Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI115110.15789/2220-7619-SIC-1151ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИSalmonella-induced changes in the level of key immunoregulatory bacteria affect the transcriptional activity of the Foxp3 and RORgt genes in the gut-associated lymphoid tissue of ratsСальмонелла-индуцированные изменения уровня ключевых иммунорегуляторных бактерий влияют на транскрипционную активность генов Foxp3 и RORgt в кишечноассоциированной лимфоидной ткани крысhttps://orcid.org/0000-0001-9529-3798BukinaYu. V.БукинаЮ. В.
Ukraine

Yuliia V. Bukina - Assistant Professor, Microbiology, Virology and Immunology Department.

69035, Ukraina, Zaporozhye, pr. Majakovskogo, 26, Phone: +38 096 400-46-26; +38 095 512-09-29

Букина Юлия Вячеславовна - ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.

69035, Запорожье, пр. Маяковского, 26, Тел.: +38 096 400-46-26; +38 095 512-09-29

lingvus25@gmail.comFedoniukL. Ya.ФедонюкЛ. Я.
Ukraine

PhD, MD (Medicine), Professor, Head of Medical Biology Department.

Ternopil

Доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедры медицинской биологии.

Тернополь

Fedonyuk22Larisa@gmail.comKovalG. D.КовальГ. Д.
Ukraine

PhD, MD (Medicine), Professor of Clinical Immunology, Allergology and Endocrinology Department.

Chernovtsy

Доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической иммунологии, аллергологии и эндокринологии.

Черновцы

koval.halyna@bsmu.edu.uahttps://orcid.org/0000-0002-7528-6627ShekhovtsovaYu. O.ШеховцоваЮ. А.
Ukraine

PhD (Medicine), Assistant Professor, Department of Internal Medicine and Endocrinology.

Kharkiv

Кандидат медицинских наук, ассистент кафедры внутренней медицины и эндоскопии.

Харьковagagroup@ukr.netKamyshnyiA. M.КамышныйА. М.
Ukraine

PhD, MD (Medicine), Professor, Head of Microbiology, Virology and Immunology Department.

Zaporozhye

Доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.

Запорожье

alexkamyshnyi@gmail.comGubarA. O.ГубарьА. А.
Ukraine

PhD (Medicine), Associate Professor, Urology Department.

Zaporozhye

Кандидат медицинских наук, доцент кафедры урологии.

Запорожье

gubar1405@ukr.netGubkaV. O.ГубкаВ. А.
Ukraine

PhD, MD (Medicine), Associate Professor, Professor of Hospital Surgery Department.

Zaporozhye

Доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры госпитальной хирургии.

Запорожье

gubka@zsmu.zp.uaZaporozhye State Medical UniversityЗапорожский государственный медицинский университетTernopil State Medical UniversityТернопольский государственный медицинский университетBukovinian State Medical UniversityБуковинский государственный медицинский университетKharkiv National Medical UniversityХарьковский национальный медицинский университет271120201046716851802201920052020Copyright ©; 2020, Bukina Y.V., Fedoniuk L.Y., Koval G.D., Shekhovtsova Y.O., Kamyshnyi A.M., Gubar A.O., Gubka V.O.Copyright ©; 2020, Букина Ю.В., Федонюк Л.Я., Коваль Г.Д., Шеховцова Ю.А., Камышный А.М., Губарь А.А., Губка В.А.2020Bukina Y.V., Fedoniuk L.Y., Koval G.D., Shekhovtsova Y.O., Kamyshnyi A.M., Gubar A.O., Gubka V.O.Букина Ю.В., Федонюк Л.Я., Коваль Г.Д., Шеховцова Ю.А., Камышный А.М., Губарь А.А., Губка В.А.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/1151

