Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI73610.15789/2220-7619-2018-2-175-186ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИTHE GROWTH RATE PHENOTYPIC PROPERTY OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS CLINICAL STRAINS: DEPENDENCE ON TUBERCULOSIS LOCALIZATION, TREATMENT, DRUG SUSCEPTIBILITYФЕНОТИПИЧЕСКОЕ СВОЙСТВО СКОРОСТИ РОСТА КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS: ЗАВИСИМОСТЬ ОТ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ, ЛОКАЛИЗАЦИИ ТУБЕРКУЛЕЗА, ЛЕЧЕНИЯManichevaO. A.МаничеваО. А.
Russian Federation

PhD, MD (Biology), Leading Researcher, St. Petersburg  Research Institute of Phthisiopulmonology, St. Petersburg, Russian Federation

194064, Russian Federation, St. Petersburg, Polytehnicheskaya str., 32

Phone: +7 (812) 297-86-31 (office) Fax: +7 (812) 297-16-26

д.б.н., ведущий научный сотрудник ФГБУ СПб НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия

194064, Россия, Санкт-Петербург, ул. Политехническая, 32

Тел.: 8 (812) 297-86-31 (служебн.) Факс: 8 (812) 297-16-26

olgamanicheva@rambler.ruDogonadzeM. Z.ДогонадзеМ. З.
Russian Federation

PhD (Biology), Senior Researcher, St. Petersburg Research  Institute of Phthisiopulmonology, St. Petersburg, Russian Federation

к.б.н., старший научный сотрудник ФГБУ СПб НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия

MelnikovaN. N.МельниковаН. Н.
Russian Federation

PhD (Medicine), Senior Researcher, St. Petersburg Research  Institute of Phthisiopulmonology, St. Petersburg, Russian Federation

к.м.н., старший научный сотрудник ФГБУ СПб НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ,  Санкт-Петербург, Россия

VishnevskiyB. I.ВишневскийБ. И.
Russian Federation

PhD, MD (Medicine), Professor, Chief Researcher, St. Petersburg  Research Institute of Phthisiopulmonology, St. Petersburg, Russian Federation

д.м.н., профессор, главный научный сотрудник ФГБУ СПб НИИ  фтизиопульмонологии МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия

ManichevS. A.МаничевС. А.
Russian Federation

PhD (Psychology), Associate Professor, Head of the Department of Ergonomics and Engineering Psychology, St. Petersburg  Research Institute of Phthisiopulmonology, St. Petersburg, Russian Federation

к.псх.н., доцент, зав. кафедрой эргономики и инженерной психологии ФГБУ СПб  НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия

St. Petersburg State Research Institute of PhthisiopulmonologyФГБУ Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологииSt. Petersburg State UniversityФГБОУ ВО Санкт-Петербургский государственный университет10092018821751861009201810092018Copyright ©; 2018, Manicheva O.A., Dogonadze M.Z., Melnikova N.N., Vishnevskiy B.I., Manichev S.A.Copyright ©; 2018, Маничева О.А., Догонадзе М.З., Мельникова Н.Н., Вишневский Б.И., Маничев С.А.2018Manicheva O.A., Dogonadze M.Z., Melnikova N.N., Vishnevskiy B.I., Manichev S.A.Маничева О.А., Догонадзе М.З., Мельникова Н.Н., Вишневский Б.И., Маничев С.А.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/736

