Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI27210.15789/2220-7619-2015-1-37-44ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИPRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEIN CRM197 IN ESCHERICHIA COLIПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА CRM197 В КЛЕТКАХ E. COLIDukhovlinovI. V.ДуховлиновИ. В.
Russian Federation

PhD (Biology), Head of the Laboratory of Genetic Engineering of Vaccines, Research Institute of Highly Pure Biopreparations, St. Petersburg, Russian Federation; 

к.б.н., начальник лаборатории генетической инженерии вакцин ФГУП ГосНИИ ОЧБ ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия;

dukhovlinov@gmail.comFedorovaE. A.ФедороваЕ. А.
Russian Federation

Researcher, Laboratory of Genetic Engineering of Vaccines, Research Institute of Highly Pure Biopreparations, St. Petersburg, Russian Federation; 

научный сотрудник ФГУП ГосНИИ ОЧБ ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия; 

BogomolovaE. G.БогомоловаЕ. Г.
Russian Federation

Junior Researcher, Laboratory of Genetic Engineering of Vaccines, Research Institute of Highly Pure Biopreparations, St. Petersburg, Russian Federation; 

младший научный сотрудник ФГУП ГосНИИ ОЧБ ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия; 

DobrovolskayaO. A.ДобровольскаяО. А.
Russian Federation

Junior Researcher, Laboratory of Genetic Engineering of Vaccines, Research Institute of Highly Pure Biopreparations, St. Petersburg, Russian Federation; 

младший научный сотрудник лаборатории генетической инженерии вакцин ФГУП ГосНИИ ОЧБ ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия; 

ChernyaevaE. N.ЧерняеваЕ. Н.
Russian Federation

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Genetic Engineering of Vaccines, Research Institute of Highly Pure Biopreparations, St. Petersburg, Russian Federation; 

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории генетической инженерии вакцин ФГУП ГосНИИ ОЧБ ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия;

Al-ShekhadatR. I.Аль-ШехадатР. И.
Russian Federation

PhD (Biology), The Deputy Head, Laboratory of Genetic Engineering of Vaccines, Research Institute of Highly Pure Biopreparations, St. Petersburg, Russian Federation; 

к.б.н., заместитель начальника лаборатории генетической инженерии вакцин ФГУП ГосНИИ ОЧБ ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия;

SimbirtsevA. S.СимбирцевА. С.
Russian Federation

PhD, MD (Medicine), Professor, Director of the Research Institute of Highly Pure Biopreparations, St. Petersburg, Russian Federation. 

д.м.н., профессор, директор ФГУП ГосНИИ ОЧБ ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия. 

197110, Russian Federation, St. Petersburg, Pudozhskaya str., 7, Research Institute of Highly Pure Biopreparations.97110, Россия, Санкт-Петербург, ул. Пудожская, 7, ФГУП ГосНИИ ОЧБ ФМБА России.97110, Россия, Санкт-Петербург, ул. Пудожская, 7, ФГУП ГосНИИ ОЧБ ФМБА России.210420155137442104201521042015Copyright ©; 2015, Dukhovlinov I.V., Fedorova E.A., Bogomolova E.G., Dobrovolskaya O.A., Chernyaeva E.N., Al-Shekhadat R.I., Simbirtsev A.S.Copyright ©; 2015, Духовлинов И.В., Федорова Е.А., Богомолова Е.Г., Добровольская О.А., Черняева Е.Н., Аль-Шехадат Р.И., Симбирцев А.С.2015Dukhovlinov I.V., Fedorova E.A., Bogomolova E.G., Dobrovolskaya O.A., Chernyaeva E.N., Al-Shekhadat R.I., Simbirtsev A.S.Духовлинов И.В., Федорова Е.А., Богомолова Е.Г., Добровольская О.А., Черняева Е.Н., Аль-Шехадат Р.И., Симбирцев А.С.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/272

The CRM197 is a non-toxic mutant of diphtheria toxin having a single amino acid substitution of a glycine for a glutamic acid in position 52. Being naturally nontoxic, CRM197 is a promising adjuvant and ideal carrier protein for conjugate vaccines. Typically, production of diphtheria toxin and some of the non-toxic proteins are carried out by Corynebacterium diphtheriae. Production of recombinant protein CRM197 in Escherichia coli is advantageous. It is simple, cheap and permits production of the target protein in a short time using a non-pathogenic microorganism. In this study patented high-yield-producing E. coli strain was used. As a part of the study the following steps were taken: protocol adjustment for induction of crm197 gene, production and purification of recombinant CRM197 by ion-exchange, hydrophobic and gel-filtration chromatography. The purity of the final preparation reached 97%.