Intestinal microbes involved in many physiological processes owner, contributes to the formation and maintenance of immune homeostasis by regulating immune responses to protect against colonization by pathogens. A special role in the differentiation of various subpopulations of T-lymphocytes play the segmental filamentous bacteria (Segmented filamentous bacteria, SFB), capable of inducing a gut-associated lymphoid tissue (GALT) differentiation proinflammatory Th17-cells and members of the genus Clostridium (cluster IV and XIVa) and Bacteroides fragilis (polysaccharide A [PSA]), stimulating the formation of regulatory T-cells (Treg) and production of suppressor of cytokine IL-10. Important metabolites of B. fragilis are short-chain fatty acids (SCFA), which are able to activate GALT cells through the FFAR2 receptor. Lowering of the SCFA concentration leads to the reduction of the number of Treg in the intestine and breaks Th17/Treg balance. These changes lead to direct reducing of mRNA FFAR2, Foxp3 expression and increasing in RORyt GALT. Therefore, the goal was to determine the level of the key in the edge immunoregulatory bacteria intestinal microflora rats and their effects on the transcriptional activity of the genes Foxp3 and RORyt in GALT with Salmonella-induced inflammation and during administration of vancomycin and B. fragilis. To determine the genus and species of bacteria, as well as their number in the microflora of rats, was used the method of polymerase chain reaction (PCR-RV) with their identification by 16S rDNA genes. To study the transcriptional activity of genes using polymerase chain reaction reverse transcription real-time (RT-PCR). During the experiment with the introduction of animals vancomycin and Salmonella there was an increase in the level of SFB and a decrease in A. muciniphila, F. prausnitzii. Also, during infecting rats with S. Enteritidis and S. Typhimurium on the background of pre-treatment with vancomycin, there was an increase in the number of SFBs against the background of a pronounced decrease in Bacteroides—Prevotela group, A. muciniphila, Clostridium spp. clusters XIV, IV, and F. prausnitzii, which led to a decrease in the expression level of Foxp3+ mRNA and an increase in RORyt+, respectively. However, administration of B. fragilis to animals receiving S. Enteritidis or S. Typhimurium against pretreatment with vancomycin caused a decrease in the level of SFB and mRNA RORyt+, and, conversely, increased the number of Bacteroides—Prevotela group, A. muciniphila, Clostridium spp. clusters XIV, IV, F. prausnitzii and expression of Foxp3+ genes, which indicates the restoration of the homeostasis of the intestinal microbiome. The obtained results showed that B. fragilis can be successfully used in the treatment of inflammatory bowel diseases or diseases with impaired intestinal barrier function.

Кишечный микробиом участвует во многих физиологических процессах хозяина, способствует формированию и поддержанию иммунного гомеостаза за счет регулировки иммунных реакций, направленных на защиту от колонизации патогенами. Особую роль в дифференцировке различных субпопуляций Т-лимфоцитов играют сегментарные нитевидные бактерии (Segmented filamentous bacteria, SFB), способные индуцировать в кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани (КАЛТ) дифференцировку провоспалительных Thn-клеток, а представители рода Clostridium (cluster IV и XIVa) и Bacteroides fragilis (полисахарид A [PSA]) стимулируют образование Т-регуляторных клеток (Treg) и продукцию супрессорного цитокина IL-10. Важными метаболитами B. fragilis являются короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), которые способны активировать клетки КАЛТ через рецептор FFAR2. Уменьшение концентрации КЦЖК снижает численность Treg в кишечнике и нарушает баланс Th17/Treg. Эти изменения напрямую ведут к снижению уровня мРНК FFAR2, Foxp3 и повышению экспрессии RORyt в КАЛТ. Поэтому целью работы было определить уровень ключевых иммунорегуляторных бактерий в пристеночной микрофлоре кишечника крыс и его влияние на транскрипционную активность генов Foxp3 и RORyt в КАЛТ при сальмонелла-индуцированном воспалении и на фоне введения ванкомицина и B. fragilis. Для определения родовой и видовой принадлежности бактерий, а также их количества в микрофлоре крыс применяли метод полимеразной цепной реакции (ПЦР-РВ) с идентификацией их по генам 16S rDNA. Для изучения транскрипционной активности генов использовали метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЛР). В ходе эксперимента при введении животным ванкомицина и сальмонелл наблюдалось увеличение уровня SFB и уменьшение A. muciniphila, F.prausnitzii. Также при инфицировании крыс S. Enteritidis и S. Typhimurium на фоне предобработки ванкомицином отмечалось возрастание численности SFB на фоне выраженного уменьшения Bacteroides— Prevotela group, A. muciniphila, Clostridium spp. кластеров XIV, IV и F. prausnitzii, что приводило к уменьшению уровня экспрессии мРНК генов Foxp3+ и увеличению RORyt+ соответственно. Однако введение B. fragilis животным, получавшим S. Enteritidis или S. Typhimurium на фоне предобработки ванкомицином, обуславливало уменьшение уровня SFB и мРНК RORyt+ и, наоборот, увеличивало численность Bacteroides—Prevotela group, A. muciniphila, Clostridium spp. кластеров XIV, IV, F. prausnitzii и экспрессию генов Foxp3+, что свидетельствует о восстановлении гомеостаза кишечного микробиома. Полученные результаты показали, что B. fragilis может с успехом применяться при лечении воспалительных заболеваний кишечника или заболеваний с нарушением барьерной функции кишечника.

