Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI1806410.15789/2220-7619-IVC-18064ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИResearch ArticleIn vivo comparative analysis of live influenza vaccine candidates obtained by reverse genetics and classical reassortmentСравнительный анализ штаммов живой гриппозной вакцины, полученных методами обратной генетики и классической реассортации, в экспериментах in vivohttps://orcid.org/0000-0003-1171-338323497140200J-5004-20184709-5010LarionovaNatalie V.ЛарионоваНаталья Валентиновна
Russian Federation

DSc (Biology), Leading Researcher, Laboratory of General Virology, A.A. Smorodintsev Department of Virology and Immunology

д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории общей вирусологии отдела вирусологии и иммунологии им. А.А. Смородинцева

nvlarionova@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3892-98737102041346E-6555-20147857-7306KiselevaIrina V.КиселеваИрина Васильевна
Russian Federation

DSc (Biology), Professor, Head of Laboratory of General Virology, A.A. Smorodintsev Department of Virology and Immunology

д.б.н., профессор, зав. лабораторией общей вирусологии отдела вирусологии и иммунологии им. А.А. Смородинцева

irina.v.kiseleva@mail.ruhttps://orcid.org/0009-0002-2842-8247VorsinaMaya K.ВорсинаМайя Константиновна
Russian Federation

Researcher

научный сотрудник лаборатории общей вирусологии отдела вирусологии и иммунологии им. А.А. Смородинцева

vorsina.02@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9541-563657226491888HRA-2044-2023ChistyakovaAnna K.ЧистяковаАнна Константиновна
Russian Federation

Researcher, Laboratory of General Virology, A.A. Smorodintsev Department of Virology and Immunology

научный сотрудник лаборатории общей вирусологии отдела вирусологии и иммунологии им. А.А. Смородинцева

anna.k.chistiakova@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-8670-864555389452700E-2286-2014StepanovaEkaterina A.СтепановаЕкатерина Алексеевна
Russian Federation

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of General Virology, A.A. Smorodintsev Department of Virology and Immunology

к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории общей вирусологии отдела вирусологии и иммунологии им. А.А. Смородинцева

fedorova.iem@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-0107-995956402849200B-5169-2015RudenkoLarisa G.РуденкоЛариса Георгиевна
Russian Federation

DSc (Medicine), Professor, Head Researcher, A.A. Smorodintsev Department of Virology

д.м.н., профессор, главный научный сотрудник отдела вирусологии и иммунологии им. А.А. Смородинцева

vaccine@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3280-556X56950534400J-5029-2018BazhenovaEkaterina A.БаженоваЕкатерина Андреевна
Russian Federation

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of General Virology, A.A. Smorodintsev Department of Virology and Immunology

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории общей вирусологии отдела вирусологии и иммунологии им. А.А. Смородинцева

sonya.01.08@mail.ruInstitute of Experimental MedicineФГБНУ Институт экспериментальной медицины03122025010620261622432541211202527112025Copyright ©; 2026, Larionova N.V., Kiseleva I.V., Vorsina M.K., Chistyakova A.K., Stepanova E.A., Rudenko L.G., Bazhenova E.A.Copyright ©; 2026, Ларионова Н.В., Киселева И.В., Ворсина М.К., Чистякова А.К., Степанова Е.А., Руденко Л.Г., Баженова Е.А.2026Larionova N.V., Kiseleva I.V., Vorsina M.K., Chistyakova A.K., Stepanova E.A., Rudenko L.G., Bazhenova E.A.Ларионова Н.В., Киселева И.В., Ворсина М.К., Чистякова А.К., Степанова Е.А., Руденко Л.Г., Баженова Е.А.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/18064

