PhD, MD (Biology), Head of LaboratoryTesting Centre, St. Petersburg Pasteur Institute; Professor of Surgical Dentistry Department, St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russian Federation;
д.б.н., руководитель испытательного лабораторного центра ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера; профессор кафедры челюстно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии СПбГУ, Санкт-Петербург, Россия;
Bacteriologist, Head of Bacterial Laboratory, The Nikiforov All-Russian Center of Emergency and Radiation Medicine
врач-бактериолог, зав. лабораторией бактериологических исследований
PhD, MD (Medicine), Professor of Surgical Dentistry Department
д.м.н., профессор кафедры челюстно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии
PhD, MD (Medicine), Professor, Head of Surgical Dentistry Department
д.м.н., профессор, зав. кафедрой челюстно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии
The Enterobacteriaceae antibiotics resistance depends on a combination of several mechanisms, such as the beta-lactamases overproduction, the microbial cell reduction outer membrane permeability (usually associated with loss of protein porin), the presence of efflux systems. Particularly noteworthy are the metallo-beta-lactamases (MBL) whose presence causes resistance of gram-negative microorganisms to all beta-lactam antibiotics (in some cases except aztreonam). Currently there are no MBL inhibitors permitted for use in the clinic. The effective inhibitors search for carbapenem-resistant bacteria’ MBL authorized for use in the clinic and reinforcing effects of carbapenems, served as the basis for the present study. The work was carried out in three stages: 1) creating a model system using a standard enzyme reagent metallo-beta-lactamase P. aeruginosa recombinant expressed in E. coli, to evaluate the increasing of minimal inhibitory concentrations (MIC) of carbapenems against previously sensitive Gram-negative microorganisms strains in vitro;
2) evaluation of MBL promising inhibitors in the presence of the same standard enzyme reagent; 3) evaluation of the ability of the identified inhibitors increase the carbapenems effects against clinical isolates of Gram-negative microorganisms producing MBL, in terms of the their MIC and fractional inhibitory concentration index (FIC index). The checkerboard array was modified to evaluate the combined use of carbapenems and potential MBL inhibitor — a drug from the group of bisphosphonates — etidronic acid. Using a standard enzyme reagent metallo-beta-lactamase P. aeruginosa recombinant expressed in E. coli, we created a model system that allows to assess the prospects of new inhibitors MBL gram-negative microorganisms. A dose-dependent effect of increasing the meropenem level MIC from reagent MBL quantity in a model system against previously antibiotic sensitive reference strains of microorganisms was revealed. MBL enzyme inactivation was noted in the presence of even small doses of bisphosphonate, in the tests the appearance of logarithmic phase of P. aeru ginosa ATCC 27853 growth was shown delayed up to 12 hours compared to the control. In this case the maximum dose of etidronic acid 50 000–100 000 μg/ml completely inhibited the MBL, there was no a log phase microbe’s growth due to the effect of meropenem on the reference level of sensitivity (2 μg/ml). The synergistic effect (FIC index < 0.5) of combined meropenem with etidronic acid use was identified against clinical isolates Gram-negative microorganisms resistant to carbapenems and producing MBL, wherein the enhancing action of the antibiotic was more 8–512 times compared with the initial MIC levels.
Устойчивость к антибиотикам среди микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae обусловлена комбинацией нескольких механизмов, например, гиперпродукцией бета-лактамаз, снижением проницаемости внешней мембраны микробной клетки (обычно это связано с утратой пориновых белков), наличием системы эффлюкса. Особого внимания заслуживают металло-бета-лактамазы (МБЛ), наличие которых обуславливает устойчивость грамотрицательных микроорганизмов ко всем бета-лактамным антибиотикам (в некоторых случаях, кроме азтреонама). В настоящее время нет ингибиторов МБЛ карбапенемрезистентных микроорганизмов, разрешенных для применения в клинике. Поиск эффективных ингибиторов МБЛ карбапенемрезистентных микроорганизмов, разрешенных к применению в клинике и усиливающих действие карбапенемов, послужил основанием для выполнения данного исследования. Работу проводили в 3 этапа: 1) создание модельной системы с использованием стандартного реактива фермента металло-бета-лактамазы P. aeruginosa рекомбинантной, экспрессированной в E. coli, для оценки повышения минимальных подавляющих концентраций (МПК) карбапенемов в отношении ранее чувствительных к ним штаммов грамотрицательных микроорганизмов in vitro; 2) оценка эффективности перспективных ингибиторов МБЛ в присутствии того же стандартного реактива фермента; 3) оценка способности выявленных ингибиторов усиливать действие карбапенемов в отношении клинических изолятов грамотрицательных микроорганизмов, продуцирующих МБЛ, по показателям МПК и индекса фракционной ингибирующей концентрации (ФИК). Стандартный метод «шахматной доски» модифицировали для оценки сочетанного применения антибиотика из группы карбапенемов и потенциального ингибитора МБЛ — лекарственного препарата из группы бисфосфонатов — этидроновой кислоты. С использованием стандартного реактива фермента металло-бета-лактамазы P. aeruginosa рекомбинантной, экспрессированной в E. coli, создали модельную систему, которая позволяет оценить перспективность новых ингибиторов МБЛ грамотрицательных микроорганизмов. Выявлен дозозависимый эффект повышения уровня МПК меропенема от количества реактива МБЛ в модельной системе в отношении ранее чувствительных к антибиотику референс-штаммов микроорганизмов. Отмечена инактивация фермента МБЛ даже малыми дозами бисфосфоната, в исследованиях показана задержка появления логарифмической фазы роста тест-культуры P. aeruginosa ATCC 27853 до 12 часов по сравнению с контролем. При этом максимальные дозы этидроновой кислоты 50 000–100 000 мкг/мл полностью ингибировали МБЛ, наблюдали отсутствие логарифмической фазы роста микроба за счет действия меропенема на уровне референтного значения чувствительности (2 мкг/мл). Выявлено синергидное действие (индекс ФИК < 0,5) сочетанного применения меропенема с этидроновой кислотой в отношении клинических резистентных к карбапенемам изолятов грамотрицательных микроорганизмов, при этом показано усиление действия антибиотика в 8–512 раз по сравнению с исходным уровнем МПК.