PhD (Veterinary), Researcher, Laboratory of Biological Methods, Analytical Methods Division, Department of the Pharmaceutical Analysis
кандидат в. наук, научный сотрудник лаборатории биологических методов Отдела Аналитических методов Департамента Фармацевтического Анализа
PhD (Veterinary), Researcher, Laboratory of Biological Methods, Analytical Methods Division, Department of the Pharmaceutical Analysis
кандидат в. наук, научный сотрудник лаборатории биологических методов Отдела Аналитических методов Департамента Фармацевтического Анализа
Senior Researcher, Laboratory of Immunochemistry, Analytical Methods Division, Department of the Pharmaceutical Analysis
старший научный сотрудник лаборатории иммунохимии Отдела Аналитических методов Департамента Фармацевтического Анализа
PhD (Biology), Head of the Analytical Methods Division, Department of the Pharmaceutical Analysis
кандидат биологических наук, руководитель отдела аналитических методов департамента фармацевтического анализа
Chemist, Laboratory of Biological Methods, Analytical Methods Division, Department of the Pharmaceutical Analysis
химик лаборатории биологических методов Отдела Аналитических методов Департамента Фармацевтического Анализа
Junior Researcher, Laboratory of Biological Methods, Analytical Methods Division, Department of the Pharmaceutical Analysis
младший научный сотрудник лаборатории биологических методов Отдела Аналитических методов Департамента Фармацевтического Анализа
Researcher, Laboratory of Biological Methods, Analytical Methods Division, Department of the Pharmaceutical Analysis
научный сотрудник лаборатории биологических методов Отдела Аналитических методов Департамента Фармацевтического Анализа
Head of the Group of Diagnostic Test Systems, Division of Molecular Diagnostics, Department of the Pharmaceutical Analysis
руководитель группы диагностических тест-систем Отдела молекулярной диагностики Департамента Фармацевтического Анализа
PhD (Biology), Director of the Department of the Pharmaceutical Analysis
кандидат биологических наук, директор департамента фармацевтического анализа
DSc (Medicine), Professor, Vice President of Research and Development
доктор медицинских наук, профессор, вице-президент по исследованиям и разработкам
A proper and representative monitoring of SARS-CoV-2 herd immunity including a long-term health impact on recovered patients and vaccinated individuals is of great importance. For this, a monitoring campaign should assesses both humoral and T-cell immune arms. Upon that, analyzing antigen specific-cell activation and cellular phenotype are informative. We developed a flow cytometry method for detection of intracellular IFNγ-producing antigen-reactive T cells after exposure of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) to SARS-CoV-2 virus antigens. The method was validated according to the following characteristics: sensitivity, specificity, precision, and robustness. We used positive samples from donors recovered from COVID-19 and negative samples from donors who had no contact with COVID-19 patients and lacking antibodies to SARS-CoV-2. All samples were tested by laboratory methods. Peripheral blood mononuclear cells were isolated from donor blood by centrifugation in a Ficoll density gradient. Specific T cells were stimulated with S-protein as well as N, M, ORF3a, and ORF7a protein peptides to count IFNγ-producing T cells by flow cytometer. The data were statistically analyzed. The area limited by ROC-curve and false positive rate (AUC) for CD4 and CD8 cells was from 0.97 to 1.00. Precision was considered acceptable because the coefficient of variation for all PBCM did not exceed 20%. Robustness was confirmed for frozen and freshly prepared PBMC samples. The thresholds levels to recognize immune and non-immune samples were defined for CD4-positive T-cells (0.029%) and CD8-positive T-cells (0.064–0.068%). Also, acceptance criteria for positive and negative controls were defined. Based on the validation, the suitability of the method “Evaluation of antigen-reactive T cells that produce intracellular IFN in response to SARS-CoV-2 virus antigens by flow cytometry” was confirmed. The method allows for reliable data that was used to characterize standard control samples for internal quality control of TigraTest® SARS-CoV-2 kits.
Адекватный и репрезентативный мониторинг популяционного иммунитета к вирусу COVID-19, включая долгосрочное влияние на переболевших и вакцинированных людей, должен включать не только исследование гуморального, но также и Т-клеточного иммунного ответа. При этом важную информацию может дать не только способность клеток активироваться в ответ на специфический антиген, но и определение фенотипа реактивных клеток. Для этого нами разработан метод проточной цитометрии для оценки содержания антиген-реактивных Т-клеток, продуцирующих внутриклеточный IFNγ под воздействием на мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) человека антигенов вируса SARS-CoV-2, и проведена его валидация. Валидационные испытания методики проводили по следующим характеристикам: чувствительность, специфичность, прецизионность и робастность. Валидационные испытания методики по характеристикам «чувствительность» и «специфичность» проводили, исследуя положительные образцы доноров, переболевших COVID-19, с диагнозом, верифицированным лабораторными методами, и отрицательные образцы, отобранные от доноров с отрицательным анамнезом, не контактировавших с больными COVID-19, с отсутствием антител к антигенам SARS-CoV-2. Из крови доноров выделяли мононуклеарные клетки периферической крови методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла и стимулировали специфические Т-клетки пептидами, соответствующими основным белковым антигенам коронавируса SARS-CoV-2 — пептиды S-белка и пептиды белков N, M, ORF3a и ORF7a. Учитывали данные на проточном цитометре, выделяя Т-клетки, продуцирующие IFNγ, и проводили статистический анализ полученных результатов. Значения площади, ограниченной ROC-кривой и осью ложноположительных классификаций (AUC) для популяций CD4 и CD8, составило от 0,97 до 1,00. Методика показала приемлемую сходимость и внутрилабораторную прецизионность, поскольку коэффициенты вариации для всех образцов МКПК не превышали 20%. Была подтверждена робастность при использовании МКПК в свежеприготовленном виде и после цикла заморозки/разморозки. По итогам валидации установлены границы определения позитивного и негативного отклика: для CD4-позитивных Т-клеток — 0,029%, для CD8-позитивных Т-клеток — 0,064–0,068%, а также критерии приемлемости для показателей отклика положительного и отрицательного контрольных антигенов. Таким образом подтверждена пригодность методики «Оценка антиген-реактивных Т-клеток, продуцирующих внутриклеточный IFNγ под воздействием на мононуклеарные клетки периферической крови человека антигенов вируса SARS-CoV-2, методом проточной цитометрии» для получения достоверных результатов при определении содержания внутриклеточного IFNγ в МКПК. Методику использовали при характеризации стандартных контрольных образцов для внутреннего контроля качества наборов ТиграТест® SARS-CoV-2.