Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI121110.15789/2220-7619-PAO-1211METHODSМЕТОДЫPractical aspects on identification, cultivation and characteristics of varicella-zoster virus isolatesПрактические аспекты выявления, культивирования и характеристики клинических изолятов вируса varicella-zosterNagievaF. G.НагиеваФ. Г.
Russian Federation

Firaya G. Nagieva, PhD, MD (Medicine), Associate Professor, Head of the Laboratory of Hybrid Cell Cultures, Department of Virology

115088, Moscow, 1st Dubrovskaya str., 15/1Phone: +7 (495) 674-76-45 (office); +7 916 272-79-01 (mobile) 

Нагиева Фирая Галиевна - д.м.н., зав. лабораторией гибридных клеточных культур отдела вирусологии

115088, Москва, ул. 1-я Дубровская, 15, стр. 1Тел.: 8 (495) 674-76-45 (служебн.); 8 916 272-79-01 (моб.).

fgn42@yandex.ruBarkovaE. P.БарковаЕ. П.
Russian Federation

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Hybrid Cell Cultures, Department of Virology

Moscow

к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории гибридных клеточных культур отдела вирусологии

Москва

e.barkova2012@yandex.ruLisakovA. N.ЛисаковА. Н.
Russian Federation

Junior Researcher, Laboratory of Hybrid Cell Cultures, Department of Virology

Moscow

научный сотрудник лаборатории гибридных клеточных культур отдела вирусологии

Москва

lisacov@mail.ruSidorovA. V.СидоровА. В.
Russian Federation

PhD (Biology), Head of the Laboratory of Genetics of DNA Containing Viruses, Virology Branch

Moscow

к.б.н., зав. лабораторией генетики ДНК-содержащих вирусов отдела вирусологии

Москва

sashasidorov@yandex.ruZverevV. V.ЗверевВ. В.
Russian Federation

PhD, MD (Biology), Professor, RAS Full Member, Scientific Director

Moscow

д.б.н., профессор, академик РАН, научный руководитель института

Москва

vvzverev12@mail.ruOsokinaO. V.ОсокинаО. В.
Russian Federation

PhD (Medicine), Head of Innovative Department

Moscow

к.м.н. зав. инновационным отделом

Москва

osokina@yandex.ruStroevaA. D.СтроеваА. Д.
Russian Federation

Junior Researcher, Laboratory of Hybrid Cell Cultures, Department of Virology

Moscow

младший научный сотрудник лаборатории гибридных клеточных культур отдела вирусологии

Москва

aleksandra.26@mail.ruMechnikov Research Institute of Vaccines and SeraФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова220520201023873963005201911032020Copyright ©; 2020, Nagieva F.G., Barkova E.P., Lisakov A.N., Sidorov A.V., Zverev V.V., Osokina O.V., Stroeva A.D.Copyright ©; 2020, Нагиева Ф.Г., Баркова Е.П., Лисаков А.Н., Сидоров А.В., Зверев В.В., Осокина О.В., Строева А.Д.2020Nagieva F.G., Barkova E.P., Lisakov A.N., Sidorov A.V., Zverev V.V., Osokina O.V., Stroeva A.D.Нагиева Ф.Г., Баркова Е.П., Лисаков А.Н., Сидоров А.В., Зверев В.В., Осокина О.В., Строева А.Д.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/1211