The phenotypic properties of the M. tuberculosis strains obtained from patients with pulmonary or extra-pulmonary tuberculosis are  determined by a complex set of factors: the genetic characteristics  of the pathogen, its ability to adapt in vivo and in vitro, the influence of the host’s immune system and chemotherapy. The growth rate as  the phenotypic property is the most accessible for the study of the  host-pathogen relationships at the level of host/strain population  interactions. The aim of the study is to assess in vitro of the growth  rate of M. tuberculosis strains isolated from patients with pulmonary  and extra-pulmonary tuberculosis: untreated and treated (with  surgical and non-surgical treatment) and also sensitive and resistant isolates in comparison with the reference strain H37Rv. To estimate  the growth rate of 116 clinical isolates we have used the modified  method originally developed by von Groll and co-authors: to get the  bacteria growth curve the fluorescence intensity of growing strains  (with indicator resazurin) has been measured daily for 8 days in 96- well plate. The growth rate is determined as the slope of the growth  curve. The mean values of the growth rate have been calculated in  the following groups of patients: 1 — untreated patients with  pulmonary tuberculosis (PT), respiratory material; 2 — non-surgical  treated PT patients, respiratory material; 3 — surgical treated PT  patients (mainly with chronic and hyperchronic process), respiratory  material; 4 — patients like in 3rd group, surgical material; 5 — bone  and joint tuberculosis (BJT), surgical material. In addition, groups of  sensitive and resistant strains have been examined, but there are no  significant differences in growth rates. It has been obtained that  the growth rate of strains isolated from the PT patients is higher than in BJT patients: it can be explained less favorable  conditions for the pathogen vegetation in the BJT. In the case of a  closed tuberculous lesion where the pathogen transmission to  another host is impossible, then the selection of strains with the  property to survive in the tissues of the osteoarticular system is  impossible too, therefor it should be observed only an adaptation of  the pathogen strain population to the individual host. The growth  rate of isolates from untreated PT patients is higher than that of the  treated ones. Comparison of the growth parameters of only MDR  strains 1–5 groups to eliminate the influence of the  sensitivity/resistance has resulted in the same conclusions. We  suggest that the decrease in the growth rate of strains from the  treated PT patients is in not only result of the treatment, but also is  conditioned by adaptation of the pathogen to its external  environment, which is the internal environment of the  macroorganism. To confirm this assumption, the bacterial load of  1,083 diagnostic specimens grouped in a similar manner has been  estimated, taking into account only MDR/XDR strains. In the group  of treated patients the frequency of high bacterial load (CFU ≥ 100)  reached 52.5–63.8% that shows the conserved fitness of bacteria in  such patients. The mean values of the growth rate of the strain  H37Rv non-adapted to the macroorganism (due to numerous  passages on artificial media) are higher than in all groups of clinical  strains. Thus, heterogeneity of phenotypic properties of M.  tuberculosis clinical strains on the basis of growth rate has been  obtained. The growth rate of M. tuberculosis clinical strains is  depended on the tuberculosis localization (PT, BJT) and on the joint  effect of patient treatment and pathogen adaptation to the host. 