Difficulties identified in recent years while preparing reassortant live influenza vaccine (LAIV) strains related to the specific biological properties of currently circulating epidemic influenza viruses, necessitate the search for alternative development pathways that guarantee the rapid and stable production of LAIV candidates. It was shown previously that genetically engineered reassortant LAIV candidates (LAIV-RG) exhibited reduced cold adaptation in developing chicken embryos compared to the A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) master donor virus and vaccine candidates obtained by classical reassortment (LAIV-NR). Concerns that reduced cold adaptation could negatively impact vaccine quality led to implement the objective: to conduct a comparative study of the humoral immune response in laboratory animals to immunization with RG- or NR-LAIV candidates. Materials and methods. In vivo studies involved pairs of LAIV-RG and LAIV-NR strains based on seasonal influenza A(H3N2) viruses and master donor virus for live influenza vaccine. Results. In mouse studies, LAIV-RG candidates demonstrated similar humoral immune response performance to classical reassortants. A slight reduction in the cold-adapted phenotype of LAIV-RG strains did not result in a decrease in their attenuation level. They are as safe for laboratory animals as classical reassortants suggesting that LAIV quality remains unchanged, regardless of the methods used to produce vaccine reassortants. Interestingly, the adaptive Thr-Ile amino acid substitution at position 203 of HA1, identified in three LAIV-NR A(H3N2) candidates belonging to clades 3C.2a1 and 3C.2a2, had a positive effect on increasing the thermal stability of hemagglutinin and their immunogenicity in guinea pigs. Conclusion. Classical and genetically engineered reassortment methods are equally applicable for producing attenuated LAIV candidates, and the quality of vaccine preparations may be improved by targeted introduction of well-characterized favorable mutations into the genome of LAIV-RG strains, such as the mutation in HA1 with the amino acid substitution Thr-203-Ile, which contributes to increased stability and immunogenicity of vaccine strains based on the influenza A(H3N2) viruses of clades 3C.2a1 and 3C.2a2. This should not conflict with regulatory requirements for LAIV.

Выявляемые в последние годы сложности в подготовке реассортантных вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины (ЖГВ), связанные с определенными биологическими свойствами современных эпидемических вирусов гриппа, диктуют необходимость поиска альтернативных путей, гарантирующих быстрое и надежное получение кандидатных вакцин. Ранее было показано, что генно-инженерные реассортантные штаммы для живой гриппозной вакцины (ЖГВRG) отличались сниженным уровнем холодоустойчивости репродукции в развивающихся куриных эмбрионах в сравнении с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и со штаммами, полученными методом классической реассортации (ЖГВNR). Опасения в том, что снижение холодоустойчивости может негативно влиять на качество вакцинного препарата, привели к реализации цели сравнительного исследования гуморального иммунного ответа у мышей на введение препаратов ЖГВRG и ЖГВNR лабораторным животным. Материалы и методы. В исследованиях in vivo на мышах и морских свинках участвовали пары штаммов ЖГВRG и ЖГВNR на основе сезонных вирусов гриппа А(H3N2) и донора аттенуации для живой гриппозной вакцины. Результаты. В исследованиях на мышах по показателям гуморального иммунного ответа штаммы ЖГВRG проявляли себя не хуже, чем классические реассортанты, а некоторое снижение холодоустойчивого фенотипа у штаммов ЖГВRG не приводило к угнетению уровня их аттенуации: они были так же безвредны для лабораторных животных, как и классические реассортанты. Это свидетельствует о том, что вне зависимости от приемов, применяемых для получения вакцинных реассортантов, качество ЖГВ не меняется. Интересно, что адаптационная аминокислотная замена Thr-Ile в 203-й позиции НА1, выявленная у трех штаммов ЖГВNR A(H3N2), принадлежащих к клайдам 3С.2а1 и 3С.2а2, положительно влияла на повышение показателей температурной устойчивости гемагглютинина и их иммуногенности для морских свинок. Выводы. Таким образом, методы классической и генно-инженерной реассортации одинаково применимы для получения аттенуированных живых гриппозных реассортантных вакцин, а качество вакцинных препаратов может быть улучшено за счет целенаправленного введения в геном штаммов ЖГВRG хорошо охарактеризованных благоприятных мутаций, таких как мутация в НА1 с аминокислотной заменой Thr-203-Ile, способствующая повышению стабильности и иммуногенности вакцинных штаммов на основе вируса гриппа A(H3N2) клайдов 3С.2а1 и 3С.2а2, и это не должно противоречить нормативным требованиям на ЖГВ.

