Junior Researcher, Laboratory of Viral Hepatitis
Junior Researcher, Laboratory of Viral Hepatitis, Central Research Institute of Epidemiology,; PhD Student, Laboratory No. 73 of Clinical Pharmacology, Institute of Immunology FMBA
Research Technician, Laboratory of Viral Hepatitis
Technician, Laboratory of Viral Hepatitis
PhD (Pharmaceutical Sciences), Senior Faculty Member, Assistant Professor, A.P. Arzamastsev Department of Pharmaceutical and Toxicological Chemistry
Junior Researcher, Laboratory of Immunobiological Processes Modeling with the Experimental Clinic of the Marmosets of the Department of Innovative Biotechnological Preparations
Junior Researcher, Laboratory of Immunobiological Processes Modeling with the Experimental Clinic of the Marmosets of the Department of Innovative Biotechnological Preparations
Junior Researcher, Laboratory of Viral Hepatitis
PhD, MD (Medicine), Head of the Laboratory of Viral Hepatitis, Central Research Institute of Epidemiology; Professor, Department of Infectious Diseases, Preventive Medicine Department, I.M. Sechenov Moscow State Medical University
Chronic hepatitis B is a severe liver disease caused by persistent infection of hepatitis B virus in human hepatocytes. Chronic hepatitis B is one of the most common diseases in the world. According to recent estimations, more than 250 million people are chronically infected and more than 1 million of people die annually due to consequences of chronic hepatitis B: liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The key factor of hepatitis B virus persistency is a special form of viral genome called circular covalently closed DNA. Current therapeutics suppress viral replication but have no effect on circular covalently closed DNA as it exists in the nuclei of hepatocytes as a minichromosome and is not accessible for therapeutics. Commonly, viral reactivation occurs after cessation of treatment. Therefore, duration of antiviral treatment is supposed to be indefinitely long. One of the most promising approaches to target circular covalently closed DNA is the technology of site-specific nucleases CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes. A short guide RNA recruits an SpCas9 protein to the viral genome and induces generation of DNA double strand breaks. However, there are several limitations of CRISPR/Cas9 hampering translation of this technology into the clinic. First, efficacy of CRISPR/Cas9 needs to be improved. Second, CRISPR/Cas9-mediated off-target mutagenesis represents a menacing problem which has to be addressed. To overcome these limitations, several approaches have been devised to improve CRISPR/Cas9 activity (modification of guide RNAs) and reduce off-target mutagenesis (a Cas9 protein with enhanced specificity, eSpCas9). In this study, we compared antiviral activity of a classic SpCas9 with an eSpCas9 system as well as analyzed effects of gRNAs modification on anti-HBV effects. Here, we demonstrated that SpCas9 has the highest antiviral potency, reducing transcription and replication of HBV over 90%. Hepatitis B virus covalently closed circular DNA declined over 90% post CRISPR/Cas9 transfection. Although it was previously shown that modified guide RNAs increase nucleolytic activity of CRISPR/Cas9, our results indicated that this modification impairs antiviral activity of CRISPR/Cas9. To conclude, CRISPR/Cas9 effectively suppress viral replication and transcription per se. Described modifications do not potentiate antiviral activity of CRISPR/Cas9 system and should not be used for development of future therapeutics. The best strategy to improve CRISPR/Cas9 efficacy is to design new highly effective guide RNAs.
Хронический гепатит В — тяжелое заболевание печени, связанное с персистенцией вируса гепатита В в гепатоцитах человека. Хронический гепатит В является одним из самых распространенных заболеваний в мире. По обновленной статистике, более 250 млн человек хронически инфицированы, и более 1 млн человек умирают ежегодно из-за последствий ХГВ, цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы. Основная причина персистенции вируса гепатита В — особая суперспирализованная молекула кольцевой ковалентно замкнутой ДНК в ядре. Современные методы терапии подавляют вирусную инфекцию, но не действуют напрямую на матрицы кольцевой ковалентно замкнутой ДНК, поскольку она существует в ядре гепатоцитов в виде минихромосомы и является недоступной для действия противовирусных препаратов. Как правило, после прекращения курса терапии наступает реактивация инфекции, поэтому прием противовирусных препаратов может быть неопределенно долгим. Одной из современных технологий, способных действовать напрямую на кольцевую ковалентно замкнутую ДНК, является система сайт-специфических нуклеаз CRISPR/Cas9 организма Streptococcus pyogenes. SpCas9 белок можно привлекать к участку ккзДНК с помощью короткого РНК-проводника, в результате чего SpCas9 вносит двуцепочечные разрывы, разрушая или мутируя вирусный геном. Тем не менее на сегодняшний момент использование CRISPR/Cas9 для терапии хронического гепатита В сопряжено с рядом проблем, в том числе с такой, как внецелевое действие нуклеаз (разрезание генома клеток). В последние годы было заявлено о создании нескольких технологий, использование которых может усиливать нуклеолитическую активность CRISPR/Cas9 (модифицированные РНК-проводники) или увеличивать специфичность SpCas9 белка (eSpCas9, более безопасная форма классического белка Cas9). В этой работе было проведено сравнение противовирусного действия CRISPR/Cas9 с классической формой белка SpCas9 и белком eSpCas9 c модифицированными и немодифицированными РНК-проводниками на культуре клеток in vitro. Показано, что система SpCas9 подавляет транскрипцию и репликацию вируса гепатита В на 90%, а также снижает уровень ккзДНК на 94%, тогда как противовирусный эффект при использовании eSpCas9 оказывается существенно ниже. Несмотря на то что модифицированные РНК-проводники должны улучшать нуклеолитическую активность CRISPR/Cas9 систем, модификация РНК-проводников также значительно снижает противовирусное действие CRISPR/Cas9. Таким образом, CRISPR/Cas9 сама по себе обладает высокой эффективностью действия, почти полностью блокируя транскрипцию и репликацию вируса гепатита В. Использование описанных технологий по улучшению свойств CRISPR/Cas9 нерационально при создании методов терапии на основе CRISPR/Cas9, а для элиминации генома вируса следует сосредоточиться на поиске эффективных РНК-проводников.