Фенотипические свойства штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных легочным или внелегочным туберкулезом, определяются комплексом факторов: генетическими  особенностями патогена, его способностью к адаптации in vivo и in vitro, воздействием  иммунной системы хозяина, влиянием химиотерапии. Наиболее доступным для  исследования взаимоотношений хозяин-патоген на уровне «макроорганизм/ штаммовая  популяция» является фенотипическое свойство — скорость роста. Темп репликации, как  правило, исследуют в сопоставлении с лекарственной чувствительностью микобактерий или  с их генотипическими особенностями. Целью работы была оценка in vitro скорости роста  штаммов M. tuberculosis, выделенных из диагностического материала больных туберкулезом  при легочной и внелегочной локализации, нелеченых и леченых (оперированных и  неоперированных), а также чувствительных и устойчивых изолятов в сравнении с  референтным штаммом H37Rv. Для оценки скорости роста 116 клинических изолятов  использовали модификацию метода, предложенного A. von Groll et al.: для построения  кривой роста измеряли интенсивность флуоресценции в 96-луночном планшете (с помощью  индикатора резазурина) ежедневно в течение 8 дней. Скорость роста определяли как  наклон полученной кривой. Вычисляли средние значения в группах: 1 — нелеченые  больные туберкулезом органов дыхания (ТОД), респираторный материал; 2 — леченые неоперированные больные ТОД, респираторный материал; 3 группа — леченые  оперированные больные ТОД (преимущественно с хроническим и гиперхроническием  течением процесса), респираторный материал; 4 — аналогичные пациенты, операционный  материал; 5 — больные костно-суставным туберкулезом (КСТ), операционный материал.  Кроме того, исследовали группы чувствительных и резистентных штаммов, между которыми  значимых различий в скорости роста не обнаружили. Параметры роста штаммов,  выделенных из материала больных ТОД, превышали таковые при КСТ. Это объясняется  менее благоприятными условиями вегетации возбудителя при КСТ. Поскольку при  локализации туберкулезного поражения, отграниченного от внешней среды, невозможна  передача возбудителя к другому хозяину, то невозможна и селекция штаммов по  способности выживать в тканях костно-суставной системы, следовательно, в этом случае  следует говорить об адаптации штаммовой популяции патогена к индивидуальному хозяину. Скорость роста изолятов от нелеченых пациентов с ТОД была выше, чем у леченых.  Сравнение параметров роста только МЛУ штаммов 1–5 групп для устранения влияния  фактора чувствительности/устойчивости в целом выявило ту же картину. Снижение  скорости роста штаммов, выделенных от леченых пациентов с ТОД, мы считаем результатом не только лечения, но и адаптации патогена к его окружающей среде — внутренней среде  макроорганизма. Для подтверждения этого предположения оценили бактериальную  нагрузку 1083 образцов диагностического материала, сгруппированных аналогичным  образом, при этом отбирали только МЛУ/ШЛУ штаммы. В группах леченых больных частота  высокой обсемененности (КОЕ ≥ 100) достигала 52,5–63,8%, что свидетельствует о  сохранении жизнеспособности возбудителя у таких пациентов. Скорость роста не адаптированного (вследствие длительных пассажей на искусственных средах) к  макроорганизму штамма H37Rv по средним значениям была значимо выше, чем во всех  группах клинических штаммов. Таким образом, выявлена гетерогенность фенотипических  свойств клинических штаммов M. tuberculosis по признаку скорости роста. Скорость роста клинических штаммов M. tuberculosis зависит от локализации процесса (ТОД, КСТ) и  совместного воздействия факторов лечения пациентов и адаптации патогена к хозяину.