Белок CRM197 является нетоксичным производным дифтерийного токсина и характеризуется одной мутацией, а именно, заменой глицина на глутаминовую кислоту в положении 52. Белок CRM197 является перспективным адъювантом нового поколения, который может быть успешно использован в вакцинных и терапевтических препаратах. Классическим способом получения дифтерийного токсина и его нетоксичных производных является продукция в клетках Corynebacterium diphtheriae. Преимущество использования E. coli в качестве продуцента состоит в том, что данный метод является более простым и дешевым, и позволяет получать рекомбинантный CRM197 в короткие сроки с использованием непатогенного микроорганизма. В данной работе использовался запатентованный высокопродуктивный штамм-продуцент рекомбинантного CRM197 на основе клеток E. coli. В ходе исследования подобран оптимальный протокол индукции экспрессии гена crm197, разработан метод получения высокоочищенного препарата рекомбинантного CRM197 путем последовательного применения ионообменной, гидрофобной и молекулярноситовой типов хроматографии. 

recombinant proteinCRM197adjuvantconjugate vaccinediphtheria toxinEscherichia coliрекомбинантный белокCRM197адъювантконъюгированные вакциныдифтерийный токсинEscherichia coli1. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, vol. 72, pp. 248–254.2. Bromuro C., Romano M., Chiani P., Berti F., Tontini M., Proietti D., Mori E., Torosantucci A., Costantino P., Rappuoli R., Cassone A. Beta-glucan-CRM197 conjugates as candidates antifungal vaccines. Vaccine, 2010, vol. 28, no. 14, pp. 2615–2623.3. Bryant K.A., Block S.L., Baker S.A., Gruber W.C., Scott D.A. PCV13 Infant Study Group. Safety and immunogenicity of a 13-valent pneumococcal conjugate vaccine. Pediatrics, 2010, vol. 125, no. 5, pp. 866–875.4. Dagan R., Poolman J., Siegrist C.A. Glycoconjugate vaccines and immune interference: a review. Vaccine, 2010, vol. 28, no. 34, pp. 5513–5523.5. DeWalt B.W., Murphy J.C., Fox G.E., Willson R.C. Compaction agent clarification of microbial lysates. Protein Expr. Purif., 2003, vol. 28, no. 2, pp. 220–223.6. Gill C.J., Baxter R., Anemona A., Ciavarro G., Dull P. Persistence of immune responses after a single dose of Novartis meningococcal serogroup A, C, W-135 and Y CRM-197 conjugate vaccine (Menveo®) or Menactra® among healthy adolescents. Hum. Vaccin., 2010, vol. 6, no. 11, pp. 881–887.7. Hwang K.W. Haemophilus influenza type b (Hib) vaccine and its carrier proteins. Arch. Pharm. Res., 2010, vol. 33, no. 6, pp. 793–795.8. Kunami N., Yotsumoto F., Ishitsuka K., Fukami T., Odawara T., Manabe S., Ishikawa T., Tamura K., Kuroki M., Miyamoto S. Antitumor effects of CRM197, a specific inhibitor of HB-EGF, in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Anticancer Res., 2011, vol. 31, no. 7, pp. 2483–2488.9. Kuo Y.C., Chung C.Y. Transcytosis of CRM197-grafted polybutylcyanoacrylate nanoparticles for delivering zidovudine across human brain-microvascular endothelial cells. Colloids Surf. B: Biointerfaces, 2012, vol. 91, pp. 242–249.10. LaemmliU.K.