Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI166110.15789/2220-7619-MBF-1661ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИMethodological basics for differential detection of EBV1/EBV2 and HHV6A/HHV6BМетодические основы дифференциальной детекции ВЭБ1/ВЭБ2 и ВГЧ6A/ВГЧ6Bhttps://orcid.org/0000-0001-5864-5862PopkovaM. I.ПопковаМ. И.
Russian Federation

Mariia I. Popkova - PhD (Мedicine), Leading Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology, Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology.

603950, Nizhny Novgorod, Malaya Yamskaya str., 71.

Phone: +7 (831) 469-79-46. Fax: +7 (831) 469-79-20.

SPIN: 4485-2459

Попкова Мария Игоревна - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии.

603950, Нижний Новгород, ул. Малая Ямская, 71.

Тел.: 8 (831) 469-79-46. Факс: 8 (831) 469-79-20.

SPIN-код : 4485-2459

popmarig@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7571-525XUtkinO. V.УткинО. В.
Russian Federation

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology, Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology.

Nizhny Novgorod.

SPIN: 1174-6500

Кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией молекулярной биологии и биотехнологии.

Нижний Новгород.

SPIN-код: 1174-6500

utkino2004@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3591-9618SobolevaE. A.СоболеваЕ. А.
Russian Federation

Ifectologist, Assistant Professor, Department of Infectious Diseases, Privolzhsky Research Medical University.

Nizhny Novgorod.

Врач-инфекционист, ассистент кафедры инфекционных болезней.

Нижний Новгород.

Fullofcarrot@pimunn.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3965-2033SakharnovN. A.СахарновН. А.
Russian Federation

Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology, Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology.

Nizhny Novgorod.

SPIN:8457-3501

Научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии.

Нижний Новгород.

SPIN-код:8457-3501

saharnov@nniiem.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6663-8440BryzgalovaD. A.БрызгаловаД. А.
Russian Federation

Junior Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology, Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology.

Nizhny Novgorod.

SPIN: 5626-3491

Младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии.

Нижний Новгород.

SPIN-код: 5626-3491

moskvinadara7@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-2024-4283SenatskaiaA. O.СенатскаяА. О.
Russian Federation

Junior Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology, Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology.

Nizhny Novgorod.

SPIN: 6891-2140

Младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии.

Нижний Новгород.

SPIN-код: 6891-2140

seanna@bk.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5207-1164KulovaE. A.КуловаЕ. А.
Russian Federation

PhD (Medicine), Assistant Professor, Department of Infectious Diseases, Privolzhsky Research Medical University.

Nizhny Novgorod.

SPIN: 4331-6958

Кандидат медицинских наук, доцент кафедры инфекционных болезней.

Нижний Новгород.

SPIN-код: 4331-6958

dr_kulova@mail.ruAcademician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and MicrobiologyНижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. БлохинойPrivolzhsky Research Medical UniversityПриволжский исследовательский медицинский университет Минздрава России05012022116105710662812202030052021Copyright ©; 2021, Popkova M.I., Utkin O.V., Soboleva E.A., Sakharnov N.A., Bryzgalova D.A., Senatskaia A.O., Kulova E.A.Copyright ©; 2021, Попкова М.И., Уткин О.В., Соболева Е.А., Сахарнов Н.А., Брызгалова Д.А., Сенатская А.О., Кулова Е.А.2021Popkova M.I., Utkin O.V., Soboleva E.A., Sakharnov N.A., Bryzgalova D.A., Senatskaia A.O., Kulova E.A.Попкова М.И., Уткин О.В., Соболева Е.А., Сахарнов Н.А., Брызгалова Д.А., Сенатская А.О., Кулова Е.А.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/1661

