Cytokines are main interaction regulators between cells of different origin in higher organisms and human. However similar molecules called cytokine-like substances (CLS) have been also found in more primitive organisms. Using immunochemical methods, CLS mimicking some human cytokines were detected in supernatants obtained after cultivation of different bacterial strains, including Staphylococcus aureus. This article was aimed at assessing immunochemical detection specificity and molecular properties of CLS derived from Staphylococcus aureus АТСС 25923 supernatants. Maximal CLS concentrations were detected using antibodies against human interleukin-1 receptor antagonist (IL-1rа), therefore justifying use of this cytokine for immunochemical specificity studies. According to the obtained data Staphylococcus aureus АТСС 25923 supernatants contained unspecific substance different from IL-1ra because it interacted not only with specific anti IL-1ra antibodies, but also with antibodies recognizing other proteins (for example, human enzyme superoxide dismutase). Upon this, Staphylococcus aureus АТСС 25923 supernatant had no competitive effect on interaction with immobilized IL-1rа, evidencing about the lack of specific antigen in the test material. For CLS identification they were purified from S. aureus АТСС 25923 supernatant using immunoaffinity chromatography on Sepharose column containing anti-human IL-1ra antibodies. In the eluate studied with SDS PAGE electrophoresis we have found heterogenous material characterized by four major bands with Mr = 50–60 kDa and 35 kDa. Importantly, it lacked 20 kDa signal specific for human IL-1ra. Each of four study electrophoretic components were extracted from the gel, digested with trypsin, and analyzed using mass-spectrometry that allowed to identify tryptic peptides highly homologous to that of staphylococcal protein A (SpA). Thus, the data obtained allowed to reveal SpA as a major eluate component. Highly likely it may be assumed that immunoglobulins used in enzyme immunoassay test kits for cytokine detection can react with secretory derivatives of staphylococcal immunoglobulin-binding proteins identified as CLS. Consequently, the so-called CLS detected by ELISA in supernatants derived after staphylococcus cultivation differ from true human cytokines, and their interaction with antibodies may be “non-specific”.
Цитокины регулируют взаимодействие между клетками разного происхождения у высших животных и человека, однако близкие им по структуре молекулы — цитокиноподобные вещества (ЦПВ), обнаружены и у более примитивных организмов. С использованием методов иммунохимического анализа ЦПВ, напоминающие ряд цитокинов человека, обнаружены в супернатантах, полученных после культивировании бактерий разной видовой принадлежности, в том числе в супернатантах бульонных культур бактерий вида Staphylococcus aureus. Целями настоящей работы являлись изучение специфичности иммунохимического определения и молекулярная характеристика ЦПВ из супернатантов культур различных штаммов стафилококков. Поскольку наиболее продуктивным источником ЦПВ являлся штамм Staphylococcus aureus АТСС 25923, а в супернатантах культур стафилококков максимальные концентрации регистрировались с помощью антител к рецепторному антагонисту интерлейкина-1 человека (IL-1rа), была изучена специфичность иммуноферментных методов, используемых для определения именно этого цитокина. Результаты экспериментов показали, что супернатанты Staphylococcus aureus АТСС 25923 содержат вещества, отличные от IL-1ra, поскольку с ними связывались не только специфические к IL-1ra антитела, но и антитела другой направленности (например, к супероксиддисмутазе человека), характеризуя тем самым неспецифичность регистрируемого взаимодействия. При этом супернатант штамма S. aureus АТСС 25923 не оказывал конкурирующего эффекта на взаимодействие с иммобилизованным IL-1rа, что свидетельствовало об отсутствии специфического антигена в тестируемой пробе. Для идентификации ЦПВ их выделяли из супернатанта культуры Staphylococcus aureus АТСС 25923 посредством иммуноаффинной хроматографии на колонке с Сефарозой, нагруженной антителами против IL-1ra. При анализе методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия элюат адсорбированных на антителах к IL-1ra ЦПВ был гетерогенен и характеризовался четырьмя мажорными зонами в области молекулярных масс 50–60 и 35 kDa, причем в спектре отсутствовал компонент с ММ 20 kDa, характерный для белка IL-1ra. Во фракциях разделенных компонентов элюата, вырезанных из геля и подвергнутых обработке трипсином для последующего исследования при помощи масс-спектрометрии, обнаружены триптические пептиды, гомологичные производным стафилококкового белка А (SpA). Результаты этого анализа позволили идентифицировать белок А как основной компонент исследованных образцов элюата. Таким образом, с большой долей вероятности можно полагать, что иммуноглобулины из иммуноферментных тест-систем для определения цитокинов могут реагировать с секреторными производными иммуноглобулин-связывающих белков стафилококков, которые регистрируются как ЦПВ. Следовательно, так называемые ЦПВ, выявляемые методом ИФА в супернатантах культивируемых стафилококков, отличаются от истинных цитокинов человека, а их взаимодействие с антителами носит «неспецифический» характер.