Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI79610.15789/2220-7619-2019-3-4-485-494ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИFeatures of immune response against influenza infection in animals vaccinated with recombinant cross-protective vaccineОсобенности иммунного ответа на гриппозную инфекцию у животных, вакцинированных универсальной вакцинойTsybalovaL. M.ЦыбаловаЛ. М.
Russian Federation

PhD, MD (Medicine), Head of the Department of Vaccinology, Head of the Laboratory of Influenza Vaccines, Advisor to the Director,

197376, St. Petersburg, Professora Popova str., 15/17

д.м.н., руководитель отдела вакцинологии, зав. лабораторией гриппозных вакцин, советник директора,

197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 15/17

sovet@influenza.spb.ruStepanovaL. A.СтепановаЛ. А.
Russian Federation

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Influenza Vaccines, 

St. Petersburg

к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории гриппозных вакцин,

Санкт-Петербург

KorotkovA. V.ШуклинаМ. А.

Researcher, Laboratory of Influenza Vaccines,

St. Petersburg

младший научный сотрудник лаборатории гриппозных вакцин,

Санкт-Петербург

ShuklinaM. A.КоротковА. В.
Russian Federation

Junior Researcher, Laboratory for Influenza Vaccines, 

St. Petersburg

научный сотрудник лаборатории гриппозных вакцин,

Санкт-Петербург

ZaitsevaM. V.ЗайцеваМ. В.
Russian Federation

Junior Researcher, Laboratory of Influenza Vaccines,

St. Petersburg

младший научный сотрудник лаборатории гриппозных вакцин,

Санкт-Петербург

GrishchenkoV. I.ГрищенкоВ. И.
Russian Federation

Junior Researcher, Laboratory of Influenza Vaccines, 

St. Petersburg

младший научный лаборатории гриппозных вакцин,

Санкт-Петербург

KotlyarovR. Yu.КотляровР. Ю.
Russian Federation

PhD (Biology), Researcher, Department of Molecular Biology of Microorganisms, 

Moscow

к.б.н., научный сотрудник отдела молекулярной биологии микроорганизмов отдела молекулярной биологии,

Москва

Smorodintsev Research Institute of Influenza, Ministry of Health of the Russian FederationФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФResearch Institute of Bioengineering, FIC «Fundamentals of Biotechnology» RASИнститут биоинженерии, ФГУ Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук1511201993-44854940811201830052019Copyright ©; 2019, Tsybalova L.M., Stepanova L.A., Korotkov A.V., Shuklina M.A., Zaitseva M.V., Grishchenko V.I., Kotlyarov R.Y.Copyright ©; 2019, Цыбалова Л.М., Степанова Л.А., Шуклина М.А., Коротков А.В., Зайцева М.В., Грищенко В.И., Котляров Р.Ю.2019Tsybalova L.M., Stepanova L.A., Korotkov A.V., Shuklina M.A., Zaitseva M.V., Grishchenko V.I., Kotlyarov R.Y.Цыбалова Л.М., Степанова Л.А., Шуклина М.А., Коротков А.В., Зайцева М.В., Грищенко В.И., Котляров Р.Ю.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/796