Among a whole variety of EBV- and HHV6-linked diseases only infectious mononucleosis is subject to official statistical reporting in Russia that substantially complicates objective assessment of etiological structure, incidence rate, characteristics of developing epidemic process. Currently, the data on the genetic EBV heterogeneity, even at the level of the main types (EBV1 and EBV2), as well as HHV6A and HHV6B, prevalence and clinical importance are mainly limited to foreign research publications. Few publications assessing this issue are available in Russian scientific papers. At the same time, examining circulation of virus genetic types (variants) and use of such data in implementing epidemiological surveillance after some other infections have been commonly practiced. One of the key issues is the level of developed laboratory support for molecular genetic monitoring. The goal of the study was to improve methodological basics for differential detection of HHV6A/B and the major EBV types. There were used samples of peripheral blood leukocytes collected from children aged 1–15 years with acute (n = 50) and asymptomatic infectious mononucleosis (n = 29). The detection and quantification of EBV and HHV6 DNA was performed by using real-time PCR. For differential determination of EBV1/EBV2 and HHV6A/HHV6B, an optimized one-round PCR with electrophoretic agarose gel detection amplification products was used. The data from our own study showed that frequency of detected EBV and HHV6 DNA in acute infectious mononucleosis patients comprised 74 and 72% compared to control group reaching 35 and 74%, respectively. It was found that among the examined children of Nizhny Novgorod Region, EBV1 and HHV6B prevailed in the viral population that agrees with existing insights about their geographical distribution in the adjacent territories. EBV2 was found in a single sample only in the control group. HHV6A was not detected in any of the groups. The methodological approach optimized in this study allows to separately detect HHV6A/HHV6B and the main EBV types according to a unified laboratory protocol, whereas combining it with additional stage of DNA enrichment increases the diagnostic sensitivity of PCR analysis, minimizes proportion of discordant and false negative results. Such an integrated approach can be applied for diagnostic, epidemiological and research purposes.

В России из всего многообразия заболеваний ВЭБ- и ВГЧ6-этиологии официальной статистической отчетности подлежит только инфекционный мононуклеоз, что существенно затрудняет объективную оценку этиологической структуры, уровня заболеваемости, характеристики развития эпидемического процесса. В настоящее время сведения о генетической неоднородности ВЭБ, даже на уровне основных типов (ВЭБ1 и ВЭБ2), а также ВГЧ6А и ВГЧ6В, их распространенности и клиническом значении ограничиваются главным образом зарубежными данными. В России встречаются единичные публикации, посвященные данному вопросу. В то же время изучение циркуляции генетических типов (вариантов) и использование этой информации при осуществлении эпидемиологического надзора за некоторыми другими инфекциями уже вошло в повседневную практику. Одной из ключевых проблем является уровень развития лабораторного обеспечения молекулярно-генетического мониторинга. Цель данной работы — совершенствование методической базы дифференциальной детекции ВГЧ6А/B и основных типов ВЭБ. Материалом исследования послужили лейкоциты периферической крови детей в возрасте 1–15 лет с острым инфекционным мононуклеозом (n = 50) и с отсутствием клинических симптомов данного заболевания (n = 29). Выявление и количественное определение ДНК ВЭБ и ДНК ВГЧ6 выполняли с помощью метода ПЦР в реальном времени. Для дифференциального определения ВЭБ1/ВЭБ2 и ВГЧ6А/ВГЧ6В в работе применялся оптимизированный однораундовый вариант ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле. По результатам исследований частота выявления ДНК ВЭБ и ДНК ВГЧ6 при остром инфекционном мононуклеозе составила 74 и 72%, а в контрольной группе — 35 и 74% соответственно. Установлено, что у обследованных детей Нижегородского региона в вирусной популяции преобладают ВЭБ1 и ВГЧ6В, что согласуется с существующими представлениями об их географическом распределении на прилегающих территориях. ВЭБ2 был обнаружен в единственном образце только в контрольной группе. ВГЧ6А ни в одной из исследуемых групп выявлен не был. Оптимизированный в данной работе методический подход позволяет раздельно детектировать ВЭБ1/ВЭБ2 и ВГЧ6А/ВГЧ6В по единому лабораторному протоколу, а в сочетании с дополнительным этапом концентрирования ДНК повышает диагностическую чувствительность ПЦР-анализа, минимизирует долю дискордантных и ложноотрицательных результатов. Такой комплексный подход может применяться в диагностических, эпидемиологических и научно-исследовательских целях.

