Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI1562410.15789/2220-7619-DSA-15624ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИResearch ArticleDesigning structure and E. coli strain-producer bearing SARS-CoV-2 N, S, M, E protein-related sequence antigenРазработка структуры и штамма-продуцента E. coli для антигена, содержащего последовательности белков N, S, M, E коронавируса SARS-CоV-2https://orcid.org/0000-0002-6573-6743KopatVladimir V.КопатьВладимир Владиславович
Russian Federation

Development Director

директор по развитию

kopat@service-gene.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9973-0753RiabchenkovaAnastasia A.РябченковаАнастасия Андреевна
Russian Federation

Researcher

научный сотрудник

riabchenkova@service-gene.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9167-5000ChirakEvgenii L.ЧиракЕвгений Леонидович
Russian Federation

Researcher

научный сотрудник

chirak.evgenii@service-gene.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1610-8935ChirakElizaveta R.ЧиракЕлизавета Романовна
Russian Federation

Researcher

научный сотрудник

chirak.elizaveta@service-gene.ruhttps://orcid.org/0009-0003-1059-1991SaenkoAnna I.СаенкоАнна Игоревна
Russian Federation

Chief Process Engineer

главный технолог

anna.saenko@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-4672-6208KolmakovNikolai N.КолмаковНиколай Николаевич
Russian Federation

Researcher, Department of Molecular Genetics

научный сотрудник отдела молекулярной генетики

kolmakov@service-gene.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8228-4240SimbirtsevAndrey S.СимбирцевАндрей Семенович
Russian Federation

RAS Corresponding Member, DSc (Medicine), Professor, Head of the Laboratory of Medical Biotechnology

член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией медицинской биотехнологии

simbas@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5268-9802DukhovlinovIlya V.ДуховлиновИлья Владимирович
Russian Federation

PhD (Biology), Director of Science

кандидат биологических наук , директор по науке

atg@service-gene.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4571-8799TotolianAreg A.ТотолянАрег Артемович
Russian Federation

RAS Full Member, DSc (Medicine), Professor, Director

академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор

totolian@spbraaci.ruLLC “ATG Service Gene”ООО «АТГ Сервис Ген»Institute of Experimental MedicineФГБНУ Институт экспериментальной медициныSaint Petersburg Pasteur InstituteФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера17082023241020231346536621108202313082023Copyright ©; 2023, Kopat V.V., Riabchenkova A.A., Chirak E.L., Chirak E.R., Saenko A.I., Kolmakov N.N., Simbirtsev A.S., Dukhovlinov I.V., Totolian A.A.Copyright ©; 2023, Копать В.В., Рябченкова А.А., Чирак Е.Л., Чирак Е.Р., Саенко А.И., Колмаков Н.Н., Симбирцев А.С., Духовлинов И.В., Тотолян А.А.2023Kopat V.V., Riabchenkova A.A., Chirak E.L., Chirak E.R., Saenko A.I., Kolmakov N.N., Simbirtsev A.S., Dukhovlinov I.V., Totolian A.A.Копать В.В., Рябченкова А.А., Чирак Е.Л., Чирак Е.Р., Саенко А.И., Колмаков Н.Н., Симбирцев А.С., Духовлинов И.В., Тотолян А.А.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/15624

