результатов, полученными в тестах in vivo, проведено впервые. Возможность быстрого получения результата, а также точного определения степени инфицирования клеток по интенсивности флуоресценции позволит использовать предлагаемый метод на этапах контроля в производстве разрабатываемых и выпускаемых иммунобиологических антирабических препаратов.