Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI34810.15789/2220-7619-2015-4-315-322ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИPRODUCTION OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TB10.4 RECOMBINANT PROTEIN IN ESCHERICHIA COLIПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА TB10.4 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLIDukhovlinovI. V.ДуховлиновИ. В.
Russian Federation
dukhovlinov@gmail.comFedorovaE. A.ФедороваЕ. А.
Russian Federation
DobrovolskayaO. A.ДобровольскаяО. А.
Russian Federation
BogomolovaE. G.БогомоловаЕ. Г.
Russian Federation
ChernyaevaE. N.ЧерняеваЕ. Н.
Russian Federation
Al-ShekhadatR. I.Аль-ШехадатР. И.
Russian Federation
SimbirtsevA. S.СимбирцевА. С.
Russian Federation
Research Institute of Highly Pure Biopreparations, St. Petersburg, Russian FederationФГУП Государственный НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия16122015543153221502201615022016Copyright ©; 2015, Dukhovlinov I.V., Fedorova E.A., Dobrovolskaya O.A., Bogomolova E.G., Chernyaeva E.N., Al-Shekhadat R.I., Simbirtsev A.S.Copyright ©; 2015, Духовлинов И.В., Федорова Е.А., Добровольская О.А., Богомолова Е.Г., Черняева Е.Н., Аль-Шехадат Р.И., Симбирцев А.С.2015Dukhovlinov I.V., Fedorova E.A., Dobrovolskaya O.A., Bogomolova E.G., Chernyaeva E.N., Al-Shekhadat R.I., Simbirtsev A.S.Духовлинов И.В., Федорова Е.А., Добровольская О.А., Богомолова Е.Г., Черняева Е.Н., Аль-Шехадат Р.И., Симбирцев А.С.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/348

Nowadays tuberculosis is considered one of the most dangerous infectious diseases occurring everywhere, and it remains a cause of death of millions of people around the world. According to the World Health Organization data, in 2013 tuberculosis caused more than 9 million cases worldwide and about 1.5 million of infected people died. The causative agent of tuberculosis in most cases is Mycobacterium tuberculosis. But sometimes it can be Mycobacterium bovis or Mycobacterium africanum. Mainly as a result of infection, a bacterial infection affects the lungs, but the disease may develop in other organs and tissues. Now for the prevention of tuberculosis vaccination of newborns with attenuated vaccine BCG is widely used. The production of this vaccine is cheap and it is safe to use. Thus today, vaccination is the primary means of prevention of tuberculosis. However dubious efficacy and a number of side effects observed after vaccination, makes the scientific community to develop new effective methods for the treatment of tuberculosis. One of the ways to develop new vaccines against tuberculosis is to provide a subunit vaccine based on recombinant proteins. Advantages of subunit vaccines are that the preparation containing the purified protein is stable and secure, its chemical properties are known, it does not contain additional proteins and nucleic acids, which could cause undesirable effects in the human body. One of the most promising antigens for use as components in new vaccines is considered a low molecular weight secreted protein TB10.4. TB10.4 protein is recognized at an early stage of tuberculous infection and contributes to the proliferation of lymphocytes responsible for the production of IFNγ. TB10.4 protein also possesses an adjuvant effect when administered in combination with mycobacterial proteins. Given these properties, the recombinant protein TB10.4 can be used to generate new candidate vaccines against tuberculosis. During the study was created high-yield E. coli strain, which produces the recombinant protein TB10.4, selected the optimal protocol of induction of the gene encoding the protein. The protein was purified using metal affinity chromatography. The purity of the final preparation reached 98%. 