live influenza vaccineinfluenza A(H3N2) virusesin vivo studieshumoral immune responsecold adaptationtemperature sensitivityattenuationclassical reassortmentgenetic engineering methodsживая гриппозная вакцинавирусы гриппа А(H3N2)эксперименты in vivoгуморальный иммунный ответхолодовая адаптациятемпературочувствительностьаттенуацияклассическая реассортацияметоды генной инженерииПравительство Российской ФедерацииGovernment of the Russian FederationThe study was carried out within the framework of the state assignment of the Institute of Experimental Medicine FGWG-2025-0015.Работа подготовлена в рамках государственного задания ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» FGWG-2025-0015.Баженова Е.А., Степанова Е.А., Котомина Т.С., Ларионова Н.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Влияние аминокислотной замены T203I в гемагглютинине на биологические свойства вирусов гриппа A/H3N2 // Медицинский академический журнал. 2021. Т. 21. С. 85–90. [Bazhenova E.A., Stepanova E.A., Kotomina T.S., Larionova N.V., Kiseleva I.V., Rudenko L.G. Impact of amino acid substitution T203I in hemagglutinin on growth characteristics in vitro and hemagglutinin thermostability of A/H3N2 influenza viruses. Meditsinskii akademicheskii zhurnal = Medical Academic Journal, 2021, vol. 21, pp. 85–90. (In Russ.)] doi: 10.17816/MAJ77767Вакцина гриппозная живая. ФС.3.3.1.0027.15: Фармакопейная статья. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том III. Дата принятия: 29.10.2015. Дата начала действия: 01.01.2016. [Live influenza vaccine. FS.3.3.1.0027.15: Pharmacopoeial monograph. State Pharmacopoeia of the Russian Federation. 13th ed., Vol. III. Adopted: 29 Oct 2015; effective date: 01 Jan 2016. (In Russ.)] URL: https://docs.cntd.ru/document/420338978Европейская экономическая комиссия. Рекомендация «О руководстве по работе с лабораторными (экспериментальными) животными при проведении доклинических (неклинических) исследований». 14 ноября 2023 г. № 33. 103 с. [Eurasian Economic Commission. Recommendations “Guidance on working with laboratory (experimental) animals in preclinical (nonclinical) studies”. 14 November 2023, No. 33, 103 p. (In Russ.)] URL: https://www.rnof.ru/images/upload/ru/1670/err_20112023_33.pdfКиселева И.В., Крутикова Е.В., Рекстин А.Р., Крышень К.Л., Руденко Л.Г. Мыши как модель для изучения степени аттенуации холодоадаптированных штаммов вируса гриппа // Медицинский академический журнал. 2017. Т. 17. С. 67–75. [Kiseleva I.V., Krutikova E.V., Rekstin A.R., Kryshen K.L., Rudenko L.G. Mouse model for the study of attenuation of cold-adapted influenza viruses. Meditsinskii akademicheskii zhurnal = Medical Academic Journal, 2017, vol. 17, pp. 67–75. (In Russ.)] doi: 10.17816/MAJ17267-75Ларионова Н.В., Киселева И.В., Баженова Е.А., Степанова Е.А., Руденко Л.Г. Оптимизация свойств реассортантных штаммов живой гриппозной вакцины, полученных методом обратной генетики // Инфекция и иммунитет. 