Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI149510.15789/2220-7619-FOA-1495FOR THE PRACTICAL PHYSICIANSВ ПОМОЩЬ ПРАКТИЧЕСКОМУ ВРАЧУFeatures of antifungal therapy during long-lasting infectious process: a clinical case of fungal keratitis and profile of antifungal sensitivity based on assessing biofilm formationОсобенности антифунгальной терапии при длительном инфекционном процессе: клинический случай грибкового кератита и анализ профиля противогрибковой чувствительности с учетом формирования биопленокhttps://orcid.org/0000-0002-8751-6362ValievaR. I.ВалиеваР. И.
Russian Federation

Rita I. Valieva, Junior Researcher, Laboratory of Microbiology; Assistant Professor, V.M. Aristovsky Department of Microbiology 

420015, Kazan, Bol'shaya Krasnaya str., 67

Phone: +7 (927) 403-15-07 

Валиева Рита Илнуровна, младший научный сотрудник лаборатории микробиологии; ассистент кафедры микробиологии им. академика В.М. Аристовского 

420015, г. Казань, ул. Б. Красная, 67

Тел.: 8 (927) 403-15-07

valievarita@yandex.ruLisovskayaS. A.ЛисовскаяС. А.
Russian Federation

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Micology; Associate Professor, V.M. Aristovsky Department of Microbiology

Kazan 

к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории микологии; доцент кафедры микробиологии им. академика В.М. Аристовского 

г. Казань 

s_lisovskaya@mail.ruMayanskayaK. A.МаянскаяК. А.
Russian Federation

Ophthalmologist

Kazan 

врач-офтальмолог

г. Казань 

kmayansk@gmail.comSamigullinD. V.СамигуллинД. В.
Russian Federation

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes

Kazan 

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории биофизики синаптических процессов

г. Казань 

samid75@mail.ruIsaevaG. Sh.ИсаеваГ. Ш.
Russian Federation

PhD, MD (Medicine), Professor, Deputy Director; Head of the V.M. Aristovsky Department of Microbiology

Kazan 

д.м.н., профессор, зам. директора; зав. кафедрой микробиологии им. академика В.М. Аристовского

г. Казань 

guisaeva@rambler.ruKazan Research Institute of Epidemiology and MicrobiologyФБУН Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии РоспотребнадзораKazan State Medical UniversityФГБОУ ВО Казанский государственный медицинский университетOphthalmological Clinic “Eye Surgery of Rascheskov”Офтальмологическая клиника «Глазная хирургия Расческов»Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Kazan Scientific Center of RASКазанский институт биохимии и биофизики, Казанский научный центр РАН200920211147897970106202029112020Copyright ©; 2021, Valieva R.I., Lisovskaya S.A., Mayanskaya K.A., Samigullin D.V., Isaeva G.S.Copyright ©; 2021, Валиева Р.И., Лисовская С.А., Маянская К.А., Самигуллин Д.В., Исаева Г.Ш.2021Valieva R.I., Lisovskaya S.A., Mayanskaya K.A., Samigullin D.V., Isaeva G.S.Валиева Р.И., Лисовская С.А., Маянская К.А., Самигуллин Д.В., Исаева Г.Ш.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/1495