T-cell immune response is extremely important in protecting human body from diverse viral infections. It is known that it can ensure viral clearance and complete recovery in patients with humoral immunodeficiency. COVID-19 patients were found to have T-cell response primarily directed against SARS-CoV-2 structural S, M, N, E proteins, with nucleocapsid protein being most conserved. To assess patients’ immunity against coronavirus infection and evaluate an effectiveness of vaccine candidates, it is necessary to develop an optimal diagnostic antigen to evaluate arising T-cell response against SARS-CoV-2 antigenic determinants. A diagnostic test to determine host specific susceptibility to SARS-CoV-2 infection should target conserved regions of global SARS-CoV-2 variants. The study was aimed to develop a structure of an antigen bearing conserved and immunogenic sequences derived from SARS-CoV-2 structural proteins and to obtain an Escherichia coli producer strain containing a recombinant protein to be subsequently used for assessing antiviral T-cell immunity. Developing of the antigen was performed in silico: TepiTool and NetMHCIIpan were used to predict and identify high affinity epitopes spanning SARS-CoV-2 E, M, N, S proteins and MHC II binding. Several variants of recombinant antigen proteins were constructed, from which one was selected based on its physicochemical properties: isoelectric point, hydrophobicity index and aliphatic index, as well as 3D representation built by using the I-TASSER. The sequence was synthesized and cloned into the pET24a(+) vector. The resulting plasmid pCorD_PS was transformed into E. coli DH5α followed by Rosetta (DE3). The strain-producer of the recombinant E. coli protein CorD_PS was assessed for the presence and stability of IPTG-induced antigen protein expression and elimination of recombinant coronavirus antigen-bearing plasmid. Based on the study data, an antigen was developed consisting of conserved regions from SARS-CoV-2 S, M, N, E proteins. A 53 kDa recombinant protein was predicted to be stable in aqueous solutions with isoelectric point of 9.56 potentially allowing to simplify protein purification from E. coli cells. Plasmid DNA pCorD_PS (6695 bp) encoding final recombinant coronavirus antigen cloned into pET24a(+) vector was obtained. A stable, productive E. coli CorD_PS strain was obtained. The obtained strain-producer resulting in recombinant E. coli CorD_PS antigen is stable allowing to move on to design antigen purification technique and further develop SARS-CoV-2-specific diagnostic test system.

Т-клеточный иммунный ответ крайне важен при защите организма человека от многих вирусных инфекций. Известно, что он может обеспечить вирусный клиренс и полное выздоровление у пациентов с гуморальным иммунодефицитом. У пациентов с COVID-19 Т-клеточный ответ направлен в основном на структурные белки вируса S, M, N, E, из которых наиболее консервативным является белок нуклеокапсида. Для оценки иммунитета пациентов в отношении коронавирусной инфекции и определения эффективности вакцинных кандидатов необходима разработка оптимального диагностического антигена, используемого для оценки формирования Т-клеточной реакции против антигенных детерминант SARS-CoV-2. Диагностический тест для определения специфической чувствительности организма к инфекции, вызываемой SARS-CoV-2, должен быть нацелен на консервативные регионы глобальных вариантов SARS-CoV-2. Целью работы была разработка структуры антигена, содержащего консервативные и иммуногенные последовательности структурных белков коронавируса SARS-CoV-2, и получение штамма Escherichia coli — продуцента рекомбинантного белка для последующего использования белка в качестве антигена для оценки Т-клеточного противовирусного иммунитета. Создание последовательности антигена проводили in silico: TepiTool и NetMHCIIpan использовали для прогнозирования и идентификации высокоаффинных эпитопов, охватывающих белки E, M, N, S SARS-CoV-2 и связывающих MHC II. Было сконструировано несколько вариантов рекомбинантных белков-антигенов, из которых выбрали один на основании его физико-химических свойств: изоэлектрической точки, индекса гидрофобности и алифатического индекса, построенной с помощью I-TASSER 3D модели. Последовательность синтезировали и клонировали в вектор pET24a(+). Полученной плазмидой pCorD_PS последовательно трансформировали штаммы E. coli DH5α, затем Rosetta (DE3). Штамм-продуцент рекомбинантного белка E. coli CorD_PS проверяли на наличие и стабильность экспрессии белка-антигена индукцией ИПТГ, также оценивали элиминирование плазмиды, кодирующей синтез рекомбинантного коронавирусного антигена. В результате разработан антиген, включающий в себя консервативные участки белков S, M, N, E коронавируса SARS-CoV-2, на которые может формироваться Т-клеточный иммунный ответ. Для белка массой 53 kDa предсказана стабильность в водных растворах и изоэлектрическая точка 9,56, что потенциально позволит упростить процесс очистки белка от нативных белков E. coli. Получена плазмидная ДНК pCorD_PS (6695 п.о.), кодирующая клонированный в вектор pET24a(+) синтезированный антиген коронавирусный рекомбинантный. Получен стабильный, продуктивный по коронавирусному рекомбинантному антигену, штамм-продуцент E. coli CorD_PS. Полученный штамм — продуцент рекомбинантного антигена E. coli CorD_PS стабилен, что позволяет перейти к созданию методики очистки антигена и последующей разработке диагностической тест-системы.