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature,1970,vol.227,no.5259, pp. 680–685.11. LekaO.,ValleseF.,PirazziniM.,BertoP.,MontecuccoC.,ZanottiG.DiphtheriatoxinconformationalswitchingatacidicpH. FEBS J., 2014, vol. 281, no. 9, pp. 2115–2122.12. Li M., Su Z.G., Janson J.C. In vitro protein refolding by chromatographic procedures. Protein Expr. Purif., 2004, vol. 33, no. 1, pp. 1–10.13. Park K. Targeted delivery to monocytes. J. Control. Release, 2012, vol. 158, no. 1, p. 1.14. RivettiS.,LauriolaM.,VoltattorniM.,BianchiniM.,MartiniD.,CeccarelliC.,PalmieriA.,MatteiG.,FranchiM.,UgoliniG., Rosati G., Montroni I., Taffurelli M., Solmi R. Gene expression profile of human colon cancer cells treated with cross-reacting material 197, a diphtheria toxin non-toxic mutant. Int. J. Immunopathol. Pharmacol., 2011, vol. 24, no. 3, pp. 639–649.15. Safari D., Dekker H.A., De Jong B., Rijkers G.T., Kamerling J.P., Snippe H. Antibodyand cell-mediated immune responses to a synthetic oligosaccharide conjugate vaccine after booster immunization. Vaccine, 2011, vol. 29, no. 38, pp. 6498–6504.16. Schenk G.J., Haasnoot P.C., Centlivre M., Legrand N., Rip J., De Boer A.G., Berkhout B. Efficient CRM197-mediated drug targeting to monocytes. J. Control. Release, 2012, vol. 158, no. 1, pp. 139–147.17. Shinefield H.R. Overview of the development and current use of CRM(197) conjugate vaccines for pediatric use. Vaccine, 2010, vol. 28, no. 27, pp. 4335–4339.18. SkinnerJ.M.,IndrawatiL.,CannonJ.,BlueJ.,WintersM.,MacnairJ.,PujarN.,MangerW.,ZhangY.,AntonelloJ.,ShiverJ., Caulfield M., Heinrichs J.H. Pre-clinical evaluation of a 15-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV15-CRM197) in an infant-rhesus monkey immunogenicity model. Vaccine, 2011, vol. 29, no. 48, pp. 8870–8876.19. Stefan A., Conti M., Rubboli D., Ravagli L., Presta E., Hochkoeppler A. Overexpression and purification of the recombinant diphtheria toxin variant CRM197 in Escherichia coli. J. Biotechnol., 2010, vol. 156, no. 4, pp. 245–252.20. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif., 2005, vol. 41, no. 1, pp. 207–234.21. TangX.H.,DengS.,LiM.,LuM.S.Theanti-tumoreffectofcross-reactingmaterial197,aninhibitorofheparin-bindingEGFlike growth factor, in human resistant ovarian cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2012, vol. 422, no. 4, pp. 676–680.22. Uchida T., Pappenheimer A.M.Jr., Greany R. Diphtheria toxin and related proteins. I. Isolation and properties of mutant proteins serologically related to diphtheria toxin. J. Biol. Chem., 1973, vol. 248, no. 11, pp. 3838–3844.23. Van den Biggelaar A.H., Pomat W., Bosco A., Phuanukoonnon S., Devitt C.J., Nadal-Sims M.A., Siba P.M., Richmond P.C., Lehmann D., Holt P.G. Pneumococcal conjugate vaccination at birth in a high-risk setting: no evidence for neonatal T-cell tolerance. Vaccine, 2011, vol. 29, no. 33, pp. 5414–5420.24. Yotsumoto F., Oki E., Tokunaga E., Maehara Y., Kuroki M., Miyamoto S. HB-EGF orchestrates the complex signals involved in triple-negative and trastuzumab-resistant breast cancer. Int. J. Cancer, 2010, vol. 127, no. 11, pp. 2707–2717.25. ZhangH.L.,YuanC.,ZhangD.M.,ShiH.S.,LiM.,LuoZ.C.,WanY.,LuL.,LuoS.T.,YangL.Anovelcombinedconjugatevaccine: enhanced immunogenicity of bFGF with CRM197 as a carrier protein. Mol. Med. Rep., 2011, vol. 4, no. 5, pp. 857–863.