2023. Т. 13, № 6. С. 1018–1026. [Larionova N.V., Kiseleva I.V., Bazhenova E.A., Stepanova E.A., Rudenko L.G. Optimization of properties of reassortant strains for live influenza vaccine obtained by reverse genetics. Infektsiya i immunitet = Russian Journal of Infection and Immunity, 2023, vol. 13, no. 6, pp. 1018–1026. (In Russ.)] doi: 10.15789/2220-7619-OPO-17525Baz M., M’hamdi Z., Carbonneau J., Lavigne S., Couture C., Abed Y., Boivin G. Synergistic PA and HA mutations confer mouse adaptation of a contemporary A/H3N2 influenza virus. Sci. Rep., 2019, vol. 9: 16616. doi: 10.1038/s41598-019-51877-4Cotter C.R., Jin H., Chen Z. A single amino acid in the stalk region of the H1N1pdm influenza virus HA protein affects viral fusion, stability and infectivity. PLoS Pathog., 2014, vol. 10: e1003831. doi: 10.1371/journal.ppat.1003831Herlocher M.L., Clavo A.C., Maassab H.F. Sequence comparisons of A/AA/6/60 influenza viruses: mutations which may contribute to attenuation. Virus Res., 1996, vol. 42, pp. 11–25. doi: 10.1016/0168-1702(96)01292-0Isakova-Sivak I., Chen L.M., Matsuoka Y., Voeten J.T., Kiseleva I., Heldens J.G., den Bosch H., Klimov A., Rudenko L., Cox N.J., Donis R.O. Genetic bases of the temperature-sensitive phenotype of a master donor virus used in live attenuated influenza vaccines: A/Leningrad/134/17/57 (H2N2). Virology, 2011, vol. 412, pp. 297–305. doi: 10.1016/j.virol.2011.01.004Jin H., Lu B., Zhou H., Ma C., Zhao J., Yang C.F., Kemble G., Greenberg H. Multiple amino acid residues confer temperature sensitivity to human influenza virus vaccine strains (FluMist) derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60. Virology, 2003, vol. 306, pp. 18–24. doi: 10.1016/S0042-6822(02)00035-1Klimov A.I., Kiseleva I.V., Alexandrova G.I., Cox N.J. Genes coding for polymerase proteins are essential for attenuation of the cold-adapted A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) influenza virus. In: Osterhaus A., Cox N., Hampson A.W. (eds.). Options for the Control of Influenza IV. Crete, Greece, 23–28 September 2000. Elsevier, 2001, pp. 955–959. URL: https://openlibrary.org/books/OL10260218M/Options_for_the_Control_of_Influenza_IVKumari K., Gulati S., Smith D.F., Gulati U., Cummings R.D., Air G.M. Receptor binding specificity of recent human H3N2 influenza viruses. Virol. J., 2007, vol. 4: 42. doi: 10.1186/1743-422X-4-42Nogales A., Martínez-Sobrido L. Reverse genetics approaches for the development of influenza vaccines. Int. J. Mol. Sci., 2016, vol. 18, no. 1: 20. doi: 10.3390/ijms18010020Owen R.E., Yamada E., Thompson C.I., Phillipson L.J., Thompson C., Taylor E., Zambon M., Osborn H.M.I., Barclay W.S., Borrow P. Alterations in receptor binding properties of recent human influenza H3N2 viruses are associated with reduced natural killer cell lysis of infected cells. J. Virol., 2007, vol. 81, pp. 11170–11178. doi: 10.1128/JVI.01217-07Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am. J. Epidemiol., 1938, vol. 27, no. 3, pp. 493–497. doi: 10.1093/oxfordjournals.aje.a118408Ruigrok R.W., Martin S.R., Wharton S.A., Skehel J.J., Bayley P.M., Wiley D.C. Conformational changes in the hemagglutinin of influenza virus which accompany heat-induced fusion of virus with liposomes. Virology, 1986, vol. 155, no. 2, pp. 484–497. doi: 10.1016/0042-6822(86)90210-2Scholtissek C. Stability of infectious influenza A viruses at low pH and at elevated temperature. Vaccine, 1985, vol. 3, pp. 215–218. doi: 10.1016/0264-410X(85)90109-4WHO. Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza. Geneva: World Health Organization, 2011. URL: https://www.who.int/publications/i/item/manual-for-the-laboratory-diagnosis-and-virological-surveillance-of-influenza