Introduction.HIV-infection is associated with significant pathological changes of the host metabolic processes, such as energy dysfunction, dyslipidemia, protein catabolic effects and amino acid imbalance, which ultimately form the polymorphism of clinical symptoms of the disease. The significant disturbances of protein and lipid metabolism are widely described in asymptomatic and advanced stage HIV-infected patients, but infection-related amino acid abnormalities is not fully explored. The further research of HIV impact on the host metabolic processes in particular, the plasma amino acid profile, are essential for understanding the pathophysiology of HIV-infection. Our aim was to determine the association between CD4 lymphocytes, viral load and plasma L-lysine levels in clinical stages HIV-infected patients. Material and methods.A total of 750 HIV-1-infected males before highly active antiretroviral therapy (HAART) monitored in our center. The patients were classified into four stages of the disease 3, 4a, 4b and 4c, according to the classification system for HIV-infection in Russian Federation (2006). Quantitative HIV-1 RNA assay was performed using (RT-PCR) reverse-transcriptase polymerase chain reaction. The plasma L-lysine levels were assessed by thin layer chromatography (TLC). Results. We observed that plasma L-lysine concentrations markedly decreased with the clinical stages of HIV-infection. Low levels of essential amino acid were found in 57% of HIV-infected subjects in the asymptomatic stage (3), 67% and 68% in the advanced stages (4a and 4b, 4c, respectively). Our data revealed that plasma amino acid concentrations were positively correlated with CD4 count lymphocytes (P < 0.01) and inversely with HIV viral load (P < 0.05) in the total cohort. The mean L-lysine acid levels were significantly lower in advanced stage (4a and 4b, 4c) HIV-infected patients than in controls and asymptomatic stage (3) patients (P < 0.01 and P < 0.001, respectively). Conclusion. There was evidence of the association between plasma L-lysine and HIV-1 RNA level, immunological markers and clinical stages of HIV-infection among the entire cohort. The results show that advanced stages of HIV-infection are characterized by significant changes in plasma L-lysine concentrations with the disease stages of HIV-infection. Levels of this basic amino acid negatively correlating with viral load and inversely with CD4 count lymphocytes. These findings are important for understanding the pathophysiology of HIV-infection and the development of new approaches in the treatment. Although the mechanism is at present conjectural, the influence of plasma L-lysine on the HIV-1 RNA levels must be considered and remains to be proved.
Введение. Прямое и опосредованное цитопатическое действие ВИЧ, изменение интенсивности и направленности метаболических процессов, развивающийся иммунный дисбаланс и вирусиндуцированная дестабилизация гомеостаза в совокупности формируют полиморфизм клинической симптоматики и полиорганность поражений при ВИЧ-инфекции. В научных источниках представлены данные об увеличении белкового, липидного и основного обмена, азотистого и аминокислотного дисбаланса в асимптоматической стадии заболевания. Дальнейшие исследования метаболических изменений и, в частности, аминокислотного профиля вследствие инфицирования вирусом иммунодефицита человека представляют практический интерес с позиций патофизиологии ВИЧ-инфекции. Целью работы является изучение взаимосвязи иммуносупрессии и увеличения вирусной нагрузки с уровнем L-лизина плазмы у ВИЧ-инфицированных лиц в связи с клиническим течением заболевания. Материалы и методы. Образцы венозной крови для определения гематологических и иммунологических показателей, вирусной нагрузки отбирались в пробирки объемом 5 мл, содержащих 1,6 мг/мл K2 ЭДTA (BD Vacutainer®, США) и исследовались по стандартным методикам. Для определения концентрации L-лизина, венозная кровь центрифугировалась в течение 10 мин (3500 об./мин) для отделения плазмы. Образцы плазмы депротеинизировали 3% раствором сульфосалициловой кислоты и центрифугировали в течение 10 мин (3500 об./мин) для осаждения белков плазмы. Аликвоты супернатанта в объеме 100 мкл переносились в пробирки Эппендорф и хранились при температуре –40°C до проведения исследования методом тонкослойной хроматографии. Образцы цельной крови для определения уровня РНК ВИЧ-1 центрифугировались в течение 10 мин (3500 об./мин), аликвоты плазмы в объеме 1,0 мл переносились в пробирки Эппендорф и хранились при температуре –40°C до проведения исследования. Для определения гематологических и иммунологических параметров цельная венозная кровь исследовались по стандартным методикам в течение 2 ч в лаборатории центра. Определение уровня РНК ВИЧ-1 выполнено методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием коммерческого комплекта с пределом чувствительности 500 копий РНК ВИЧ-1 в мл (АмплиСенс®, ВИЧ-монитор-FRT, Россия), на амплификаторе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» (Rotor-Gene Q, QIAGEN, Германия). Лабораторная методика оценки параметров клеточного иммунитета у ВИЧ-позитивных лиц проводилась на проточном цитометре (Coulter® Epics XL, Beckman Coulter, США) по стандартной методике, с определением уровня CD3, CD4, CD8 лимфоцитов в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) с помощью моноклональных антител. Исследование концентрация аминокислоты L-лизина проведено методом тонкослойной хроматографии с фиксацией нингидриновым реагентом и спектрофотометрической детекцией анализируемых субстратов. Для количественной оценки хроматограмм использовано программное обеспечение TLC® Manager 4.00. Результаты. В исследовании установлено наличие прямой корреляционной связи между количеством CD4 лимфоцитов и уровнем L-лизина плазмы (P < 0,01). Соответственно, выявлена обратная корреляционная связь между количеством копий РНК ВИЧ-1 и уровнем L-лизина (P < 0,05) в общей когорте больных с ВИЧ-инфекцией. В ходе исследования выявлено снижение уровня L-лизина плазмы у больных в стадиях 4а, 4б, 4в, относительно сравниваемых показателей у больных в 3 стадии заболевания и группой доноров (P < 0,01 и P < 0,001 соответственно). Полученные результаты свидетельствуют о наличии аминокислотного дисбаланса у ВИЧ-инфицированных, в частности, достоверного снижения уровня L-лизина плазмы, коррелирующего с основными объективными критериями клинической классификации ВИЧ-инфекции — вирусной нагрузкой и степенью иммуносупрессии. Обсуждение. Установлена обратная корреляционная связь между количеством копий РНК ВИЧ-1 и концентрацией L-лизина в плазме. Наиболее низкие показатели уровня аминокислоты выявлены в прогрессирующих стадиях ВИЧ-инфекции на фоне максимальных значений вирусной нагрузки. В то же время, угнетение репликации ВИЧ при приеме противовирусных препаратов сопровождается достоверным увеличением концентрации L-лизина с превышением референсных значений. Максимально низкие значения аминокислоты и количества копий РНК ВИЧ-1 зафиксированы у пациентов с медленным прогрессированием заболевания: «контроллеров» и «медленных прогрессоров», что подтверждает предположение о лимитирующем влиянии L-лизина на интенсивность синтеза вирусных белков и репликации ВИЧ, посредством изменения активности tRNALys. Результатами настоящего исследования предполагается, что избыток незаменимой аминокислоты увеличивает уровень вирусной нагрузки, патогенетически усугубляя иммуносупрессию и способствуя клиническому прогрессированию заболевания. Дальнейшее изучение метаболических изменений и, в частности, аминокислотного профиля, вследствие инфицирования вирусом иммунодефицита человека, представляется перспективным направлением в создании эффективных методов корректировки возникающих нарушений и контроля ВИЧинфекции.