SARS-CoV-2COVID-19T cellsCD4+ T cellsCD8+ T cellsepitopesHLASARS-CoV-2COVID-19Т-клеткиCD4+ Т-клеткиCD8+ Т-клеткиэпитопыHLAКудрявцев И.В., Головкин А.С., Тотолян А.А. Т-хелперы и их клетки-мишени при COVID-19 // Инфекция и иммунитет. 2022. Т. 12, № 3. C. 409–426. [Kudryavtsev I.V., Golovkin A.S., Totolian A.A. T helper cell subsets and related target cells in acute COVID-19. Russian Journal of Infection and Immunity, 2022, vol. 12, no. 3, pp. 409–426. (In Russ.)] doi: 10.15789/2220-7619-THC-1882Bange E.M., Han N.A., Wileyto P., Kim J.Y., Gouma S., Robinson J., Greenplate A.R., Hwee M.A., Porterfield F., Owoyemi O., Naik K., Zheng C., Galantino M., Weisman A.R., Ittner C.A.G., Kugler E.M., Baxter A.E., Oniyide O., Agyekum R.S., Dunn T.G., Jones T.K., Giannini H.M., Weirick M.E., McAllister C.M., Babady N.E., Kumar A., Widman A.J., DeWolf S., Boutemine S.R., Roberts C., Budzik K.R., Tollett S., Wright C., Perloff T., Sun L., Mathew D., Giles J.R., Oldridge D.A., Wu J.E., Alanio C., Adamski S., Garfall A.L., Vella L.A., Kerr S.J., Cohen J.V., Oyer R.A., Massa R., Maillard I.P., Maxwell K.N., Reilly J.P., Maslak P.G., Vonderheide R.H., Wolchok J.D., Hensley S.E., Wherry E.J., Meyer N.J., DeMichele A.M., Vardhana S.A., Mamtani R., Huang A.C. CD8+ T cells contribute to survival in patients with COVID-19 and hematologic cancer. Nat. Med., 2021, vol. 27, no. 7, pp. 1280–1289. doi: 10.1038/s41591-021-01386-7Boratyn G.M., Thierry-Mieg J., Thierry-Mieg D., Busby B., Madden T.L. Magic-BLAST, an accurate RNA-seq aligner for long and short reads. BMC Bioinformatics, 2019, vol. 20, no. 1, pp. 1–19. doi: 10.1186/s12859-019-2996-xChang C.K., Hou M.H., Chang C.F., Hsiao C.D., Huang T.H. The SARS coronavirus nucleocapsid protein — forms and functions. Antiviral Res., 2014, vol. 103, pp. 39–50. doi: 10.1016/j.antiviral.2013.12.009Chen J., Lau Y.F., Lamirande E.W., Paddock C.D., Bartlett J.H., Zaki S.R., Subbarao K. Cellular immune responses to severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) infection in senescent BALB/c mice: CD4+ T cells are important in control of SARS-CoV infection. J. Virol., 2010, vol. 84, no. 3, pp. 1289–1301. doi: 10.1128/jvi.01281-09DiPiazza A.T., Graham B.S., Ruckwardt T.J. T cell immunity to SARS-CoV-2 following natural infection and vaccination. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2021, vol. 538, pp. 211–217. doi: 10.1016/j.bbrc.2020.10.060Friberg H., Burns L., Woda M., Kalayanarooj S., Endy T.P., Stephens H.A., Green S., Rothman A.L., Mathew A. Memory CD8+ T cells from naturally acquired primary dengue virus infection are highly cross-reactive. Immunol. Cell Biol., 2011, vol. 89, no. 1, pp. 122–129. doi: 10.1038/icb.2010.61Gordon D.E., Jang G.M., Bouhaddou M., Xu J., Obernier K., White K.M., O’Meara M.J., Rezelj V.V., Guo J.Z., Swaney D.L., Tummino T.A., Hüttenhain R., Kaake R.M., Richards A.L., Tutuncuoglu B., Foussard H., Batra J., Haas K., Modak M., Kim M., Haas P., Polacco B.J., Braberg H., Fabius J.M., Eckhardt