Generating cross-reactive vaccines aimed at targeting all human influenza A virus subtypes is among high priority tasks in contemporary vaccinology. Such vaccines will be primarily demanded during pre-pandemic period as well as used to prime some population cohorts prior to vaccination with standard vaccines containing area-relevant epidemic virus. Unlike routine approach universal vaccines do not induce a sterilizing immunity, but significantly ameliorate overt infection and probable complications. Our study was aimed at evaluating characteristics of immune response in experimental animals primed with a candidate universal vaccine challenged with sublethal influenza A virus infection. Mice were immunized intranasally with the recombinant protein FlgH2-2-4M2e containing conservative peptides derived from two influenza A virus proteins: M2 protein ectodomain and 76–130 amino acid sequence from the second hemagglutinin (HA2) subunit genetically linked to bacterial flagellin protein, which is a ligand for Toll-like receptor 5 (TLR5). Control mice received saline. Two weeks after immunization, mice from both groups were infected with a sublethal dose of A/Aichi/2/68 AN3N2 influenza virus strain. Level of immunoglobulins G and A in the blood sera and bronchoalveolar lavages (BAL) were determined two weeks after immunization and 1 month post infection. Percentage of lung CD4+ T and CD4+ Tem (CD44+CD62L–) cells secreting cytokines TNFα, IFNγ, IL-2 was determined. Immunized vs. control mice responded to sublethal infection with the influenza virus by insignificant weight loss and more pronounced production of vaccine peptide-specific (M2e and aa76–130 HA2) and pan-influenza A/Aichi/2/68 virus IgG and A in the blood sera and BAL. After challenge the number of CD4+ T cells secreting cytokines TNFα and/or IL-2 in immunized mice significantly exceeded counterpart T cells in unimmunized animals that was true for both CD4+T and CD4+ Tem cells. Memory CD4+ T cells were previously shown to play a key role in the prime-boost event and heterosubtypic immune response. Thus, we were able to demonstrate a priming effect for recombinant cross-protective vaccine used in our experiment.

Создание кросс-реактивных вакцин, то есть вакцин, направленных на все субтипы вирусов гриппа А человека — это одна из приоритетных задач современной вакцинологии. Такого рода вакцины будут, в первую очередь, востребованы в предпандемический период и, кроме того, могут быть использованы для праймирования определенных категорий населении перед вакцинацией традиционными вакцинами из штаммов вирусов, актуальных в соответствующем эпидемическом сезоне. В отличие от традиционных вакцин универсальные не индуцируют стерилизующий иммунитет, но существенно снижают манифестацию инфекции и вероятность развития осложнений. Цель настоящей работы заключалась в оценке особенностей иммунного ответа экспериментальных животных, праймированных кандидатной универсальной вакциной, на последую щую сублетальную инфекцию вирусом гриппа. Мышей иммунизировали интраназально рекомбинантным белком FlgH2-2-4M2e, содержащим консервативные пептиды двух белков вируса гриппа А: эктодомен белка М2 и аминокислотную последовательность 76–130 второй субъединицы гемагглютинина (НА2), генетически связанные с бактериальным белком флагеллином — лигандом Toll-подобных рецепторов пятого типа (TLR5). Мыши контрольной группы получали вместо кандидатной вакцины физраствор. Через 2 недели после иммунизации мыши обеих групп были заражены сублетальной дозой вируса гриппа АН3N2 А/ Aichi/2/68. Через 2 недели после иммунизации и 1 месяц после заражения в сыворотках крови и смывах бронхоальвеолярных лаважей (БАЛ) были определены уровни иммуноглобулинов G и А. В легких определяли процентное содержание клеток CD4+ и CD4Tem (CD44+CD62L–), секретирующих цитокины TNFα, IFNγ, IL-2. На сублетальное заражение вирусом гриппа иммунизированные ранее мыши отвечали незначительной потерей массы тела, по сравнению с мышами контрольной группы, и более выраженной продукцией IgG и IgА в сыворотках крови и в смывах БАЛ как к пептидам, входящим в состав вакцинного препарата (М2е и аа76-130 НА2), так и к цельному вирусу гриппа А/Aichi/2/68. Количество CD4+ Т-клеток, секретирующих цитокины TNFα и/или IL-2 у иммунизированных мышей, значительно превосходили аналогичные пулы Т-клеток у неиммунизированных животных после заражения. Это относилось как к общим CD4+, так и к эффекторным Т-клеткам памяти. Именно CD4+ Т-клеткам памяти, по литературным данным, принадлежит ключевая роль в прайм-буст механизме действия вакцин и гетеросубтипоспецифическом иммунном ответе. В настоящем исследовании показан праймирующий эффект рекомбинантной кросс-протективной вакцины.

