The aim of the study was to determine the taxonomic status of a group consisting of atypical strains of Acinetobacter baumannii, outline relevant characteristics and methods necessary for their identification. There were examined 10 strains of A. baumannii (6 of them primary comprised) bearing similar profile of atypical features isolated from clinical samples (urine, sputum) in 2017–2019 at the Military Medical Academy. Сlinical strains of typical A. baumannii (n = 36), Acinetobacter nosocomialis (n = 14), Acinetobacter pittii (n = 9) and 1 strain of Acinetobacter calcoaceticus isolated from the external environment were used in comparative studies. Atypical strains had the characteristics of A. calcoaceticus — A. baumannii (ACB) complex bacteria and were identified as A. baumannii. The utilization of substrates as the only carbon source was studied on a dense synthetic medium added with 0.2 % substrate during incubation for 72 hours at 37°C. Carbohydrate oxidation coupled to acid formation was detected on the Hugh–Leifson medium by using a micromethod. Aromatic amino acid biotransformation was carried out in liquid and dense nutrient media assessed in chromogenic reaction. The rpoB gene was used for strain genetic characterization. Amplification of two 940 and 1210 base pair (bp)-long fragments from the rpoB gene was performed by the routine polymerase chain reaction using primers with previously described sequences. Amplification products were sequenced by Sanger using Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, USA) and capillary electrophoresis on an automatic sequencer ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, USA), followed by using methods for determining the similarity levels of sequenced fragments with the rpoB gene sequences of the reference strain A. baumannii ATCC 17978 (GenBank accession no. CP053098.1). It was found that all strains belonging to atypical A. baumannii spp. had a specific set of features that distinguish them from typical strains of A. baumannii as well as other types of the ACB complex: detected biotransformation of L-tryptophan (via anthranilate pathway) and anthranilic acid under unambiguous lack of such signs in other bacteria; lack of utilized sodium hippurate and L-arabinose being unambiguously evident in other bacteria; lack of utilized L-tryptophan, putrescine, L-ornithine being utilized in the majority of strains of belonging to other bacterial species. Genetic analysis showed that the control strains of typical A. baumannii displayed 99.20–99.21% similarity within the sequenced fragments of the rpoB gene with those from the rpoB gene of the reference strain. All 10 strains of atypical A. baumannii had similar features (99.20–99.21%). At the same time, parameters of control strains from other bacterial species significantly differed: A. nosocomialis (95.10–95.97%), A. pittii (94.63–94.92%), A. calcoaceticus (93.00%). Hence, the strains of atypical and typical A. baumannii are genetically homogeneous and belong to the same species. The data presented allow us to consider this group of atypical A. baumannii strains as a new biovar. We propose the name for this new biovar — tryptophandestruens (tryptophan-destroying) stemming from the Latin word destruens — destroying. Identification of A. baumannii bv. tryptophandestruens bacteria can be carried out in laboratory of any level by using tests for L-tryptophan biotransformation as well as sodium hippurate utilization.
Цель исследования — определить таксономический статус группы атипичных штаммов Acinetobacter baumannii, выявить их характеристики и методы, необходимые для идентификации. Объектом исследования были 10 штаммов A. baumannii (из них 6 первичных), имеющих одинаковый профиль атипичных признаков. Они были выделены из клинического материала (моча, мокрота) в 2017–2019 гг. в Военно-медицинской академии. В сравнительных исследованиях использовали клинические штаммы типичных A. baumannii (n = 36), Acinetobacter nosocomialis (n = 14), Acinetobacter pittii (n = 9) и 1 штамм Acinetobacter calcoaceticus, выделенный из внешней среды. Атипичные штаммы обладали признаками бактерий комплекса A. calcoaceticus — A. baumannii (ACB) и были идентифицированы как A. baumannii. Утилизацию субстратов в качестве единственных источников углерода изучали на плотной синтетической среде с 0,2% субстрата при инкубации посевов 72 часа при 37°C. Окисление углеводов с кислотообразованием выявляли на среде Хью–Лейфсона и микрометодом. Биотрансформацию ароматических аминокислот осуществляли в жидких и плотных питательных средах по хромогенной реакции. Для генетической характеристики штаммов использовали ген rpoB. Амплификацию двух фрагментов гена rpoB длиной 940 п. н. и 1210 п. н. проводили методом стандартной полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, имеющих описанные ранее последовательности. Продукты амплификации секвенировали по Сэнгеру с использованием BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, США) и капиллярного электрофореза на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, США) с последующим применением методов определения уровней сходства секвенированных фрагментов с последовательностями гена rpoB референс-штамма A. baumannii ATCC 17978 (GenBank acc. no. CP053098.1). Было установлено, что все штаммы группы атипичных A. baumannii имели специфическую совокупность признаков, отличающих их от типичных штаммов A. baumannii и других видов комплекса АСВ: наличие биотрансформации L-триптофана (антранилатным путем) и антраниловой кислоты при однозначном отсутствии этих признаков у других бактерий; отсутствие утилизации гиппурата натрия и L-арабинозы при однозначном наличии утилизации у других бактерий; отсутствие утилизации L-триптофана, путресцина, L-орнитина при наличии утилизации у большинства штаммов других видов. Генетический анализ показал, что контрольные штаммы типичных A. baumannii имели 99,20–99,21% сходства последовательностей секвенированных фрагментов гена rpoB с последовательностями гена rpoB референсного штамма. Такие же показатели имели все 10 штаммов атипичных A. baumannii (99,20–99,21%). При этом показатели контрольных штаммов других видов достоверно отличались: A. nosocomialis — 95,10–95,97%, A. pittii — 94,63–94,92%, A. calcoaceticus — 93,00%. Следовательно, штаммы атипичных и типичных A. baumannii генетически однородны и принадлежат к одному виду. Представленные факты позволяют считать данную группу атипичых штаммов A. baumannii новым биоваром. Предлагаем название новому биовару: tryptophandestruens (триптофанразрушающий) (лат. destruens — разрушаю щий). Идентификацию бактерий A. baumannii bv. tryptophandestruens можно осуществлять в лабораториях любого уровня тестами на биотрансформацию L-триптофана и утилизацию гиппурата натрия.