DSc (Biology), Leading Researcher, Laboratory of General Virology
д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории общей вирусологии
DSc (Biology), Professor, Head of Laboratory of General Virology
д.б.н., профессор, зав. лабораторией общей вирусологии
PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of General Virology
к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории общей вирусологии
PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of General Virology
к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории общей вирусологии
DSc (Biology), Professor, Head of the A.A. Smorodintsev Department of Virology
д.б.н., профессор, зав. отделом вирусологии им. А.А. Смородинцева
Classical reassortment in developing chicken eggs is a well-established technique for obtaining LAIV strains. Naturally generated reassortant vaccine strains are characterized by high reproductive capacity, genetically stable characteristics of temperature sensitivity and cold resistance, which correspond to the characteristics of the MDV involved in crossing with the epidemic virus. Along with antigenic relevance, natural reassortment ensures attenuation of vaccine strains, good reproduction capacity in upper respiratory tract cells and inability to reproduction in the lower respiratory tract. With classical reassortment, the speed and efficiency of obtaining vaccine reassortants largely depend on the properties of epidemic virus, and therefore cannot be stable. The potential of reverse genetics is attractive because it allows to obtain vaccine reassortants quickly and efficiently, reduce the likelihood of spontaneous mutations; however, the vaccine strain is deprived of the advantages of natural selection, in which the most viable clones are selected. This study presents the results of comparatively assessed A(H3N2) LAIVs obtained in parallel by classical reassortment and reverse genetics according to criteria confirming that vaccine strains inherit the necessary properties that guarantee their harmlessness and high reproduction in chicken embryos. Strains for LAIV obtained by both methods retained all attenuating mutations inherited from the MDV, were highly reproductive at the optimal temperature, with temperature sensitivity corresponded to the MDV. However, strains obtained by reverse genetics, was observed to have partial loss of cold resistance in comparison with that of the MDV and classical reassortants. Reduced cold adaptation may negatively affect vaccine effectiveness. It is important that after several additional passages in chicken embryos at low temperature, the cold resistance of the vaccine strain, assembled by reverse genetics, was increased. Credibly that cold resistance is a phenotypic trait, the degree of manifestation of which depends on the temperature conditions of virus multiplication. The selective factor of reduced incubation temperature is missing in reverse genetics. In order for the cold-adapted phenotype to be fully realized, additional passages at low temperature of RG-reassortants are necessary. Thus, the reverse genetics method using plasmid technology allows to effectively prepare reassortant strains for LAIV. An important stage in obtaining vaccine strains using genetic engineering techniques should be the control of their cold-adapted phenotype and its optimization by additional passages at low temperature.
Классическая реассортация в развивающихся куриных эмбрионах является хорошо отработанной методикой для получения штаммов живой гриппозной вакцины. Сформированные естественным путем реассортантные вакцинные штаммы характеризуются высокой репродуктивностью, генетически стабильными признаками температурочувствительности и холодоустойчивости, полностью соответствующими характеристикам донора аттенуации, участвующего в скрещивании с эпидемическим вирусом. Наряду с антигенной актуальностью, естественная реассортация гарантирует аттенуацию вакцинных штаммов, хорошую репродуктивность в клетках верхних дыхательных путей и неспособность к репродукции в нижних отделах респираторного тракта. Однако при классической реассортации скорость и эффективность получения вакцинных реассортантов в существенной степени зависят от уникальных свойств эпидемического вируса, и поэтому не могут быть стабильными. Возможности генно-инженерных технологий привлекают тем, что позволяют получать вакцинные реассортанты быстро и эффективно, снижают вероятность появления спонтанных мутаций, позволяют работать с высокопатогенными вирусами, однако вакцинный штамм лишается преимуществ естественного отбора, при котором происходит селекция наиболее жизнеспособных клонов. В настоящем исследовании представлены результаты сравнительной оценки штаммов живой гриппозной вакцины А(Н3N2), полученных параллельно методами классической реассортации и генно-инженерной сборки по критериям, подтверждающим наследование вакцинными штаммами необходимых свойств, гарантирующих их безвредность и высокую репродуктивность в куриных эмбрионах. Реассортантные штаммы для живой гриппозной вакцины, полученные обоими методами, сохраняли все аттенуирующие мутации, унаследованные от донора аттенуации, были высокорепродуктивными при оптимальной температуре, их температурочувствительность соответствовала этому признаку у донора аттенуации. Однако у штаммов, полученных методом обратной генетики, наблюдалась частичная утрата холодоустойчивости по сравнению с холодоустойчивостью донора аттенуации и реассортантов из классического скрещивания. Снижение холодоустойчивости может негативно повлиять на эффективность вакцины. Важно, что за несколько дополнительных пассажей в куриных эмбрионах при пониженной температуре холодоустойчивость вакцинного реассортантного штамма, собранного генно-инженерным путем, удалось повысить. Из этого следует, что холодоустойчивость вирусов является фенотипическим признаком, степень проявления которого зависит от температурных условий культивирования вируса. При конструировании реассортантов методами обратной генетики отсутствует необходимый селективный фактор — пониженная температура инкубации. Чтобы холодоустойчивый фенотип реализовался в полной мере, необходимо дополнительное культивирование генно-инженерных реассортантов при пониженной температуре. Таким образом, метод обратной генетики с использованием плазмидной технологии дает возможность эффективной подготовки реассортантных штаммов для живой гриппозной вакцины. Важным этапом получения вакцинных штаммов с помощью генно-инженерных приемов должен быть контроль их холодоадаптированного фенотипа и, при необходимости, оптимизация холодоустойчивого фенотипа дополнительными пассажами при пониженной температуре.