EBV1EBV2HHV6AHHV6Bviral loadPCRgenotypingdifferential detectionВЭБ1ВЭБ2ВГЧ6АВГЧ6Ввирусная нагрузкаПЦРгенотипированиедифференциальная детекция1. Гончарова Е.В., Сенюта Н.Б., Смирнова К.В., Щербак Л.Н., Гурцевич В.Э. Вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ) в России: инфицированность населения и анализ вариантов гена LMP1 у больных ВЭБ-ассоциированными патологиями и здоровых лиц // Вопросы вирусологии. 2015. Т. 60, № 2. С. 11–17.2. Гурцевич В.Э., Смирнова К.В., Ботезату И.В., Душенькина Т.Е., Лубенская А.К., Дубар Э., Сенюта Н.Б., Лихтенштейн А.В., Петров С.В. Полиморфизм онкогена LMP1 вируса Эпштейна–Барр в двух этнических группах россии, татар и славян, и его влияние на развитие некоторых злокачественных опухолей // Инфекция и иммунитет. 2020. Т. 10, № 2. C. 347–358. doi: 10.15789/2220-7619-EBV-11623. Львов Н.Д., Дудукина Е.А. Ключевые вопросы диагностики Эпштейна–Барр вирусной инфекции // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2013. № 3. С. 24–32.4. Мелехина Е.В., Домонова Э.А., Гоптарь И.А., Шипулина О.Ю., Горелов А.В. Первый в России случай наследственной передачи хромосомно-интегрированного вируса герпеса человека 6В (Human betaherpesvirus 6B) // Вопросы практической педиатрии. 2019. Т. 14, № 1. C. 33–40. doi: 10.20953/1817-7646-2019-1-33-405. Мелехина Е.В., Музыка А.Д., Калугина М.Ю., Горелов А.В., Чугунова О.Л. Современные представления об инфекции, вызванной вирусом герпеса человека 6 типа // Архивъ внутренней медицины. 2016. Т. 6, № 1. C. 13–19. doi: 10.20514/2226-6704-2016-6-1-13-196. Никольский М.А., Вязовая А.А., Ведерников В.Е., Нарвская О.В., Лиознов Д.А., Смирнова Н.Н., Полунина А.В., Бурмистрова А.Г., Золотова М.А. Молекулярно-биологическая характеристика вируса герпеса человека 6-го типа у пациентов с различными вариантами течения заболевания // Педиатрия. 2019. Т. 98, № 1. С. 53–56. doi: 10.24110/0031-403X-2019-98-1-53-567. О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2018 году: государственный доклад. М.: Роспотребнадзор, 2019. 254 с.8. Смирнова К.В., Дидук С.В., Гурцевич В.Э. Полиморфизм онкогена LMP1 вируса Эпштейна–Барр у представителей коренного малочисленного народа Дальнего Востока России // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2017. Т. 22, № 5. С. 239–247. doi: 10.18821/1560-9529-2017-22-5-239-2479. Соломай Т.В. Динамика заболеваемости и территориальное распространение инфекционного мононуклеоза // Здравоохранение Российской Федерации. 2019. Т. 63, № 4. C. 186–192. doi: 10.18821/0044-197Х-2019-63-4-186-19210. Тимченко В.Н., Баннова С.Л., Павлова Н.В., Павлова Е.Б., Каплина Т.А., Федорова А.В., Булина О.В., Балашов А.Л., Хакизимана Ж.-К. ВЭБ-мононуклеоз на госпитальном этапе: клиническая характеристика и этиотропная терапия у детей различного возраста // Педиатр. 2018. Т. 9, № 6. С. 77–82.11. Хакизимана Ж.К., Тимченко В.Н., Шакмаева М.А., Каплина Т.А., Субботина М.Д., Баннова С.Л., Федорова А.В., Суховецкая В.Ф., Павлова Е.Б., Павлов Н.В. ВЭБ-мононуклеоз у детей в современных условиях // Детские инфекции. 2020. Т. 19, № 2. C. 23–28. doi: 10.22627/2072-8107-2020-19-2-23-2812. Хафизов К.Ф., Сперанская А.С., Мацвай А.Д., Шипулин Г.А., Дедков В.Г. Передовые технологии в диагностике вирусных заболеваний неясной этиологии // Инфекция и иммунитет. 