Among infectious diseases, opportunistic mycoses hold a special place. There has been accumulating a lot of evidence regarding the clinical and epidemiological aspects of infection caused by Fusarium spp., which global incidence rate among microbial keratitis ranges from 2 to 40% depending on the geographical location of the country. Colonizing mucous membranes, fungi can exist not only in the form of plankton, but form biofilms after surface attachment, which leads to elevated resistance to multiple antifungal agents. Here we describe a clinical case of fungal keratitis due to Fusarium solani by determining profile of the antifungal sensitivity for isolated fungal strains, by taking into account their potential for biofilm formation. We used an F. solani culture isolated from the patient as well as F. solani test culture obtained from the Russian National Collection of Microorganisms. While determining the sensitivity of fungal planktonic cultures to antifungal agents from the azole group (fluconazole, voriconazole), amphotericin B and terbinafine, it was revealed that antimycotics amphotericin B and voriconazole exerted a marked antifungal activity against clinical isolate, whereas the plankton F. solani test culture was more sensitive to all groups of antifungal agents. Due to a long-lasting progressive course of the infectious process and the high biofilm-forming ability of the clinical strain F. solani, the activity of antifungal agents on biofilm cells was modeled and examined in vitro. It was shown that regarding to the fungal biofilms, value of the minimally inhibitory concentration exceeded those for planktonic cultures by 100-fold. The mechanisms of action for antifungal agents on vital parameters of fungal cell structures were analyzed by using confocal laser scanning microscopy after staining samples with propidium iodide and acridine orange for 15 min to detect changes between intact and damaged cell surface. It was found that within the biofilm fungal cells preserved viability even after exposure to high concentrations of antifungals. In addition, despite the fungicidal drug activity at substantial concentrations acting on the biofilm cell membrane, the cell nuclei remained viable. Owing to the presence ot the mechanism of resistance in mycelial fungi shown in the study, it is necessary to take into account and investigate characteristics of biofilms in terms of drug sensitivity that will allow to optimize a choice of antimicrobial therapy.

Среди инфекционных болезней оппортунистические микозы занимают особое место. В литературе появляется все больше сведений о клинических и эпидемиологических аспектах инфекции, вызванных Fusarium spp. Частота встречаемости данной инфекции среди микробных кератитов в мире колеблется от 2 до 40% в зависимости от географического расположения страны. Колонизируя слизистые, грибы могут существовать не только в виде планктонных форм, но и, прикрепляясь к поверхности, образовывать биопленки, что приводит к возрастанию резистентности ко многим антифунгальным препаратам. В статье описан случай грибкового кератита, обусловленного грибами Fusarium solani, с определением профиля противогрибковой чувствительности выделенных штаммов грибов с учетом их способности к биопленкообразованию. В исследовании использовали культуру F. solani, выделенную от пациента, и тест-культуру F. solani, полученную из Всероссийской коллекции микроорганизмов. При определении чувствительности планктонных культур грибов к противогрибковым препаратам группы азолов (флуконазол, вориконазол), амфотерицина В и тербинафина выявлено, что выраженной противогрибковой активностью в отношении клинического штамма обладают антимикотики амфотерицин В и вориконазол, тогда как для планктонной культуры тест-штамма F. solani характерна более выраженная чувствительность ко всем группам препаратов. В связи с длительным прогрессирующим течением инфекционного процесса и высокой биопленкообразующей способностью клинического штамма F. solani исследована активность противогрибковых препаратов на клетки в составе биопленок, смоделированных in vitro. Показано, что в отношении биопленок показатели минимально ингибирующих концентраций превышают в 100 раз значения для планктонных культур. Проведен анализ механизмов действия противогрибковых препаратов на жизненную активность клеточных структур с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Окрашивание проводили с использованием пропидия йодида и акридина оранжевого в течение 15 мин для выявления различия между неповрежденной и поврежденной клеточной поверхностью гриба. Обнаружено, что в составе биопленки клетки сохраняли жизненную активность и под воздействием высоких концентраций веществ. Кроме того, несмотря на деструктивное воздействие значительных концентраций препарата на клеточную мембрану биопленки, ядра клеток оставались жизнеспособными. Необходимо учитывать наличие описанного в данной работе механизма резистентности у мицелиальных грибов и исследовать чувствительность биопленок к препаратам с целью оптимизации антимикотической терапии.

