Researcher of the Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation;
научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия;
Senior Researcher of the Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation;
старший научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия;
PhD (Biology), Leading Researcher of the Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation;
к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия;
PhD (Biology), Head of the Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Deputy Director for Research and Development, Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation;
к.б.н., зав. лабораторией молекулярной вирусологии и генной инженерии, зам. директора по науке и развитию ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия;
PhD, MD (Biology), Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, Director of the Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation
академик РАН, д.б.н., профессор, директор ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия
Аnalogues of nucleos(t)ides (AN) such as lamivudine (LAM), telbivudine (TBV), adefovir (ADP), entecavir (ENT) are widely used for the treatment of chronic hepatitis B (CHB). However, the prolonged treatment using these drugs often leads to the development of drug resistance. The most common substitutions in the reverse transcriptase are methionine for valine (rtM204V), or methionine for isoleucine (rtM204I) at position 204. Early AN-resistant mutations detection is of great importance to determine the treatment strategy of patients with CHB. Currently there are many highly sensitive methods for detection of drug resistance mutations, such as next-generation sequencing, reverse hybridizationbased line probe assay (LiPA), mass spectrometry. However, these methods require expensive equipment and reagents, and they are not widely used in clinical laboratories. The aim of this study was to develop a simple and accurate real-time PCR method for detection of rtM204I/V mutation. This method showed high specificity and sensitivity (1000 copies/ml), it is less laborious and does not require additional equipment, fast and cost effective compared to other methods. HBV mutations of resistance to AN were determined in 5 groups of patients with CHB. Patients of the first group received monotherapy with pegylated interferon (n = 12), the second group — lamivudine (n = 10), the third group — telbivudine (n = 7), the fourth group — entecavir (n = 15). The fifth group consisted of patients who did not receive antiviral therapy (n = 3). The frequency of mutations in HBV polymerase YMDD-motif was determined among 47 patients with CHB: it was 10% for lamivudine treated patients, 20% — for entecavir, 28% — for telbivudine. YIDD/YVDD motifs were identified in two patients and YMDD/YIDD — in one patient. Real-time PCR method for the detection of AN-resistant rtM204I/V mutations in HBV polymerase can be used in routine diagnostics for primary screening of patients not responding to AN treatment. The application of this method can reduce the number of samples for in-depth study of primary and compensatory mutations of resistance to AN by sequencing method. The developed method versus Sanger-sequencing is fast, economical, and provides the detection of minor variants of HBV populations.
Для лечения хронического гепатита В (ХГВ) широко используются аналоги нуклеоз(т)идов (АН), такие как ламивудин (ЛАМ), телбивудин (ТБВ), адефовир (АДФ), энтекавир (ЭНТ). Однако длительное применение этих препаратов часто приводит к развитию лекарственной устойчивости. Наиболее часто встречаются замены метионина на валин в 204 положении обратной транскриптазы (rtM204V), либо метионина на изолейцин (rtM204I). Раннее выявление мутаций устойчивости к АН имеет большое значение для определения стратегии лечения пациентов с ХГВ. В настоящее время существует много высокочувствительных технологий обнаружения мутаций устойчивости, таких как секвенирование нового поколения, метод обратной гибридизации с использованием олигонуклеотидных зондов (LiPA), масс-спектрометрический метод. Однако эти методы требуют дорогостоящего оборудования и реактивов, поэтому их использование в клинических лабораториях пока не получило широкого применения. Целью данной работы было разработать простой и точный метод для определения мутации rtM204I/V, основанный на ПЦР в реальном времени. Разработанный метод показал высокую специфичность и чувствительность (1000 копий/мл), он менее трудоемок, не нуждается в дополнительном оборудовании, более быстрый и экономичный в сравнении с другими методами. Мутации устойчивости ВГВ к АН определяли в 5 группах пациентов с ХГВ. Пациенты первой группы получали монотерапию пегилированным интерфероном (n = 12), второй группы — ламивудином (n = 10), третьей группы — телбивудином (n = 7), четвертой группы — энтекавиром (n = 15). В пятую группу вошли пациенты, не получавшие противовирусную терапию (n = 3). Среди обследованных 47 пациентов с ХГВ распространенность мутаций в YMDD-мотиве полимеразы у пациентов, получавших ламивудин, составила 10%, энтекавир — 20%, телбивудин — 28%. У двух пациентов были выявлены последовательности YIDD/YVDD и у одного — YMDD/ YIDD. ПЦР-метод обнаружения мутаций устойчивости ВГВ rtM204I/V к АН с детекцией в режиме реального времени может быть использован для первичного скрининга пациентов с ХГВ, не отвечающих на лечение АН. Применение данного метода ограничит число образцов для углубленного изучения первичных и компенсаторных мутаций устойчивости к АН методом секвенирования. При сравнении разработанного метода с широко используемым секвенированием по Сенжеру, данный метод более быстрый, экономичный и способен выявлять минорные варианты популяции ВГВ.