Biological diversity and perspectives for therapeutic and diagnostic applications of mycobacteriophages in the Russian Federation

Full Text

Введение

Туберкулез и микобактериозы остаются значимыми инфекционными угрозами, ежегодно приводя к миллионам новых случаев заболевания, высоким показателям смертности и инвалидизации [39]. Ситуацию с туберкулезом, вызванным микобактериями туберкулезного комплекса, усугубляет распространение штаммов с множественной и широкой лекарственной устойчивостью, что снижает эффективность стандартной терапии [35]. В то же время микобактериозы осложняются отсутствием унифицированных и доказательно эффективных режимов антибиотикотерапии, а также природной резистентностью многих видов нетуберкулезных микобактерий к широкому спектру противомикробных препаратов [9, 11, 53, 55]. Дополнительные трудности связаны с лабораторной диагностикой: микобактерии характеризуются медленным ростом, а их видовая идентификация и определение лекарственной чувствительности требуют длительного времени и специализированных методик [9, 51]. В совокупности эти факторы формируют необходимость поиска новых подходов к контролю микобактериальных инфекций, включая высокоспецифичные диагностические инструменты и альтернативные стратегии лечения.

Особый интерес в этом контексте представляют микобактериофаги — вирусы, инфицирующие микобактерии. Впервые описанные в 1947 г., микобактериофаги стали объектом интенсивного изучения благодаря своей специфичности к различным видам микобактерий и значительному генетическому разнообразию [21, 25]. В последующие десятилетия были охарактеризованы ключевые модельные фаги, включая литический фаг D29 и умеренный фаг L5, сыгравшие важную роль в изучении механизмов лизиса, интеграции и взаимодействия фагов с клеточной стенкой микобактерий [19, 28]. Существенный прогресс был достигнут благодаря крупным исследовательским программам PHIRE и SEA-PHAGES, позволившим выделить более 14 000 новых фагов и секвенировать тысячи их геномов [24, 32]. Совокупность этих данных сформировала современную систему кластеризации микобактериофагов и создала основу для изучения их прикладного потенциала (рис. 1).

 

Рисунок 1. Ключевые достижения в изучении микобактериофагов

Figure 1. Historical breakthroughs in mycobacteriophage study

 

Попытки терапевтического применения микобактериофагов были предприняты еще в начале 1980-х гг. на модели инфекции M. tuberculosis у морских свинок [59]. Однако в последующие десятилетия это направление практически не развивалось из-за ограниченных знаний о спектре хозяев фагов, механизмах их действия и отсутствия стандартизированных подходов к оценке безопасности. Лишь с появлением современных генетических и биотехнологических инструментов фаговая терапия, включая терапию микобактериозов, получила новое развитие [37]. Важным событием стало опубликованное в 2019 г. сообщение о первом успешном применении микобактериофагов, в том числе генетически модифицированных, для лечения инфекции, вызванной Mycobacterium abscessus, у пациента с муковисцидозом [19] Этот клинический случай, впоследствии подтвержденный рядом других наблюдений, продемонстрировал реальную возможность использования фагов для лечения микобактериозов [16, 27, 43].

Параллельно с терапевтическими исследованиями развивались и фаг-ориентированные диагностические подходы. Первые методы, предложенные в 1997 г., были основаны на биологической амплификации литического фага D29 для обнаружения жизнеспособных клеток M. tuberculosis [42]. Впоследствии этот принцип лег в основу усовершенствованных тест-систем, в том числе с использование методов ПЦР [20, 56]. Параллельно формировался альтернативный подход, основанный на использовании репортерных фагов, несущих гены люциферазы или флуоресцентных белков, что обеспечивало быстрый считываемый сигнал при инфицировании клеток [8, 48]. В настоящее время стремительное развитие молекулярно-генетической диагностики существенно снизило интерес к фаг-ориентированным тестам, однако они до сих пор рассматриваются как перспективное дополнение к существующим инструментам.

Несмотря на значительный прогресс, использование микобактериофагов в диагностике и терапии по-прежнему ограничено рядом фундаментальных факторов. Так, абсолютное большинство (> 99%) известных фагов выделено с использованием единственного лабораторного штамма-хозяина M. smegmatis mc(2)155 — непатогенного, быстрорастущего штамма, генетически близкого к патогенным микобактериям [40, 58]. Такой подход приводит к недостатку данных о биологических свойствах фагов и ограничивает представления о реальном спектре их хозяев. Практически не исследована активность микобактериофагов против покоящихся (персистирующих) форм возбудителя, играющих важную роль в патогенезе туберкулеза, а также их способность проникать в эукариотические клетки для воздействия на внутриклеточно локализованные микобактерии. Существенным потенциальным ограничением является преобладание у микобактериофагов лизогенного жизненного цикла, сопряженного с интеграцией фаговой ДНК в геном бактерии, что создает риск горизонтального переноса генов. Кроме того, присутствие профага может индуцировать иммунитет к реинфекции родственными фагами и снижать эффективность последующих терапевтических вмешательств. Дополнительным фактором неопределенности остается географическая несбалансированность данных: существующие сведения о разнообразии микобактериофагов в основном получены в Северной Америке, тогда как в других регионах, включая Россию, характеристика местных фаговых популяций остается фрагментарной.

