Causative agents of melioidosis and glanders are among the most dangerous bacterial pathogens for human. Moreover, Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei are considered to be potential bioterrorism agents. In connection with this, timely diagnostics of such bacteria is of high importance. In our study, we made an attempt to develop an approach for detecting pathogenic Burkholderia spp. by combining species-specific amplification and strain-specific dot blotting assay with monoclonal antibodies. The following pathogenic Burkholderia strains were used in experiments: B. mallei (C-4, C-5, t-12, B-120, P-1, Мuksuwar-11, Z-12,Zagreb, Ivanovich, 5534), and B. pseudomallei (100, 102, 115, 116, 132, 135, 301, 51274, 60913, 61503). Real-Time PCR (RT-PCR) and dot blotting with monoclonal antibodies against surface Burkholderia epitopes were used to detect such pathogens. RT-PCR was carried out by using primers designed to recognize DNA fragments in B. mallei IS407A-fliP and the gene Orf12 from B. pseudomallei. For this, DNA was isolated from bacterial cells suspended at 1 × 104 microbial cells/ml. accumulation of the end reaction products was visualized by staining with dye SYBR Green I. Specificity of amplification reaction was determined by measuring melting temperature (Tm) for end products followed by running gel electrophoresis. It was demonstrated that all ten strains of either B. mallei or B. pseudomallei examined in the study were detected by using primers against IS407A-fliP DNA fragment and the gene Orf12, respectively. It was demonstrated that all ten strains of either B. mallei or B. pseudomallei examined in the study were detected by using primers against IS407A-fliP DNA fragment and the gene Orf12, respectively. Importantly, no signals specific to heterologous microbial DNA (isolated from bacterial cell suspension at concentration of 1 × 107 microbial cells/ml) were detected by using RT-PCR. Thus, RT-PCR provides an opportunity for assessing an inter-species diversity among pathogenic Burkholderia species. A genus-specificity was observed by using monoclonal antibodies 3D3 which bind to both Burkholderia strains, whereas antibodies 2D11 exhibited no selective binding to strain Р1 B. mallei and strain 100 B. pseudomallei, thereby displaying a strain-specific interaction. Thus, it allowed to conclude that combining a species-specific DNA amplification particularly RT-PCR together with immune-based assay such as dot blotting by using a panel of monoclonal antibodies seems to be a promising approach for assessing intra-species diversity among pathogenic Burkholderia.
В системах классификации опасных бактериальных патогенов возбудители мелиоидоза и сапа входят в число наиболее опасных для человека. Кроме того, Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei являются потенциальными агентами биотерроризма. В связи с этим своевременная диагностика этих микроорганизмов является актуальной. В настоящей работе предпринята попытка разработать способ выявления патогенных буркхольдерий, основанный на сочетании видоспецифичной амплификации ДНК и штаммоспецифичного дот-блот анализа на основе моноклональных антител (МКАт). В работе использовали следующие штаммы патогенных буркхольдерий: B. mallei (C-4, C-5, t-12, B-120, P-1, Мuksuwar-11, Z-12, Zagreb, Ivanovich, 5534), B. pseudomallei (100, 102, 115, 116, 132, 135, 301, 51274, 60913, 61503). Детекцию патогенов проводили методами ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и дот-блота на основе моноклональных антител к поверхностным структурам буркхольдерий. Для ПЦР-РВ были сконструированы оригинальные праймеры к фрагменту ДНК IS407A-fliP B. mallei и к гену Orf12 B. pseudomallei. Для реакции ПЦР-РВ ДНК выделяли из суспензии бактериальных клеток в концентрации 1 × 104 микробных клеток/мл. Накопление конечного продукта реакции регистрировали с использованием красителя SYBR Green I. Для определения специфичности реакции амплификации регистрировали температуры плавления (Tm) полученных продуктов и проводили их электрофоретический анализ. Показано, что при использовании праймеров к фрагменту ДНК IS407A-fliP выявляются все 10 исследованных штаммов B. mallei, а праймеров к гену Orf12 — все 10 штаммов B. pseudomallei. Сигналов с ДНК гетерологичных микроорганизмов (выделенной из бактериальных суспензий с концентрацией 1 ×107 м.к./мл), в ПЦР-РВ получено не было. Таким образом, ПЦР-РВ дает возможность проводить межвидовую дифференциацию патогенных буркхольдерий. В дот-блот анализе МКАт 3D3 связываются с клетками штаммов обоих возбудителей, то есть демонстрируют родоспецифичность. Моноклональные антитела 2D11, в отличии от МКАт 3D3, избирательно не связываются с клетками штаммов Р1 B. mallei и 100 B. pseudomallei, то есть обладают штаммоспецифическим профилем взаимодействия. Сделан вывод о том, что сочетание видоспецифичной амплификации ДНК (ПЦР-РВ) и иммунного анализа (дот-блот), с использованием набора моноклональных антител различного профиля взаимодействия со штаммами, перспективно для внутривидовой дифференциации патогенных буркхольдерий.