На сегодняшний день туберкулез является одним из самых распространенных и опасных заболеваний в мире. Туберкулез сегодня, как и в начале XX в. — основная причина смерти от инфекционных заболеваний, вызванных бактериальными агентами. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, в 2013 г. в мире туберкулезом заболело более 9 млн человек и около 1,5 млн заболевших погибло. Возбудителем туберкулеза является бактерия Mycobacterium tuberculosis, реже — родственные ей виды Mycobacterium bovis и Mycobacterium africanum. В основном в результате заражения бактериальная инфекция поражает легкие, однако возможно развитие заболевания и в других органах и тканях. На сегодняшний день эффективная вакцинация признана наиболее перспективной стратегией борьбы с туберкулезом. Однако на данный момент единственной зарегистрированной и разрешенной к применению противотуберкулезной вакциной является вакцина БЦЖ. В мире существует много разновидностей этой вакцины; все они производные одного штамма и незначительно различаются между собой по эффективности. Сомнительная эффективность вакцинации БЦЖ и побочные эффекты заставляют научное сообщество разрабатывать новые средства профилактики туберкулеза. Можно выделить ряд направлений разработки новых противотуберкулезных вакцин, одним из которых является создание субъединичных вакцин на основе рекомбинантных белков. Достоинства субъединичных вакцин заключаются в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызвать нежелательные эффекты в организме. На данный момент идентифицирован ряд антигенов Mycobacterium tuberculosis, перспективных для использования в качестве компонентов новых вакцин. Так, культуральный фильтрат Mycobacterium tuberculosis содержит иммунодоминантные секретируемые антигены, из которых одним из наиболее изученных является белок TB10.4. Белок TB10.4 специфичен для микобактерий, распознается на ранней стадии туберкулезной инфекции и способствует пролиферации лимфоцитов, ответственных за продукцию IFNγ. Белок TB10.4 также обладает адъювантным действием при введении в комплексе с белками микобактерий. Учитывая эти свойства, рекомбинантный белок TB10.4 может быть использован для создания новых кандидатных вакцин против туберкулеза.

recombinant TB10.4vaccinetuberculosisproducing straincell culturepurifying methodрекомбинантный TB10.4вакцинытуберкулезштамм-продуценткультура клетокспособ очистки1. Поливалентные вакцины, содержащие рекомбинант ные вирусные векторы: пат. 012037 США: МПК C12N 7/01, C12N 15/34, C12N 15/31, C12N 15/861, A61K 39/04 / Хавенга М.Я.Э. (Нидерланды), Вогелс Р. (Нидерланды), Сэдофф Д. (США), Хоун Д. (США), Скейки Я.А.В. (США), Радошевич К. (Нидерланды); заявитель и патентообладатель Круселл Холланд Б.В. (Нидерланды), Эйрас Глоубал Тиби Вэксин Фаундейшн (США); патент. поверенный Медведев В.Н. (Россия). – № 200701084, заявл. 2005.11.15, опубл. 2006.05.26. [Polivalentnye vaktsiny, soderzhashchie rekombinantnye virusnye vektory [Polyvalent vaccines containing recombinant viral vectors]: pat. 012037 США: МПК C12N 7/01, C12N 15/34, C12N 15/31, C12N 15/861, A61K 39/04 / Khavenga M.Ya.E. (Netherlands), Vogels R. (Netherlands), Sedoff D. (USA), Khoun D. (USA), Skeiki Ya.A.V. (USA), Radoshevich K. (Netherlands); applicant and patentee Krusell Kholland B.V. (Netherlands), Eiras Global Tibi Vexin Foundation (USA); patent attorney Medvedev V.N. (Russia). – № 200701084, Appl. 2005.11.15, publ. 2006.05.26. (In Russ.)]2. Стукова M.A., Заболотных Н.В., Виноградова Т.И., Гергерт В.Я., Апт А.С., Капрельянц А.С., Ерохин В.В., Яблонский П.К., Киселев О.