Until now, it has been considered that infectivity of the varicella-zoster virus (VZV) is closely related to target cell, and newly formed virus is not released into the culture medium. It is also known that it is hard to grow VZV in cell cultures, due to its slow replication rate and a limited range of sensitive cell cultures. In addition, VZV isolation depends on type of cell culture used, nature of clinical material, presence of viable virus and transport time. Objectives. To study production of infectious extracellular VZV in various cell cultures. Materials and methods. Eight cell cultures were used, including human embryonic diploid lung cells and human embryonic dermomuscular tissue (KM-27), as well as continuous human and monkey cell lines. Crusts detached from vesicular lesions were used as clinical isolates, which were placed into cryo-vials added with transport medium and transferred in liquid nitrogen. VZV infectivity was assessed in cell cultures by using hemo-adsorption assay with erythrocyte suspension isolated from guinea pig or human zero group blood and confirmed by indirect immunofluorescence with polyclonal sera from varicella or herpes zoster convalescents. Results. There were examined 27 clinical samples consisting of crusts from vesicular lesions isolated from patients with chickenpox, as well as one sample from 63-year old patient with exacerbated recurrent herpes zoster. Primary infection with clinical isolates was performed on diploid human lung embryo cells (HLEC) at low temperature. It was found that clinical samples collected within day 1–18 inclusive after the onset of skin eruption were able to induce cytopathic effects in HLEC cell monolayer such as cytolysis around dermal crusts. Specificity of cytopathic effect was confirmed by using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Viral antigens were prepared on 7 cell lines infected with the laboratory strain Ellen VZV (USA) to assess the immune sera. A high anti-VZV specificity of mouse sera was detected by ELISA while all the lysates of infected cell lines were used as the solid-phase sorbent. In experiments on VZV reproduction demonstrated that extracellular virus was released into the culture medium starting from day 1 after infection of target cells, and infectivity of the virus-containing fluid ascends during further cultivation.

До настоящего времени принято считать, что инфекционность вируса varicella-zoster (VZV — varicella-zoster virus) остается тесно связанной с клеткой, и вновь сформированный вирус не высвобождается в культуральную среду. Известно также, что VZV трудно выращивать в клеточных культурах, поскольку он медленно реплицируется, имеет ограниченный спектр чувствительных клеточных культур. Кроме того, изоляция VZV зависит от вида использованных клеточных культур, характера клинического материала, наличия жизнеспособного вируса и времени транспортировки. Цель работы: изучение продукции инфекционного внеклеточного VZV с использованием различных клеточных культур. Материалы и методы. В работе использовали 8 различных клеточных культур, включая диплоидные клетки легких эмбриона человека и кожно-мышечную ткань эмбриона человека (КМ-27), а также перевиваемые клеточные линии человека и обезьян. В качестве клинических изолятов были использованы корочки от везикулярной сыпи, которые помещали в криопробирки с транспортной средой и транспортировали в жидком азоте. Инфекционность VZV оценивали на инфицированных клеточных культурах по реакции гемадсорбции со взвесью эритроцитов морских свинок или человека с нулевой группой крови и подтверждали в реакции непрямой иммунофлуоресценции с поликлональными сыворотками от людей, переболевших опоясывающим герпесом. Результаты. В работе было исследовано 27 клинических образцов в виде корочек от везикулярной сыпи от пациентов, заболевших ветряной оспой, и один образец от пациента в возрасте 63 лет в фазе обострения рецидивирующего опоясывающего герпеса. Первичное заражение клиническими изолятами проводили на штаммах диплоидных клеток легких эмбриона человека (ЛЭЧ-3) при низких температурах. Было установлено, что корочки от везикулярной сыпи, взятые от пациентов с 1 по 18 сут включительно с момента появления сыпи, вызывали на монослое клеток ЛЭЧ-3 цитопатическое действие в виде цитолиза клеток вокруг корочки. Специфичность ЦПД подтверждали ПЦР-РВ. Для оценки иммунных сывороток были приготовлены вирусные антигены на 7 клеточных линиях, зараженных лабораторным штаммом «Ellen» VZV (США). Была обнаружена высокая специфическая антиVZV активность мышиных сывороток в ИФА при использовании в качестве твердофазного сорбента всех использованных лизатов инфицированных клеточных линий. В экспериментах по репродукции VZV было установлено, что внеклеточный вирус высвобождается в культуральную среду с 1 суток с момента инфицирования чувствительных клеток, и инфекционность вируссодержащей жидкости увеличивается в процессе дальнейшего культивирования.