Fusariumfungal keratitisinfectious processantifungal agentsbiofilmconfocal laser scanning microscopypropidium iodideacridine orangeгрибы Fusariumгрибковый кератитинфекционный процесспротивогрибковые препаратыбиопленкаконфокальная лазерная сканирующая микроскопияпропидий йодидакридин оранжевыйThis work was supported by Grant No. 20 04 00247 of the Russian Foundation for Basic Research. Part of the work with the use of confocal microscopy was carried out within the framework of research on the state order of the Federal Research Center “Kazan Scientific Center of the Russian Academy of Sciences” (state registration No. ААААА181180227900839).Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 20 04 00247. Часть работы с применением конфокальной микроскопии проводилась в рамках исследований по госзаданию ФИЦ КазНЦ РАН (№ госрегистрации АААА А18 118022790083 9).1. Астахов Ю.С., Скрябина Е.В., Коненкова Я.С., Касымов Ф.О., Богомолова Т.С., Пинегина О.Н. Диагностика и лечение грибковых кератитов // Офтальмологические ведомости. 2013. Т. 6, № 2. С. 75–80. [Astakhov Yu.S., Scriabin E.V., Konenkova Y.S., Kasymov F.O., Bogomolova T.S., Pinegin O.N. Diagnosis and treatment of fungal keratitis. Oftalmologicheskie vedomosti = Ophthalmology Journal, 2013, vol. 6, no. 2, pp. 75–80. (In Russ.)] doi: 10.17816/OV11363-732. Делягин В.М., Мельникова М.Б., Першин Б.С., Серик Г.И., Джандарова Д.Т. Грибковые поражения глаз (диагностика, лечение) // Практическая медицина. 2015. Т. 1. С. 100–105. [Delyagin V.M., Melnikova M.B., Pershin B.S., Serik G.I., Dzhandarova D.T. Fungal eye lesions (diagnosis, treatment). Prakticheskaia meditsina = Practical Medicine, 2015, vol. 1, pp. 100–105. (In Russ.)]3. Мальцев С.В., Мансурова Г.Ш. Что такое биопленка? // Практическая медицина. 2011. T. 5. C. 7–11. [Maltsev S.V., Mansurova G.Sh. What is a biofilm? Prakticheskaya meditsina = Practical Medicine, 2011, vol. 5, pp. 7–11. (In Russ.)] doi: 10.21292/2075-1230-2016-94-8-48-534. Полтанова Т.И., Белоусова Н.Ю. Рецидив грибкового кератита в роговичном трансплантате // Казанский медицин ский журнал. 2018. Т. 99, № 1. С. 148–150. [Poltanova T.I., Belousova N.Yu. Relapse of fungal keratitis in the corneal graft. Kazanskiy meditsinskiy zhurnal = Kazan Medical Journal, 2018, vol. 99, no. 1, pp. 148–150. (In Russ.)] doi: 10.17816/KMJ2018-1485. Рахматулина М.Р., Нечаева И.А. Биопленки микроорганизмов и их роль в формировании резистентности к антибактериальным препаратам // Вестник дерматологии и венерологии. 2015. Т. 91, № 2. C. 58–62. [Rakhmatulin M.R., Nechaev I.A. Biofilms of microorganisms and their role in the formation of resistance to antibacterial drugs. Vestnik dermatologii i venerologii = Bulletin of Dermatology and Venereologists, 2015, vol. 91, no. 2, pp. 58–62. (In Russ.)] doi: 10.25208/0042-4609-2015-91-2-58-626. Шварц Т.А. Биопленки как микробное сообщество // Вестник КГУ. 2015. № 1. С. 41–44. [Schwartz T.A. Biofilms as a microbial community. Vestnik KGU = Bulletin of KSU, 2015, no. 1, pp. 41–44. (In Russ.)]7. Ansari Z., Miller D., Galor A. Current thoughts in fungal keratitis: diagnosis and treatment. Curr. Fungal Infect. Rep., 2013, vol. 7, no. 3, pp. 209–218. doi: 10.1007/s12281-013-0150-110.1007/s12281-013-0150-18. Aoun M. Voriconazole: a new weapon against invasive fungal infections. Rev. Med. Brux., 2004, vol. 25, no. 3, pp. 166–171.9. Bayguinov P.O., Oakley D.M., Shih C.C., Geanon D.J., Joens M.S., Fitzpatrick J.A.J. Modern laser