2020. Т. 10, № 1. C. 9–25. doi: 10.15789/2220-7619-ATI-82413. Шарипова Е.В., Бабаченко И.В. Герпесвирусные инфекции и инфекционный мононуклеоз (обзор литературы) // Журнал инфектологии. 2013. Т. 5, № 2. C. 5–12. doi: 10.22625/2072-6732-2013-5-2-14. Ablashi D., Agut H., Alvarez-Lafuente R., Clark D.A., Dewhurst S., DiLuca D., Flamand L., Frenkel N., Gallo R., Gompels U.A., Höllsberg P., Jacobson S., Luppi M., Lusso P., Malnati M., Medveczky P., Mori Y., Pellett P.E., Pritchett J.C., Yamanishi K., Yoshikawa T. Classification of HHV-6A and HHV-6B as distinct viruses. Arch. Virol., 2014, vol. 159, pp. 863–870. doi: 10.1007/s00705-013-1902-515. Adams M.J., Carstens E.B. Ratification vote on taxonomic proposals to the International Committee on Taxonomy of Viruses. Arch. Virol., 2012, vol. 157, no. 7, pp. 1411–1422. doi: 10.1007/s00705-012-1299-616. Babcock G.J., Decker L.L., Volk M., Thorley-Lawson D.A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity, 1998, vol. 9, no. 3, pp. 395–404. doi: 10.1016/s1074-7613(00)80622-617. Bhatia K., Raj A., Guitierrez M.I., Judde J.G., Spangler G., Venkatesh H., Magrath I.T. Variation in the sequence of Epstein–Barr virus nuclear antigen 1 in normal peripheral blood lymphocytes and in Burkitt’s lymphomas. Oncogene, 1996, vol. 13, pp. 177–181.18. Dambaugh T., Hennessy K., Chamnankit L., Kieff E. U2 region of Epstein–Barr virus DNA may encode Epstein–Barr nuclear antigen 2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, pp. 7632–7636. doi: 10.1073/pnas.81.23.763219. Edwards R.H., Seillier-Moiseiwitsch F., Raab-Traub N. Signature amino acid changes in latent membrane protein 1 distinguish Epstein–Barr virus strains. Virology, 1999, vol. 261, pp. 79–95. doi: 10.1006/viro.1999.985520. Eliassen E., Lum E., Pritchett J., Ongradi J., Krueger G., Crawford J.R., Phan T.L., Ablashi D., Hudnall S.D. Human Herpesvirus 6 and malignancy: a review. Front. Oncol., 2018, vol. 8: 512. doi: 10.3389/fonc.2018.0051221. Fafi-Kremer S., Brengel-Pesce K., Barguès G., Bourgeat M.J., Genoulaz O., Seigneurin J.M., Morand P. Assessment of automated DNA extraction coupled with real-time PCR for measuring Epstein–Barr virus load in whole blood, peripheral mononuclear cells and plasma. J. Clin. Virol., 2004, vol. 30, no. 2, pp. 157–164. doi: 10.1016/j.jcv.2003.10.00222. Greninger A.L., Roychoudhury P., Makhsous N., Hanson D., Chase J., Krueger G., Xie H., Huang M.-L., Saunders L., Ablashi D., Koelle D.M., Cook L., Jerome K.R. Copy number heterogeneity, large origin tandem repeats, and interspecies recombination in human herpesvirus 6A (HHV-6A) and HHV-6B reference strains. J. Virol., 2018, vol. 92, no. 10: e00135-18. doi: 10.1128/JVI.00135-1823. Hu L.F., Zabarovsky E.R., Chen F., Cao S.L., Ernberg I. Isolation and sequencing of the Epstein–Barr virus BNLF-1 gene (LMP1) from a Chinese nasopharyngeal carcinoma. J. Gen. Virol., 1991, vol. 72, pp. 2399–2409. doi: 10.1099/0022-1317-72-10-239924. Hudnall S.D., Chen T., Allison P., Tyring S.K., Heath A. Herpesvirus prevalence and viral load in healthy blood donors by quantitative real-time polymerase chain reaction. Transfusion, 2008, vol. 48, no. 6, pp. 1180–1187. doi: 10.1111/j.1537-2995.2008.01685.x25. Kanda Т., Yajima М., Ikuta К. Epstein–Barr virus