microbiomegut-associated lymphoid tissueSalmonellaVancomycinBacteroidesexpressionRT-PCRмикробиомкишечно-ассоциированная лимфоидная тканьсальмонеллаванкомицинбактероидыэкспрессияПЦР-РВ1. Букина Ю.В., Камышный А.М., Полищук Н.Н., Топол И.А. Сальмонелла-индуцированные изменения кишечной микробиоты и транскриптома генов иммунного ответа на фоне введения ванкомицина и Bacteroides fragilis // Патолопя. 2017. Т. 14, № 1 (39). С. 12-19.2. Agbor T.A., McCormick B.A. Salmonella effectors: important players modulating host cell function during infection. Cell Microbiol., 2011, vol. 13,pp. 1858-1869. doi: 10.1111/j.1462-5822.2011.01701.x3. Arpaia N., Campbell C., Fan X. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature, 2013, vol. 504, pp. 451-455. doi: 10.1038/nature127264. Atarashi K., Tanoue T., Ando M., Kamada N., Nagano Y. Th17 cell induction by adhesion of microbes to intestinal epithelial cells. Cell, 2015, vol. 163,pp. 367-380. doi: 10.1016/j.cell.2015.08.0585. Atarashi K., Tanoue T., Oshima K., Suda W., Nagano Y., Nishikawa H., Fukuda S., Saito T., Narushima S., Hase K. Treg induction by a rationally selected mixture of Clostridia strains from the human microbiota. Nature, 2013, vol. 500, pp. 232-236. doi: 10.1038/nature123316. Atarashi K., Tanoue T., Shima T., Imaoka A., Kuwahara T., Momose Y., Cheng G., Yamasaki S., Saito T., Ohba Y., Taniguchi T., Takeda K., Hori S., Ivanov I.I., Umesaki Y., Itoh K., Honda K. Induction of colonic regulatory T cells by indigenous Clostridium species. Science, 2011, vol. 331, pp. 337-341. doi: 10.1126/science.11984697. Behnsen J., Perez-Lopez A., Nuccio S.P., Raffatellu M. Exploiting host immunity: the Salmonella paradigm. Trends Immunol., 2015, vol. 36, pp. 112-120. doi: 10.1016/j.it.2014.12.0038. Breyner N.M., Michon C., de Sousa C.S., Vilas Boas P.B., Chain F., Azevedo V.A., Langella P., Chatel J.M. Microbial antiinflammatory molecule (MAM) from Faecalibacterium prausnitzii shows a protective effect on DNBS and DSS-induced colitis model in mice through inhibition of NF-kB pathway. Front. Microbiol., 2017, vol. 8:114. doi: 10.3389/fmicb.2017.001149. Bukina Yu.V., Varynskyi B.O., Voitovich A.V., Koval G.D., Kaplaushenko A.G., Kamyshnyi O.M. The definition of neutrophil extracellular traps and the concentration of short-chain fatty acids in salmonella-induced inflammation of the intestine against the background of vancomycin and bacteroides fragilis. Pathology, 2018, vol. 15, no. 1 (42), pp. 10—17.10. David L.A., Maurice C.F., Carmody R.N., Gootenberg D.B., Button J.E., Wolfe B.E. Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome. Nature, 2014, vol. 505, pp. 559—563. doi: 10.1038/nature1282011. Dubourg G., Lagier J.C., Armougom F., Robert C., Audoly G., Papazian L. High-level colonisation of the human gut by Verrucomicrobia following broad-spectrum antibiotic treatment. Int. J. Antimicrob. Agents, 2013, vol. 41, pp. 149—155. doi: 10.1371/journal.pone.009547612. Ferreira-Halder C.V., Faria A.V.S., Andrade S.S. Action and function of Faecalibacterium prausnitzii in health and disease. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol., 2017, vol. 6,pp. 643—648. doi: 10.1016/j.bpg.2017.09.01113. Feuerer M., Hill J.A., Kretschmer K., von Boehmer H., Mathis D., Benoist C. Genomic definition of multiple ex vivo regulatory T cell subphenotypes. Proc. Natl. Acad. Science USA, 2010, vol. 107, pp. 5919—5924. doi: 10.1073/pnas.100200610714. Furusawa Y., Obata Y., Fukuda S. Commensal microbe-derived butyrate induces the differentiation of colonic regulatory T cells. Nature, 2013, vol. 504, pp. 446—450. doi: 10.1038/nature1272115. Geuking M.B., Cahenzli J., Lawson M.A., Ng D.C., Slack E., Hapfelmeier S., McCoy K.D., Macpherson A.J. Intestinal bacterial colonization induces mutualistic regulatory T cell responses. Immunity, 2011, vol. 34, pp. 794—806. doi: 10.1016/j.immu-ni.2011.03.02116. Geva-Zatorsky N., Sefik E., Kua L., Pasman L., Tan T.G., Ortiz-Lopez A., Yanortsang T.B., Yang L., Jupp R., Mathis D., Benoist C., Kasper D.L. Mining the human gut microbiota for immunomodulatory organisms. Cell, 2017, vol. 168, no. 5, pp. 928943. doi: 10.1016/j.cell.2017.01.02217. Goto Y., Umesaki Y., Benno Y., Kiyono H. Epithelial glycosylation in gut homeostasis and inflammation. Nat. Immunol., 2016, vol. 17, no. 11, pp. 1244-1251. doi: 10.1038/ni.358718. Honda K., Littman D.R. The microbiome in infectious disease and inflammation. Annu. Rev. Immunol., 2012, vol. 30, pp. 759795. doi: 10.1146/annurev-immunol-020711-07493719. Hooper L.V., Littman D.R., Macpherson A.J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science, 2012, vol. 336, no. 6086, pp. 1268-1273. doi: 10.1126/science.122349020. Ivanov I.I., Atarashi K., Manel N., Brodie E.L., Shima T., Karaoz U., Wei D., Goldfarb K.C., Santee C.A., Lynch S.V., Tanoue T., Imaoka A., Itoh K., Takeda K., Umesaki Y., Honda K., Littman D.R. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell, 2009, vol. 139,pp.485-498. doi: 10.1016/j.cell.2009.09.03321. Keestra-Gounder A.M., Tsolis R.M., Baumler A.J. Now you see me, now you don’t: the interaction of Salmonella with innate immune receptors. Nat. Rev. Microbiol., 2015, vol. 13, pp. 206-216. doi: 10.1038/nrmicro342822. Korpela K., Flint H.J., Johnstone A.M., Lappi J., Poutanen K., Dewulf E. Gut microbiota signatures predict host and microbiota responses to dietary interventions in obese individuals. PLoS One, 2014, vol. 9 (6): e90702. doi: 10.1371/journal.pone.009070223. Lathrop S.K., Bloom S.M., Rao S.M., Nutsch K., Lio C.W., Santacruz N., Peterson D.A., Stappenbeck T.S., Hsieh C.S. Peripheral education of the immune system by colonic commensal microbiota. Nature, 2011, vol. 478, pp. 250-254. doi: 10.1038/nature1043424. Li J., Lin S., Vanhoutte P.M., Woo C.W., Xu A. Akkermansia muciniphila protects against atherosclerosis by preventing metabolic endotoxemia-induced inflammation in apoe-/-mice. Circulation, 2016, vol. 133, pp. 2434-2446. doi: 10.1038/nature1043425. Littman D.R., Rudensky A.Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell, 2010, vol. 140, pp. 845-858. doi: 10.1016/j.cell.2010.02.02126. Lopetuso L.R., Scaldaferri F., Petito V., Gasbarrini A. Commensal Clostridia: leading players in the maintenance of gut homeostasis. Gut Pathog, 2013, vol. 5(1): 23. doi: 10.1186/1757-4749-5-2327. Nagano Y., Itoh K., Honda K. The induction of Treg cells by gut-indigenous Clostridium. Curr. Opin. Immunol., 2012, vol. 24, pp. 392-397. doi: 10.1016/j.coi.2012.05.00728. Ochoa-Reparaz J., Mielcarz D.W., Wang Y., Begum-Haque S., Dasgupta S. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol., 2010, vol. 3, pp. 487-495. doi: 10.1038/mi.2010.2929. Ost K.S., Round J.L. Communication between the microbiota and mammalian immunity. Annu. Microbiol. Rev., 2018, vol. 72, pp. 399- 422. doi: 10.1146/annurev-micro-090817-06230730. Pickard J.M., Zeng M.Y., Caruso R., Nunez G. Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. Immunol. Rev, 2017, vol. 279, no. 1, pp. 70-89. doi: 10.1111/imr.1256731. Plovier H., Everard A., Druart C., Depommier C., Van Hul M., Geurts L., Chilloux J., Ottman N., Duparc T., Lichtenstein L., Myridakis A., Delzenne N.M., Klievink J., Bhattacharjee A., van der Ark K.C., Aalvink S., Martinez L.O., Dumas M.E., Maiter D., Loumaye A., Hermans M.P., Thissen J.P., Belzer C., de Vos W.M., Cani P.D. A purified membrane protein from Akkermansia muciniphila or the pasteurized bacterium improves metabolism in obese and diabetic mice. Nat. Med., 2017, vol. 1, pp. 107-113. doi: 10.1038/nm.423632. Quevrain E., Maubert M.A., Michon C., Chain F., Marquant R. Identification of an antiinflammatory protein from Faecalibacterium prausnitzii, a commensal bacterium deficient in Crohn’s disease. Gut, 2016, vol. 65, pp. 415-425. doi: 10.1136/gutjnl-2014-30764933. Round J.L., Mazmanian S .K. Inducible Foxp3+ regulatory T-cell development by a commensal bacterium of the intestinal microbiota. Proc. Natl. Acad. Science USA, 2010, vol. 107, pp. 12204-12209. doi: 10.1073/pnas.090912210734. Sano T., Huang W., Hall J.A., Yang Y., Chen A. An IL-23R/IL-22 circuit regulates epithelial serum amyloid A to promote local effector Th17 responses. Cell, 2015, vol. 163, pp. 381-393. doi: 10.1016/j.cell.2015.08.06135. Shin N.R., Lee J.C., Lee H.Y., Kim M.S., Whon T.W., Lee M.S. An increase in the Akkermansia spp. population induced by metformin treatment improves glucose homeostasis in diet-induced obese mice. Gut, 2014, vol. 63, pp. 727—735. doi: 10.1136/gutjnl-2012-30383936. Smith P.M., Howitt M.R., Panikov N. The microbial metabolites, short-chain fatty acids, regulate colonic Treg cell homeostasis. Science, 2013, vol. 341, no. 6145, pp. 569—573. doi: 10.1126/science.124116537. Sorini C., Cardoso R.F., Gagliani N., Villablanca E.J. Commensal bacteria-specific CD4+ T cell responses in health and disease. Front. Immunol., 2018, vol. 9:2667. doi: 10.3389/fimmu.2018.0266738. Tan T.G., Sefik E., Geva-Zatorsky N., Kua L., Naskar D., Teng F., Pasman L., Ortiz-Lopez A., Jupp R., Wu H.J. Identifying species of symbiont bacteria from the human gut that, alone, can induce intestinal Th17 cells in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2016, vol. 113, pp. 8141-8150. doi: 10.1073/pnas.161746011339. Telesford K.M., Yan W., Ochoa-Reparaz J., Pant A., Kircher C., Christy M.A., Begum-Haque S., Kasper D.L., Kasper L.H. A commensal symbiotic factor derived from Bacteroides fragilis promotes human CD39(+)Foxp3(+) T cells and Treg function. Gut Microbes,, 2015, vol. 6, pp. 234-242. doi: 10.1080/19490976.2015.105697340. Yang Y., Torchinsky M.B., Gobert M., Xiong H., Xu M. Focused specificity of intestinal TH17 cells towards commensal bacterial antigens. Nature, 2014, vol. 510, pp. 152-156. doi: 10.1038/nature1327941. Zheng Y., Valdez P.A., Danilenko DM., Hu Y., Sa S.M., Gong Q., Abbas A.R., Modrusan Z., Ghilardi N., de Sauvage F.J., Ouyang W. Interleukin 22 mediates early host defense against attaching and effacing bacterial pathogens. Nat. Med., 2008, vol. 14, pp. 282-289. doi: 10.1038/nm172042. Zhou L., Zhang M., Wang Y., Dorfman R.G., Liu H., Yu T., Chen X., Tang D., Xu L., Yin Y., Pan Y., Zhou Q., Zhou Y., Yu C. Faecalibacterium prausnitzii Produces butyrate to maintain Th17/Treg balance and to ameliorate colorectal colitis by inhibiting histone deacetylase. Inflamm. Bowel Dis., 2018, vol. 24, iss. 9, pp. 1926-1940. doi: 10.1093/ibd/izy182