scanning confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom., 2018, vol. 85, no. 1, pp. 39–45. doi: 10.1002/cpcy.3910. Bigley V.H., Duarte R.F., Gosling R.D., Kibbler C.C., Seaton S., Potter M. Fusarium dimerum infection in a stem cell transplant recipient treated successfully with voriconazole. Bone Marrow Transplant., 2004, vol. 3, no. 9, pp. 815–817. doi: 10.1038/sj.bmt.170466011. Bograd A., Seiler T., Droz S., Zimmerli S., Früh B., Tappeiner C. Bacterial and fungal keratitis: a retrospective analysis at a university hospital in Switzerland. Klin. Monatsbl. Augenheilkd., 2019, vol. 236, no. 4, pp. 358–365. doi: 10.1055/a-0774-775612. CLSI. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. 3rd ed. Pennsylvania: CLSI, 2017. 63 p.13. Coleman J.J. The Fusarium solani species complex: ubiquitous pathogens of agricultural importance. Mol. Plant. Pathol., 2016, vol. 17, no. 2, pp. 146–158. doi: 10.1111/mpp.1228914. Consigny S., Dhedin N., Datry A., Choquet S., Leblond V., Chosidow O. Successsful voriconazole treatment of disseminated fusarium infection in an immunocompromised patient. Clin. Infect. Dis., 2003, vol. 37, no. 2, pp. 311–313. doi: 10.1086/37584215. De Carolis E., Posteraro B., Lass-Flörl C., Tortorano A.M., Sanguinetti G., Fadda M. Species identification of Aspergillus, Fusarium and Mucorales with direct surface analysis by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Microbiol. Infect., 2012, vol. 18, no. 5, pp. 475–484. doi: 10.1111/j.1469-0691.2011.03599.x16. Dignani M.C., Anaissie E. Human fusariosis. Clin. Microbiol. Infect., 2004, vol. 10, no. 1, pp. 67–75. doi: 10.1111/j.1470-9465.2004.00845.x17. Dóczi I., Gyetvai T., Kredics L., Nagy E. Involvement of Fusarium spp. in fungal keratitis. Clin. Microbiol. Infect., 2004, vol. 10, no. 9, pp. 773–776. doi: 10.1111/j.1469-0691.2004.00909.x18. Espinel-Ingroff A., Colombo A.L., Cordoba S. International evaluation of MIC distributions and epidemiological cutoff value (ECV) definitions for Fusarium species identified by molecular methods for the CLSI broth microdilution method. Antimicrob. Agents Chemother., 2015, vol. 60, no. 2, pp. 1079–1084. doi: 10.1128/AAC.02456-1519. Fernandes M., Vira D., Dey M., Tanzin T., Kumar N., Sharma S. Comparison between polymicrobial and fungal keratitis: clinical features, risk factors, and outcome. Amer. J. Ophthalmol., 2015, vol. 160, no. 5, pp. 873–881. doi: 10.1016/j.ajo.2015.07.02820. Chang D.C., Grant G.B., O’Donnell K., Wannemuehler K.A., Noble-Wang J., Rao C.Y., Jacobson L.M., Crowell C.S., Sneed R.S., Lewis F.M., Schaffzin J.K., Kainer M.A., Genese C.A., Alfonso E.C., Jones D.B., Srinivasan A., Fridkin S.K., Park B.J. Multistate outbreak of Fusarium keratitis associated with use of a contact lens solution. JAMA, 2006, vol. 296, no. 8, pp. 953–963. doi: 10.1001/jama.296.8.95321. Guarro J., Pujol I., Mayayo E. In vitro and in vivo experimental activities of antifungal agents against Fusarium solani. Antimicrob. Agents Chemother., 1999, vol. 43, no. 5, pp. 1256–1257. doi: 10.1128/AAC.43.5.125622. Gupta A.K., Foley K.A. Evidence for biofilms in onychomycosis. Giornale Italiano di Dermatologia e Venereologia, 2019, vol. 154, no. 1, pp. 50–55. doi: 10.23736/S0392-0488.18.06001-723. Homa M., Galgóczy L., Manikandan P., Narendran V., Sinka R., Csernetics A., Vágvölgyi C., Kredics L., Papp T. South Indian isolates of the Fusarium solani species complex from clinical and environmental samples: identification, antifungal susceptibilities, and virulence. Front. Microbiol., 2018, vol. 9: 1052. doi: 10.3389/fmicb.2018.0105224. Hoog G.S., Guarro J., Gene J., Figueras M.J. Atlas of Clinical Fungi. 