И. Профилактика туберкулеза: современные подходы к разработке противотуберкулезных вакцин // Вестник Российской академии медицинских наук. 2012. № 11. C. 45–52. [Stukova M.A., Zabolotnykh N.V., Vinogradova T.I., Gergert V.Ya., Apt A.S., Kaprel’yants A.S., Erokhin V.V., Yablonskii P.K., Kiselev O.I. Prevention of tuberculosis: current approaches to development of vaccines. Vestnik Rossiiskoi akademii meditsinskikh nauk = Herald of the Russian Academy of Medical Sciences, 2012, no. 11, pp. 45–52. (In Russ.)]3. Татьков С.И., Дейнеко Е.В., Фурман Д.П. Перспективы создания противотуберкулезных вакцин нового поколения // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011. Т. 15, № 1. С. 114–129. [Tat’kov S.I., Peineko E.V., Furman D.P. Prospects for designing a new generation of anti-tuberculosis vaccine. Vavilovskii zhurnal genetiki i selektsii = Vavilov Journal of Genetics and Breeding, 2011, vol. 15, no. 1, pp. 114–129. (In Russ.)]4. Cole S.T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon S.V., Eiglmeier K., Gas S., Barry C.E., Tekaia F., Badcock K., Basham D., Brown D., Chillingworth T., Connor R., Davies R., Devlin K., Feltwell T., Gentles S., Hamlin N., Holroyd S., Hornsby T., Jagels K., Krogh A., McLean J., Moule S., Murphy L., Oliver K., Osborne J., Quail M.A., Rajandream M.A., Rogers J., Rutter S., Seeger K., Skelton J., Squares R., Squares S., Sulston J.E., Taylor K., Whitehead S., Barrell B.G. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature, 1998, vol. 393, no. 6685, pp. 537–544.5. Haile M., Källenius G. Recent developments in tuberculosis vaccines. Curr. Opin. Infect. Dis., 2005, vol. 18, no. 3, pp. 211–215.6. Iem V., Somphavong S., Buisson Y., Steenkeste N., Breysse F., Chomarat M., Sylavanh P., Nanthavong P., Rajoharison A., Berland J.L., Paboriboune P. Resistance of Mycobacterium tuberculosis to antibiotics in Lao PDR: first multicentric study conducted in 3 hospitals. BMC Infect. Dis., 2013, vol. 13, no. 1, 275 p. doi: 10.1186/1471-2334-13-2757. Invitrogen. Ni-NTA purification system. User manual. Catalog nos. K950-01, K951-01, K952-01, K953-01, K954-01, R901-01, R901-10, R 901-15. Version C. 25-0496, 2006, 32 p.8. Lindenstrøm T., Agger E.M., Korsholm K.S., Darrah P.A., Aagaard C., Seder R.A., Rosenkrands I., Andersen P. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells. J. Immunol., 2009, vol. 182, no. 12, pp. 8047–8055. doi: 10.4049/jimmunol.08015929. Majumder K. Ligation-free gene synthesis by PCR: synthesis and mutagenesis at multiple loci of a chimeric gene encoding OmpA signal peptide and hirudin. Gene, 1992, vol. 110, no. 1, pp. 89–94. doi: 10.1016/0378-1119(92)90448-X10. Rodrigues L.C., Pereira S.M., Cunha S.S., Genser B., Ichihara M.Y., de Brito S.C., Hijjar M.A., Dourado I., Cruz A.A., Sant’Anna C., Bierrenbach A.L., Barreto M.L. Effect of BCG revaccination on incidence of tuberculosis in school-aged children in Brazil: the BCG-REVAC cluster-randomised trial. Lancet, 2005, vol. 366, no. 9493, pp. 1290–1295. doi: 10.1016/S0140-6736(05)67145-011. Russell D.G., Barry C.E., Flynn J.L. Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us. Science, 2010, vol. 328, no. 5980, pp. 852–856. doi: 10.1126/science.118478412. Schägger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem., 1987, vol. 166, no. 2, pp. 368–379.13. Sharma A.K., Khuller G.K. Recombinant mycobacterial proteins future directions to improve protective efficacy. Indian J. Exp. Biol., 2001, vol. 39, no. 12, pp. 1214–1219.14. Skjøt R.L.V., Oettinger T., Rosenkrands I., Ravn P., Brock I., Jacobsen S., Andersen P. Comparative evaluation of low-molecularmass proteins from Mycobacterium tuberculosis identifies members of the ESAT-6 family as immunodominant T-cell antigens. Infect. Immun., 2000, vol. 68, no. 1, pp. 214–220. doi: 10.1128/IAI.68.1.214-220.200015. WHO. BCG vaccine. WHO Wkly Epidemiol. Rec., 2004, vol. 79, no. 4, pp. 27–38.