Mycobacterium tuberculosisclinical strainsdrug resistancepulmonary tuberculosisextrapulmonary tuberculosis.Mycobacterium tuberculosisклинические штаммыскорость росталекарственная чувствительностьтуберкулез легкихвнелегочный туберкулез1. Arcos J., Sasindran S.J., Fujiwara N., Turner J., Schlesinger L.S., Torrelles J.B. Human lung hydrolases delineate mycobacterium tuberculosis-macrophage interactions and the capacity to control infection. J. Immunol., 2011, vol. 187, no. 1, pp. 372–381. doi: 10.4049/jimmunol.11008232. Balázsi G., Heath A.P., Shi L., Gennaro M.L. The temporal response of the Mycobacterium tuberculosis gene regulatory network during growth arrest. Mol. Syst. Biol., 2008, vol. 4, no. 225, pp. 1–8. doi: 10.1038/msb.2008.633. Ben-Kahla I., Al-Hajoj S. Drug-resistant tuberculosis viewed from bacterial and host genomes. Int. J. Antimicrob. Agents, 2016, vol. 48, iss. 4, pp. 353–360. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2016.07.0104. Beste D.J.V., Espasa M., Bonde B., Kierzek A.M., Stewart G.R., McFadden J. The genetic requirements for fast and slow growth in mycobacteria. PLoS One, 2009, vol. 4, iss. 4: e5349. doi: 10.1371/journal.pone.00053495. Bhatter P., Chatterjee A., D’souza D., Tolani M., Mistry N. Estimating fitness by competition assays between drug susceptible and resistant mycobacterium tuberculosis of predominant lineages in Mumbai, India. PLoS One, 2012, vol. 7, iss. 3:e33507. doi: 10.1371/journal.pone.00335076. Bhatter P., Mistry N. Fitness of acquired drug resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from DOTS compliant patients. Tuberculosis, 2013, vol. 93, iss. 4, pp. 418–424. doi: 10.1016/j.tube.2013.03.0067. Bretl D.J., Demetriadou C., Zahrt T.C. Adaptation to environmental stimuli within the host: two-component signal transduction systems of mycobacterium tuberculosis. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2011, vol. 75, no. 4, pp. 566–582. doi: 10.1128/MMBR.05004-118. Casart Y., Turcios L., Florez I., Jaspe R., Guerrero E., de Waard J., Aguilar, D., Hérnandez-Pando R., Salazar L. IS6110 in oriC affects the morphology and growth of Mycobacterium tuberculosis and attenuates virulence in mice. Tuberculosis, 2008, vol. 88. iss. 6, pp. 545–552. doi: 10.1016/j.tube.2008.03.0069. Chandra N., Kumar D., Rao K. Systems biology of tuberculosis. Tuberculosis, 2011, vol. 91, iss. 5, pp. 487–496. doi: 10.1016/j.tube.2011.02.00810. Chen Y.-Y., Chang J.-R., Huang W.-F., Hsu S.-C., Kuo S.-C., Sun J.-R., Dou H.Y. The pattern of cytokine production in vitro induced by ancient and modern Beijing mycobacterium tuberculosis strains. PLoS One, 2014, vol. 9, iss. 4: e94296. doi: 10.1371/journal.pone.009429611. Click E.S., Winston C.A., Oeltmann J.E., Moonan P.K., Mac Kenzie W.R. Association between Mycobacterium tuberculosis lineage and time to sputum culture conversion. Int. J. Tuberc. Lung Dis., 2013, vol. 17, no. 7, pp. 878–884. doi: 10.5588/ijtld.12.073212. Comas I., Borrell S., Roetzer A., Rose G., Malla B., Kato-Maeda M., Galagan J., Niemann S., Gagneux S. Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerase genes. Nat. Genet., 2011, vol. 44, no. 1, pp. 106–110. doi: 10.1038/ng.103813. Dey B., Bishai W.R. Crosstalk between Mycobacterium tuberculosis and the host cell. Semin. Immunol., 2014, vol. 26, iss. 6, pp. 486–496. doi: 10.1016/j.smim.2014.09.00214. Eoh H. Metabolomics: a window into the adaptive physiology of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis, 2014, vol. 94, iss.6, pp. 538–543. doi: 10.1016/j.tube.2014.08.00215. Faksri K., Chaiprasert A., Pardieu C., Casali N., Palaga T., Palittapongarnpim P., Prayoonwiwat N., Drobniewski F. Heterogeneity of phenotypic characteristics of the