strain variation and cancer. Cancer Sci., 2019, vol. 110, no. 4, pp. 1132–1139. doi: 10.1111/cas.1395426. Kondo K., Kondo T., Okuno T., Takahashi M., Yamanishi K. Latent human herpesvirus 6 infection of human monocytes/macrophages. J. Gen. Virol., 1991, vol. 72, no. 6, pp. 1401–1408. doi: 10.1099/0022-1317-72-6-140127. Mendes T.M., Oliveira L.C., Yamamoto L., Del Negro G.M., Okay T.S. Epstein–Barr virus nuclear antigen-2 detection and typing in immunocompromised children correlated with lymphoproliferative disorder biopsy findings. Braz. J. Infect. Dis., 2008, vol. 12, no. 3, pp. 186–191. doi: 10.1590/s1413-8670200800030000528. Monteiro T.A.F., Costa I.B., Costa I.B., Corrêa T.L.D.S., Coelho B.M.R., Silva A.E.S., Ramos F.L.P., Filh A.J.M., Monteiro J.L.F., Siqueira J.A.M., Gabbay Y.B., Sousa R.C.M. Genotypes of Epstein–Barr virus (EBV1/EBV2) in individuals with infectious mononucleosis in the metropolitan area of Belém, Brazil, between 2005 and 2016. Braz. J. Infect. Dis., 2020, vol. 24, no. 4, pp. 322–329. doi: 10.1016/j.bjid.2020.06.00429. Packham G., Brimmell M., Cook D., Sinclair A.J., Farrell P.J. Strain variation in Epstein–Barr virus immediate early genes. Virology, 1993, vol. 192, no. 2, pp. 541–550. doi: 10.1006/viro.1993.107030. Reddy S., Manna P. Quantitative detection and differentiation of human herpesvirus 6 subtypes in bone marrow transplant patients by using a single real-time polymerase chain reaction assay. Biol. Blood Marrow Transplant., 2005, vol. 11, pp. 530–541. doi: 10.1016/j.bbmt.2005.04.01031. Smatti M.K., Yassine H.M., Abu Odeh R., Al Marawani A., Taleb S.A., Althani A.A., Nasrallah G.K. Prevalence and molecular profiling of Epstein–Barr virus (EBV) among healthy blood donors from different nationalities in Qatar. PLoS One, 2017, vol. 12, no. 12: e0189033. doi: 10.1371/journal.pone.018903332. Traore L., Tao I., Bisseye C., Diarra B., Compaore T.R., Nebie Y., Assih M., Ouedraogo A., Zohoncon T., Djigma F., Ouermi D., Barro N., Sanou M., Ouedraogo R.T., Simpore J. Molecular diagnosis of cytomegalovirus, Epstein–Barr virus and herpes virus 6 among blood donors in Ouagadougou, Burkina Faso. BMC Infectious Diseases, 2014, vol. 14, no. 2: P99. doi: 10.1186/1471-2334-14-s2-p9933. Tzellos S., Farrell P.J. Epstein–Barr virus sequence variation-biology and disease. Pathogens, 2012, vol. 1, no. 2, pp. 156–174. doi: 10.3390/pathogens102015634. Walling D.M., Shebib N., Weaver S.C., Nichols C.M., Flaitz C.M., Webster-Cyriaque J. The molecular epidemiology and evolution of Epstein–Barr virus: Sequence variation and genetic recombination in the latent membrane protein-1 gene. J. Infect. Dis., 1999, vol. 179, pp. 763–774. doi: 10.1086/31467235. Yalcin S., Karpuzglu T., Suleymanlar G., Mutlu G., Mukai T., Yamamoto T., Isegawa Y., Yamanishi K. Human herpesvirus 6 and human herpesvirus 7 infections in renal transplant recipients and healthy adults in Turkey. Arch. Virol., 1994, vol. 136, pp. 183– 190. doi: 10.1007/BF0153882736. Zimber U., Adldinger H.K., Lenoir G.M., Vuillaume M., Knebel-Doeberitz M.V., Laux G., Desgranges C., Wittmann P., Freese U.K., Schneider U., Bornkamm G.W. Geographical prevalence of two types of Epstein–Barr virus. Virology, 1986, vol. 154, pp. 56–66. doi: 10.1016/0042-6822(86)90429-0