influenza Arecombinant vaccineexperimental animalsimmune responseгрипп Арекомбинантная вакцинаэкспериментальные животныеиммунный ответАвторы выражают благодарность Российскому научному фонду, при поддержке которого проводились данные исследования (Соглашение № 15-14-00043 от 19.05.2015 г.).1. Степанова Л.А., Котляров Р.Ю., Шуклина М.А., Блохина Е.А., Сергеева М.В., Потапчук М.В., Ковалева А.А., Равин Н.В., Цыбалова Л.М. Влияние порядка присоединения фрагментов НА2 и М2е вирусов гриппа A к флагеллину на свойства рекомбинантных белков // Acta Naturae. 2018. Т. 10, № 1 (36). C. 90–100.2. Atsmon J., Caraco Y., Ziv-Sefer S., Shaikevich D., Abramov E., Volokhov I., Bruzil S., Haima K.Y., Gottlieb T., Ben-Yedidia T. Priming by a novel universal influenza vaccine (Multimeric-001)-a gateway for improving immune response in the elderly population. Vaccine, 2014, vol. 32, no. 44, pp. 5816–5823. doi: 10.1016/j.vaccine.2014.08.0313. Bates J.T., Honko A.N., Graff A.H., Kock N., Mizel S.B. Mucosal adjuvant activity of flagellin in aged mice. Mech. Ageing Dev., 2008, vol. 129, pp. 271–281. doi: 10.1016/j.mad.2008.01.0094. Chen S., Zheng D., Li C., Zhang W., Xu W., Liu X., Fang F., Chen Z. Protection against multiple subtypes of influenza viruses by virus-like particle vaccines based on a hemagglutinin conserved epitope. Biomed. Res. Int., 2015: 901817. doi: 10.1155/2015/9018175. Cuadros C., Lopez-Hernandez F.G., Dominguez A.L., McClelland M., Lustgarten J. Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines induce specific immune responses. Infect. Immun., 2004, vol. 72, no. 5, pp. 2810–2816.6. Cunningham A.F., Khan M., Ball J., Toellner K.M., Serre K., Mohr E. Responses to the soluble flagellar protein FliC are Th2, while those to FliC on Salmonella are Th1. Eur. J. Immunol., 2004, vol. 34, pp. 2986–2995.7. De Filette M., Martens W., Roose K., Deroo T., Vervalle F., Bentahir M., Vandekerckhove J., Fiers W., Saelens X. An influenza A vaccine based on tetrameric ectodomain of matrix protein 2. J. Biol. Chem., 2008, vol. 283 (17), pp. 11382–11387. doi: 10.1074/jbc.M8006502008. Delaney K.N., Phipps J.P., Johnson J.B., Mizel S.B. A reombinant flagellin-poxvirus fusion protein vaccine elicits complement-dependent protection against respiratory challenge with vaccinia virus in mice. Viral Immunol., 2010, vol. 23, pp. 201–210. doi: 10.1089/vim.2009.01079. Deng L., Ibañez L.I., Van den Bossche V., Roose K., Youssef S.A., de Bruin A., Fiers W., Saelens X. Protection against influenza A virus challenge with M2e-displaying filamentous Escherichia coli phages. PLoS One, 2015. doi: 10.1371/journal.pone.012665010. El Bakkouri K., Descamps F., De Filette M., Smet A., Festjens E., Birkett A. Universal vaccine based on ectodomain of matrix protein 2 of influenza A: Fc receptors and alveolar macrophages mediate protection. J. Immunol., 2011, vol. 186, pp. 1022–1031. doi: 10.4049/jimmunol.090214711. Eliasson D.G., Omokanye A., Schön K., Wenzel U.A., Bernasconi V., Bemark M., Kolpe A., El Bakkouri K., Ysenbaert T., Deng L., Fiers W., Saelens X., Lycke N. M2e tetramer-specific memory CD4 T cells are broadly protective against influenza infection. Mucosal Immunol., 2017, vol. 11, pp. 273–289. doi: 