Varicella-zoster viruscell cultureсlinical isolatevirus reproductionhemo-adsorbtion reactionimmunofluorescent analysismonoclonal antibodiesreal-time PCR assayindividual virus collectingvaricella-zosterherpes zosterкультура клетокклинический изолятрепродукция вирусареакция гемоадсорбциииммунофлуоресцентный анализмоноклональные антителаПЦР в реальном временииндивидуальные вирусные сборы1. Фам Х.Ф., Сидоров А.В., Милованова А.В., Антонова Т.П., Лисаков А.Н., Нагиева Ф.Г., Алаторцева Г.И., Свитич О.А., Казанова А.С., Лавров В.Ф., Зверев В.В. Новый подход к диагностике varicella-zoster-вирусной инфекции с использованием ПЦР в режиме реального времени // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016. Т. 15, № 5. С. 52–58. doi: 10.31631/2073-3046-2016-15-5-52-582. Arvin A.M. Varicella-zoster virus. Clin. Microb. Rev., 1996, vol. 9, no. 3, pp. 361–381.3. Arvin A.M. Varicella vaccine: genesis, efficacy, and attenuation. Virology, 2001, vol. 284, no. 2, pp. 153–158. doi: 10.1006/viro.2001.09184. Baiker A., Fabel K., Cozzio A. Varicella-zoster virus infection of human neural cells in vivo. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2004, vol. 101, no. 29, pp. 10792–10797. doi: 10.1073/pnas.04040161015. Depledge D.P., Palser A.L., Watson S.J., Yi-Chun Lai I., Gray E.R., Grant P. Specific capture and whole-genome sequencing of viruses from clinical samples. PLoS One, 2011, vol. 6, no. 11, pp. 1–7. doi: 10.1371/journal.pone.00278056. Gershon A.A. Varicella-zoster vaccines and their implications for development of HSV vaccines. Virology, 2013, vol. 435, no. 1, pp. 29–36. doi: 10.1016/j.virol.2012.10.0067. Gershon A.A., Sherman D.L., Zhu Z., Gabel C.A., Ambron R.T., Gershon M.D. Intracellular transport or newly synthesized varicella-zoster virus: final envelopment in the trans-Colgi network. J. Virol, 1994, vol. 68, no. 10, pp. 6372–6390.8. Gershon A.A., Steinberg S.P., Gelb L. Clinical reinfection with varicella-zoster virus. J. Infect. Dis., 1984, vol. 149, no. 2, pp. 137–142. doi: 10.1093/infdis/149.2.1379. Gilden D.H. Varicella-zoster virus vasculopathy and disseminated encephalomyelitis. J. Neurol. Sci., 2002, vol. 195, no. 2, pp. 99–101. doi: 10.1016/S0022-510X(02)00021-710. Goaster J.L., Conzalo S., Bouree P., Tangy F., Haenni A.L. Efficacy of the anti-VZV (anti-HSV3) vaccine in HSV1 and HSV2 recurrent herpes simplex disease: a prospective study. Open Access Journal of Clinical Trials, 2012, vol. 4, pp. 51–58. doi: 10.2147/OAJCT.S3329211. Grose C., Ng T.I. Intracellular synthesis of varicella-zoster virus. J. Infect. Dis., 1992, vol. 166, pp. 7–12. doi: 10.1093/infdis/166.supplement_1.s712. Haberthur K., Messaoudi I. Animal models of varicella-zoster virus infection. Pathogens, 2013, vol. 2, no. 2, pp. 364–382. doi: 10.3390/pathogens202036413. Levin M.J., Levental S., Masters H.A. Factors influencing quantitative isolation of varicella-zoster virus. J. Clin. Microbiol., 1984, vol. 19, no. 6, pp. 880–883.14. Reik L.M., Maines S.L., Levin W., Bandirra S., Thomas P.E. A simple, non-chromatographic purification procedure for monoclonal antibodies. Isolation of monoclonal antibodies against cytochrome P450 isozymes. J. Immunol. Methods, 1987, vol. 100, no. 1–2, pp. 123–130.15. Rice G.P., Casali P., Oldstone M.B. A new solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay for specific antibodies to measles virus. J. Infect. Dis., 1983, vol. 147, no. 6, pp. 1055-1059.16. Sarkadi J. Varicella-zoster virus vaccine, successes and difficulties. Acta Microbiol. Immunol. Hung., 2013, vol. 60, no. 4, pp. 379–396. doi: 10.1556/AMicr.60.2013.4.117. Silver B., Hua Zhu. Varicella-zoster virus vaccines: potential complications and possible improvements. Virologica Sinica, 2014, vol. 29, no. 5, pp. 265–273. doi: 10.1007/s12250-014-3516-9