M., Soucheray M., Bennett M.J., Cakir M., McGregor M.J., Li Q., Meyer B., Roesch F., Vallet T., Mac Kain A., Miorin L., Moreno E., Naing Z.Z.C., Zhou Y., Peng S., Shi Y., Zhang Z., Shen W., Kirby I.T., Melnyk J.E., Chorba J.S., Lou K., Dai S.A., Barrio-Hernandez I., Memon D., Hernandez-Armenta C., Lyu J., Mathy C.J.P., Perica T., Pilla K.B., Ganesan S.J., Saltzberg D.J., Rakesh R., Liu X., Rosenthal S.B., Calviello L., Venkataramanan S., Liboy-Lugo J., Lin Y., Huang X.P., Liu Y., Wankowicz S.A., Bohn M., Safari M., Ugur F.S., Koh C., Savar N.S., Tran Q.D., Shengjuler D., Fletcher S.J., O’Neal M.C., Cai Y., Chang J.C.J., Broadhurst D.J., Klippsten S., Sharp P.P., Wenzell N.A., Kuzuoglu-Ozturk D., Wang H.Y., Trenker R., Young J.M., Cavero D.A., Hiatt J., Roth T.L., Rathore U., Subramanian A., Noack J., Hubert M., Stroud R.M., Frankel A.D., Rosenberg O.S., Verba K.A., Agard D.A., Ott M., Emerman M., Jura N., von Zastrow M., Verdin E., Ashworth A., Schwartz O., d’Enfert C., Mukherjee S., Jacobson M., Malik H.S., Fujimori D.G., Ideker T., Craik C.S., Floor S.N., Fraser J.S., Gross J.D., Sali A., Roth B.L., Ruggero D., Taunton J., Kortemme T., Beltrao P., Vignuzzi M., García-Sastre A., Shokat K.M., Shoichet B.K., Krogan N.J. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature, 2020, vol. 583, no. 7816, pp. 459–468. doi: 10.1038/s41586-020-2286-9Grifoni A., Weiskopf D., Ramirez S.I., Mateus J., Dan J.M., Moderbacher C.R., Rawlings S.A., Sutherland A., Premkumar L., Jadi R.S., Marrama D., de Silva A.M., Frazier A., Carlin A.F., Greenbaum J.A., Peters B., Krammer F., Smith D.M., Crotty S., Sette A. Targets of T cell responses to SARS-CoV-2 coronavirus in humans with COVID-19 disease and unexposed individuals. Cell, 2020, vol. 181, no. 7, pp. 1489–1501. doi: 10.1016/j.cell.2020.05.015Gupta S., Su H., Narsai T., Agrawal S. SARS-CoV-2-associated T-cell responses in the presence of humoral immunodeficiency. Int. Arch. Allergy Immunol., 2021, vol. 182, no. 3, pp. 195–209. doi: 10.1159/000514193Huang S., He Q., Zhou L. T cell responses in respiratory viral infections and chronic obstructive pulmonary disease. Chin. Med. J. (Engl.), 2021, vol. 134, no. 13, pp. 1522–1534. doi: 10.1097/CM9.0000000000001388Ikai A. Thermostability and aliphatic index of globular proteins. J. Biochem., 1980, vol. 88, no. 6, pp. 1895–1898. doi: 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a133168Kozlowski L.P. IPC — isoelectric point calculator. Biology Direct, 2016, vol. 11, no. 1, pp. 1–16. doi: 10.1186/s13062-016-0159-9Kudryavtsev I.V., Arsentieva N.A., Batsunov O.K., Korobova Z.R., Khamitova I.V., Isakov D.V., Kuznetsova R.N., Rubinstein A.A., Stanevich O.V., Lebedeva A.A., Vorobyov E.A., Vorobyova S.V., Kulikov A.N., Sharapova M.A., Pevtcov D.E., Totolian A.A. Alterations in B cell and follicular T-helper cell subsets in patients with acute COVID-19 and COVID-19 convalescents. Curr. Issues Mol. Biol., 2021, vol. 44, no. 1, pp. 194–205. doi: 10.3390/cimb44010014Kudryavtsev I.V., Arsentieva