modern and ancestral Beijing strains of Mycobacterium tuberculosis. Asian. Pac. J. Allergy Immunol., 2014, vol. 32, no. 2, pp. 124–132. doi: 10.12932/AP0361.32.2.201316. Flores-Villalva S., Rogriguez-Hernandez E., Rubio-Venegas Y., Canto-Alarcon J.G., Milian-Suazo F. What can proteomics tell us about tuberculosis? J. Microbiol. Biotechnol., 2015, vol. 25, no. 8, pp. 1181–1194. doi: 10.4014/jmb.1502.0200817. Forrellad M.A., Klepp L.I., Gioffré A., Sabio y García J., Morbidoni H.R., de la Paz Santangelo M., Cataldi A.A., Bigi F. Virulence factors of the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence, 2013, vol. 4, iss. 1, pp. 3–66. doi: 10.4161/viru.2232918. Gillespie S.H., Billington O.J., Breathnach A., McHugh T.D. Multiple drug-resistant mycobacterium tuberculosis: evidence for changing fitness following passage through human hosts. Microb. Drug Resist., 2002, vol. 8, iss. 4, pp. 273–279. doi: 10.1089/1076629026046953419. Gomes L.L., Vasconcellos S.E.G., Gomes H.M., Elias A.R., Da Silva Rocha A., Ribeiro S.C.M., Panunto A.C., Ferrazoli L., Da Silva Telles M.A., De Ivens A.M.E., Kritski A.L., Mokrousov I., Manicheva O.A., Lasunskaia E., Suffys P.N. Genetic diversity of the Mycobacterium tuberculosis Beijing family in Brazil and Mozambique and relation with infectivity and induction of necrosis in THP-1 cells. Tuberculosis, 2015, vol. 95, suppl. 1, pp. 190–196. doi: 10.1016/j.tube.2015.02.02520. Griffin J.E., Gawronski J.D., DeJesus M.A., Ioerger T.R., Akerley B.J., Sassetti C.M. High-resolution phenotypic profiling defines genes essential for mycobacterial growth and cholesterol catabolism. PLoS Pathog., 2011, vol. 7, no. 9: e1002251. doi: 10.1371/journal.ppat.100225121. Hang N.T.L., Maeda S., Keicho N., Thuong P.H., Endo H. Sublineages of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype strains and unfavorable outcomes of anti-tuberculosis treatment. Tuberculosis, 2015, vol. 95, iss. 3, pp. 336–342. doi: 10.1016/j.tube.2015.02.04022. Hu Y., Movahedzadeh F., Stoker N.G., Coates A.R.M. Deletion of the mycobacterium tuberculosis α-crystallin-like hspX gene causes increased bacterial growth in vivo. Infect. Immun., 2006, vol. 74, no. 2, pp. 861–868. doi: 10.1128/iai.74.2.86123. Kurtz S., McKinnon K.P., Runge M.S., Ting J.P.-Y., Braunstein M. The SecA2 secretion factor of mycobacterium tuberculosis promotes growth in macrophages and inhibits the host immune response. Infect. Immun., 2006, vol. 74, no. 12, pp. 6855–6864. doi: 10.1128/IAI.01022-0624. Lamichhane G., Raghunand T.R., Morrison N.E., Woolwine S.C., Tyagi S., Kandavelou K., Bishai W.R. Deletion of a mycobacterium tuberculosis proteasomal atpase homologue gene produces a slow-growing strain that persists in host tissues. J. Infect. Dis., 2006, vol. 194, iss. 9, pp. 1233–1240. doi: 10.1086/50828825. Manina G., Dhar N., McKinney J.D. Stress and host immunity amplify Mycobacterium tuberculosis phenotypic heterogeneity and induce nongrowing metabolically active forms. Cell Host Microbe, 2015, vol. 17, iss. 1, pp. 32–46. doi: 10.1016/j.chom.2014.11.01626. Martinot A.J., Farrow M., Bai L., Layre E., Cheng T.-Y., Tsai J.H., Iqbal J., Annand J.W., Sullivan Z.A., Hussain M.M., Sacchettini J., Moody D.B., Seeliger J.C., Rubin E.J. Mycobacterial metabolic syndrome: LprG and Rv1410 regulate triacylglyceride levels, growth rate and virulence in mycobacterium tuberculosis. PLOS Pathog., 2016, vol. 12, no. 1:e1005351. doi: 10.1371/journal.ppat.100535127. Morcillo N.S., Imperiale B.R., Di Giulio Á., Zumárraga M.J., Takiff H., Cataldi Á.A. Fitness of drug resistant Mycobacterium tuberculosis and the impact on the transmission among household contacts. Tuberculosis, 2014, vol. 94, iss. 6, pp. 672–677. doi: 10.1016/j.tube.2014.08.00328. Naidoo C.C., Pillay M. Increased in vitro fitness of multi- and extensively drug-resistant F15/LAM4/KZN strains of Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect., 2014, vol. 20, iss. 6, pp. O361–O369. doi: 10.1111/1469-0691.1241529. Perrot S., Dutertre-Catella H., Martin C., Warnet J.