2nd edition. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Universitat Rovira i Virgili, 2000. 1126 p.25. Lewis R.E., Wiederhold N.P., Klepser M.E. In vitro pharmacodynamics of amphotericin B, itraconazole, and voriconazole against Aspergillus, Fusarium, and Scedosporium spp. Antimicrob. Agents Chemother., 2005, vol. 49, no. 3, pp. 945–951. doi: 10.1128/AAC.49.3.945-951.200526. Mascotti K., McCullough J., Burger S.R. HPC Viability Measurement: trypan blue versus acridine orange and propidium iodide. Transfusion, 2000, vol. 40, no. 6, pp. 693–696. doi: 10.1046/j.1537-2995.2000.40060693.x27. Mayayo E., Pujol I., Guarro J. Experimental pathogenicity of four opportunist Fusarium species in a murine model. J. Med. Microbiol., 1999, vol. 48, no. 4, pp. 363–366.28. Ortoneda M., Capilla J., Pastor F.J., Pujol I., Guarro J. Efficacy of liposomal amphotericin B in treatment of systemic murine fusariosis. Antimicrob. Agents Chemother., 2002, vol. 46, no. 7, pp. 2273–2275. doi: 10.1128/AAC.46.7.2273-2275.200229. Paphitou N.I., Ostrosky-Zeichner L., Paetznick V.L., Rodriguez J.R., Chen E., Rex J.H. In vitro activities of investigational triazoles against Fusarium species: effects of inoculum size and incubation time on broth microdilution susceptibility test results. Antimicrob. Agents Chemother., 2002, vol. 46, no. 10, pp. 3298–3300. doi: 10.1128/AAC.46.10.3298-3300.200230. Perfect J.R., Marr K.A., Walsh T.J., Greenberg R.N., DuPont B., de la Torre-Cisneros J., Just-Nübling G., Schlamm H.T., Lutsar I., Espinel-Ingroff A., Johnson E. Voriconazole treatment for less-common, emerging, or refractory fungal infections. Clin. Infect. Dis., 2003, vol. 36, no. 9, pp. 1122–1131. doi: 10.1086/37455731. Pujol I., Guarro J., Gené J., Sala J. In-vitro antifungal susceptibility of clinical and environmental Fusarium spp. strains. J. Antimicrob. Chemother., 1997, vol. 39, no. 2, pp. 163–167. doi: 10.1093/jac/39.2.16332. Sabatelli F., Patel R., Mann P.A., Mendrick C.A., Norris C.C., Hare R., Loebenberg D., Black T.A., McNicholas P.M. In vitro activities of posaconazole, fluconazole, itraconazole, voriconazole, and amphotericin B against a large collection of clinically important molds and yeasts. Antimicrob Agents Chemother., 2006, vol. 50, no. 6, pp. 2009–2015. doi: 10.1128/AAC.00163-0633. Tarabishy A.B., Aldabagh B., Sun Y. MyD88 regulation of Fusarium keratitis is dependent on TLR4 and IL-1R1 but not TLR2. J. Immunol., 2008, vol. 181, no. 1, pp. 593–600. doi: 10.4049/jimmunol.181.1.59334. Thomas P.A., Kaliamurthy J. Mycotic keratitis: epidemiology, diagnosis and management. Clin. Microbiol. Infect., 2013, vol. 19, no. 3, pp. 210–220. doi: 10.1111/1469-0691.1212635. Van Burik J.A., Magee P.T. Aspects of fungal pathogenesis in humans. Ann. Rev. Microbiol., 2001, vol. 55, pp. 743–772. doi: 0.1146/annurev.micro.55.1.74336. Walther G., Stasch S., Kaerger K., Hamprecht A., Roth M., Cornely O.A., Geerling G., Mackenzie C.R., Kurzai O. Fusarium Keratitis in Germany. J. Clin. Microbiol., 2017, vol. 55, no. 10, pp. 2983–2995. doi: 10.1128/JCM.00649-1737. Wu T.G., Keasler V., Mitchell B.M., Wilhelmus K.R. Immunosuppression affects the severity of experimental Fusarium solani keratitis. J. Infect. Dis., 2004, vol. 190, pp. 192–198. doi: 10.1086/421300