10.1038/mi.2017.1412. Epstein S.L., Lo C.Y., Misplon J.A., Lawson C.M., Hendrickson B.A., Max E.E., Subbarao K. Mechanisms of heterosubtypic immunity to lethal influenza A virus infection in fully immunocompetent, T cell-depleted, beta2-microglobulin-deficient, and J chain-deficient mice. J. Immunol., 1997, vol. 158, no. 3, pp. 1222–1230.13. Hazenbos W.L., Gessner J.E., Hofhuis F.M. Impaired IgG-dependent anaphylaxis and Arthus reaction in Fc gamma RIII (CD16) deficient mice. Immunity, 1996, vol. 5, pp. 181–188.14. Jegerlehner A. Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2: weak protection mediated via antibody-dependent NK cell activity. J. Immunol., 2004, vol. 172, pp. 5598–5605.15. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 227, pp. 680–685.16. McKinstry К.К., Strutt T.M., Kuang Yi, Brown D.M., Sell S., Dutton R.W., Swain S.L. Memory CD4+ T cells protect against influenza through multiple synergizing mechanisms. J. Clin. Invest., 2012, vol. 122, no. 8, pp. 2847–2856. doi: 10.1172/JCI6368917. Mozdzanovska K., Zharikova D., Cudic M., Otvos L., Gerhard W. Roles of adjuvant and route of vaccination in antibody response and protection engendered by a synthetic matrix protein 2-based influenza A virus vaccine in the mouse. Virology J., 2007, vol. 4: 118.18. Nimmerjahn F., Ravetch J.V. Divergent immunoglobulin G subclasses activity through selective Fc receptor binding. Science, 2005, vol. 310, pp. 1510–1512.19. Scorza B.F., Tsvetnitsky V., Donnelly J.J. Universal influenza vaccines: Shifting to better vaccines. Vaccine, 2016, vol. 34, no. 26, pp. 2926–2933. doi: 10.1016/j.vaccine.2016.03.08520. Strutt T.M., McKinstry K.K., Dibble J.P., Winchell C., Kuang Y., Curtis J.D., Huston G., Dutton R.W., Swain S.L. Memory CD4+ T cells induce innate responses independently of pathogen. Nat. Med., 2010, vol. 16, no. 5, pp. 558–564. doi: 10.1038/ nm.214221. Sun K., Ye J., Perez D.R., Metzger D.W. Seasonal FluMist vaccination induces cross-reactive T cell immunity against H1N1 (2009) influenza and secondary bacterial infections. J. Immunol., 2011, vol. 186, no. 2, pp. 987–993. doi: 10.4049/jimmunol.100266422. Swain S.L., McKinstry K.K., Strutt T.M. Expanding roles for CD4(+) T cells in immunity to viruses. Nat. Rev. Immunol., 2012, vol. 12, no. 2, pp. 136–148. doi: 10.1038/nri315223. Tsybalova L.M., Stepanova L.A., Shuklina M.A., Mardanova E.S., Kotlyarov R.Y., Potapchuk M.V., Petrov S.A., Blokhina E.A., Ravin N.V. Combination of M2e peptide with stalk HA epitopes of influenza A virus enhances protective properties of recombinant vaccine. PLoS One, 2018, vol. 13, no. 8: e0201429. doi: 10.1371/journal.pone.020142924. Zebedee S.L., Lamb R.A. Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. J. Virol., 1988, vol. 62, no. 8, pp. 2762–2772.25. Zens K.D., Farber D.L. Memory CD4 T cells in influenza. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2015, vol. 386, pp. 399–421. doi: 10.1007/82_2014_40126. Zhong W., Reed C., Blair P.J., Katz J.M., Hancock K. Influenza Serology Working Group. Serum antibody response to matrix protein 2 following natural infection with 2009 pandemic influenza A(H1N1) virus in humans. J. Infect. Dis., 2014, vol. 209, no. 7, pp. 986–994. doi: 10.1093/infdis/jit811