N.A., Korobova Z.R., Isakov D.V., Rubinstein A.A., Batsunov O.K., Khamitova I.V., Kuznetsova R.N., Savin T.V., Akisheva T.V., Stanevich O.V., Lebedeva A.A., Vorobyov E.A., Vorobyova S.V., Kulikov A.N., Sharapova M.A., Pevtsov D.E., Totolian A.A. Heterogenous CD8+ T cell maturation and ‘polarization’ in acute and convalescent COVID-19 patients. Viruses, 2022, vol. 14, no. 9: 1906. doi: 10.3390/v14091906Kyte J., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol., 1982, vol. 157, no. 1, pp. 105–132. doi: 10.1016/0022-2836(82)90515-0Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 227, no. 5259, pp. 680–685. doi: 10.1038/227680a0Lan L., Xu D., Ye G., Xia C., Wang S., Li Y., Xu H. Positive RT-PCR test results in patients recovered from COVID-19. JAMA, 2020, vol. 323, no. 15, pp. 1502–1503. doi: 10.1001/jama.2020.2783Le Bert N., Tan A.T., Kunasegaran K., Tham CYL, Hafezi M., Chia A., Chng MHY, Lin M., Tan N., Linster M., Chia W.N., Chen M.I., Wang L.F., Ooi E.E., Kalimuddin S., Tambyah P.A., Low J.G., Tan Y.J., Bertoletti A.. SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS, and uninfected controls. Nature, 2020, vol. 584, no. 7821, pp. 457–462. doi: 10.1038/s41586-020-2550-zMatchett W.E., Joag V., Stolley J.M., Shepherd F.K., Quarnstrom C.F., Mickelson C.K., Wijeyesinghe S., Soerens A.G., Becker S., Thiede J.M., Weyu E., O’Flanagan S., Walter J.A., Vu M.N., Menachery V.D., Bold T.D., Vezys V., Jenkins M.K., Langlois R.A., Masopust D. Nucleocapsid vaccine elicits spike-independent SARS-CoV-2 protective immunity. J. Immunol., 2021, vol. 207, no. 2, pp. 376–379. doi: 10.4049/jimmunol.2100421Meckiff B.J., Ramírez-Suástegui C., Fajardo V., Chee S.J., Kusnadi A., Simon H., Eschweiler S., Grifoni A., Pelosi E., Weiskopf D., Sette A., Ay F., Seumois G., Ottensmeier C.H., Vijayanand P. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4+ T cells in COVID-19. Cell, 2020, vol. 183, no. 5, pp. 1340–1353. doi: 10.1016/j.cell.2020.10.001Moss P. The T cell immune response against SARS-CoV-2. Nat. Immunol., 2022, vol. 23, no. 2, pp. 186–193. doi: 10.1038/s41590-021-01122-wO Murchu E., Byrne P., Carty P.G., De Gascun C., Keogan M., O’Neill M., Harrington P., Ryan M. Quantifying the risk of SARS-CoV-2 reinfection over time. Rev. Med. Virol., 2022, vol. 32, no. 1: e2260. doi: 10.1002/rmv.2260Paul S., Sidney J., Sette A., Peters B. TepiTool: a pipeline for computational prediction of T cell epitope candidates. Curr. Protoc. Immunol., 2016, vol. 114, no. 1, pp. 18.19.1–18.19.24. doi: 10.1002/cpim.12Qiu C., Xiao C., Wang Z., Zhu G., Mao L., Chen X., Gao L., Deng J., Su J., Su H., Fang E.F., Zhang Z.J., Zhang J., Xie C., Yuan J., Luo O.J., Huang L.A., Wang P., Chen G. CD8+ T-cell epitope variations suggest a potential antigen HLA-A2 binding deficiency for spike protein of SARS-CoV-2. Front. Immunol., 2022, vol. 12: 764949. doi: 10.3389/fimmu.2021.764949Ramachandran Gn., Ramakrishnan C., Sasisekharan V. Stereochemistry of polypeptide chain configurations. J. Mol. Biol, 