-M., Rat P. A new nondestructive cytometric assay based on resazurin metabolism and an organ culture model for the assessment of corneal viability. Cytometry, 2003, Part A, vol. 55A, iss. 1, pp. 7–14. doi: 10.1002/cyto.a.1006730. Reiling N., Homolka S., Walter K., Brandenburg J., Niwinski L., Ernst M., Herzmann C., Lange C., Diel R., Ehlers S., Niemann S. Clade-specific virulence patterns of mycobacterium tuberculosis complex strains in human primary macrophages and aerogenically infected mice. MBio, 2013, vol. 4, no. 4: e00250-13. doi: 10.1128/mBio.00250-1331. Romero M.M., Balboa L., Basile J.I., López B., Ritacco V., de la Barrera S.S., Sasiain M.C., Barrera L., Alemán M. Clinical isolates of mycobacterium tuberculosis differ in their ability to induce respiratory burst and apoptosis in neutrophils as a possible mechanism of immune escape. Clin. Dev. Immunol., 2012, vol. 2012, 11 p. doi: 10.1155/2012/15254632. Schierloh P., Klepp L., Vazquez C., Rocha R.V., Blanco F.C., Balboa L., Schierloh P., Klepp L., Vazquez C., Rocha R.V., Blanco F.C., Balboa L., López B., Ritacco V., Bigi F., Sasiain M.C. Differential expression of immunogenic proteins on virulent mycobacterium tuberculosis clinical isolates. Biomed. Res. Int., 2014, vol. 2014, 13 p. doi: 10.1155/2014/74130933. Smith K.L.J., Saini D., Bardarov S., Larsen M., Frothingham R., Gandhi N.R., Jacobs Jr.W.R., Sturm A.W., Lee S. Reduced virulence of an extensively drug-resistant outbreak strain of mycobacterium tuberculosis in a murine model. PLoS One, 2014, vol. 9, iss. 4: e94953. doi: 10.1371/journal.pone.009495334. Spies F.S., von Groll A., Ribeiro A.W., Ramos D.F., Ribeiro M.O., Regina E., Costa D., Martin A., Carlos J., Lucia M., Zaha A., Eduardo P., Silva A. Biological cost in Mycobacterium tuberculosis with mutations in the rpsL, rrs , rpoB, and katG genes. Tuberculosis, 2013, vol. 93, iss. 2, pp. 150–154. doi: 10.1016/j.tube.2012.11.00435. Stavrum R., PrayGod G., Range N., Faurholt-Jepsen D., Jeremiah K., Faurholt-Jepsen M., Jeremiah K., Faurholt-Jepsen M., Krarup H., Aabye M.G., Changalucha J., Friis H., Andersen A.B., Grewal H.Ms. Increased level of acute phase reactants in patients infected with modern Mycobacterium tuberculosis genotypes in Mwanza, Tanzania. BMC Infect. Dis., 2014, vol. 14, pp. 309–321. doi: 10.1186/1471-2334-14-30936. Swanepoel C.C., Loots D.T. The use of functional genomics in conjunction with metabolomics for Mycobacterium tuberculosis research. Dis. Markers, 2014, vol. 2014, 12 p. doi: 10.1155/2014/12421837. Toungoussova O.S., Caugant D.A., Sandven P., Mariandyshev A.O., Bjune G. Impact of drug resistance on fitness of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing genotype. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2004, vol. 42, iss. 3, pp. 281–290. doi: 10.1016/j.femsim.2004.05.01238. Von Groll A., Martin A., Portaels F., da Silva P.E.A., Palomino J.C. Growth kinetics of Mycobacterium tuberculosis measured by quantitative resazurin reduction assay: a tool for fitness studies. Brazilian J. Microbiol., 2010, vol. 41, no. 2, pp. 300–303. doi: 10.1590/S1517-8382201000020000639. Von Groll A., Martin A., Stehr M., Singh M., Portaels F., da Silva P.E.A., Palomino J.C. Fitness of mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing and Non-W-Beijing genotype. PLoS One, 2010, vol. 5, iss. 4: e10191. doi: 10.1371/journal.pone.0010191