1963, vol. 7, pp. 95–99. doi: 10.1016/s0022-2836(63)80023-6Reynisson B., Barra C., Kaabinejadian S., Hildebrand W.H., Peters B., Nielsen M. Improved prediction of MHC II antigen presentation through integration and motif deconvolution of mass spectrometry MHC eluted ligand data. J. Proteome Res., 2020, vol. 19, no. 6, pp. 2304–2315. doi: 10.1021/acs.jproteome.9b00874Sauer K., Harris T. An effective COVID-19 vaccine needs to engage T cells. Front. Immunol., 2020, vol. 11: 581807. doi: 10.3389/fimmu.2020.581807Sette A., Sidney J. Nine major HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and-B polymorphism. Immunogenetics, 1999, vol. 50, no. 3–4, pp. 201–212. doi: 10.1007/s002510050594Smith-Garvin J.E., Koretzky G.A., Jordan M.S. T cell activation. Ann. Rev. Immunol., 2009, vol. 27, pp. 591–619. doi: 10.1146/annurev.immunol.021908.132706Springer I., Besser H., Tickotsky-Moskovitz N., Dvorkin S., Louzoun Y. Prediction of specific TCR-peptide binding from large dictionaries of TCR-peptide pairs. Front. Immunol., 2020, vol. 11: 1803. doi: 10.3389/fimmu.2020.01803Steiner S., Schwarz T., Corman V.M., Sotzny F., Bauer S., Drosten C., Volk H.D., Scheibenbogen C., Hanitsch L.G. Reactive T cells in convalescent COVID-19 patients with negative SARS-CoV-2 antibody serology. Front. Immunol., 2021, vol. 12: 2557. doi: 10.3389/fimmu.2021.687449Su L.F., Kidd B.A., Han A., Kotzin J.J., Davis M.M. Virus-specific CD4+ memory-phenotype T cells are abundant in unexposed adults. Immunity, 2013, vol. 38, no. 2, pp. 373–383. doi: 10.1016/j.immuni.2012.10.021Teng I.T., Nazzari A.F., Choe M., Liu T., Oliveira de Souza M., Petrova Y., Tsybovsky Y., Wang S., Zhang B., Artamonov M., Madan B., Huang A, Lopez Acevedo S.N., Pan X., Ruckwardt T.J., DeKosky B.J., Mascola J.R., Misasi J., Sullivan N.J., Zhou T., Kwong P.D. Molecular probes of spike ectodomain and its subdomains for SARS-CoV-2 variants, Alpha through Omicron. PLoS One, 2022, vol. 17, no. 5: e0268767. doi: 10.1371/journal.pone.0268767The proteomics protocols handbook. Ed. by Walker J.M. Humana Press, 2005. 576 p. URL: https://link.springer.com/content/pdf/10.1385/1592598900.pdf (10.07.23)Wu Y., Guo C., Tang L., Hong Z., Zhou J., Dong X., Yin H., Xiao Q., Tang Y., Qu X., Kuang L., Fang X., Mishra N., Lu J., Shan H., Jiang G., Huang X. Prolonged presence of SARS-CoV-2 viral RNA in faecal samples. Lancet Gastroenterol. Hepatol., 2020, vol. 5, no. 5, pp. 434–435. doi: 10.1016/S2468-1253(20)30083-2Zhang Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC Bioinformatics, 2008, vol. 9, pp. 1–8. doi: 10.1186/1471-2105-9-40Zhou P., Yang X.L., Wang X.G., Hu B., Zhang L., Zhang W., Si H.R., Zhu Y., Li B., Huang C.L., Chen H.D., Chen J., Luo Y., Guo H., Jiang R.D., Liu M.Q., Chen Y., Shen X.R., Wang X., Zheng X.S., Zhao K., Chen Q.J., Deng F., Liu L.L., Yan B., Zhan F.X., Wang Y.Y., Xiao G.F., Shi Z.L. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature, 2020, vol. 579, no. 7798, pp. 270–273. doi: 10.1038/s41586-020-2012-7