В Российской Федерации исследования микобактериофагов ведутся преимущественно в двух научных центрах: в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Национальный медицинский исследовательский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина» Федерального Медико-биологического Агентства. На базе ФГБУ «НМИЦ ФПИ» Минздрава России основной акцент сделан на прикладных аспектах использования микобактериофага D29 для разработки диагностических подходов, а также для экспериментальной терапии микобактериальных инфекций. В ФНКЦ ФХМ, напротив, ключевым направлением является выделение и характеристика новых микобактериофагов, включая определение их спектра хозяев, генетической организации и морфологических особенностей.

Разнообразие микобактериофагов

Все известные на сегодняшний день микобактериофаги относятся к хвостатым фагам с двухцепочечной ДНК [25]. Длина их геномов варьирует от 42 до 164 тыс. пар нуклеотидов (п.н.), составляя в среднем около 70 тыс. п.н. Содержание GC составляет от 56 до 69%, что в целом соответствует высоким значениям GC у большинства видов рода Mycobacterium. Геномы микобактериофагов имеют модульную организацию и выраженную мозаичность: каждый геном представляет собой комбинацию отдельных «блоков» (модулей), различающихся по происхождению и уровню гомологии. Значительная часть генов не имеет установленной функции, формируя крупный резервуар неизученного генетического разнообразия [26].

Согласно Actinobacteriophage Database (https://phagesdb.org) современная классификация микобактериофагов включает 40 кластеров, обозначенных буквами алфавита, 15 из которых разделены на субкластеры, а также 3 синглтона — фагов, не демонстрирующих достаточного уровня сходства ни с одной из существующих групп (рис. 2). Критерием для отнесения к кластеру служит доля общих генов: фаги, разделяющие более 35% генного содержимого, рассматриваются как представители одного кластера, тогда как фаги с меньшей степенью сходства образуют отдельные синглтоны [17]. При этом размеры кластеров существенно варьируют: от единичных изолятов в кластерах Y и Z до сотен представителей в кластерах A и B. Такая диспропорция, вероятно, отражает как реальные различия в распространенности отдельных линий микобактериофагов, так и выраженную неравномерность выборки природных образцов [49].

 

Рисунок 2. Глобальное разнообразие микобактериофагов

Figure 2. Global diversity of mycobacteriophages

Примечание. Филогенетическая сеть построена методом NeighborNet (SplitsTree6) на основе матрицы наличия-отсутствия генов (PIRATE v1.0.5). Для наглядности каждая таксономическая единица (кластер или субкластер) представлена не более чем четырьмя геномами. Бактериофаги, выделенные на территории Российской Федерации, подчеркнуты.

Note. The phylogenetic network was constructed using the NeighborNet method (SplitsTree6) based on a gene presence-absence matrix (generated with PIRATE v1.0.5). For clarity, each taxonomic unit (cluster or subcluster) is represented by no more than four reference genomes. Bacteriophages isolated within the territory of the Russian Federation are underlined.

 

Филогенетическая сеть построена методом NeighborNet (SplitsTree6) на основе матрицы наличия-отсутствия генов (PIRATE v1.0.5). Для наглядности каждая таксономическая единица (кластер или субкластер) представлена не более чем четырьмя референсными геномами. Новые фаги, описанные в данной работе, были включены в анализ сверх этого лимита для соответствующих кластеров.

Морфологически большинство микобактериофагов относятся к сифовирусам, характеризующимся длинными несократимыми хвостами и изометрическими икосаэдрическими головками. Отдельные группы (например, кластеры O, I и синглтон MooMoo) имеют головки вытянутой формы. Миовирусы с сократимыми хвостами представлены ограниченным числом геномных типов и относятся к кластерам C и AA [24]. Фаги с подовирусной морфологией (короткий неорганизованный хвост) среди микобактериофагов не выявлены, несмотря на их наличие у других актинобактерий, что, предположительно, связано с физическим барьером в виде сложной и толстой клеточной стенки микобактерий [25].

По типу жизненного цикла микобактериофаги делятся на литические и умеренные, при этом последние преобладают: фаги как минимум 21 кластера способны к лизогении или имеют умеренных представителей. Умеренные фаги, как правило, кодируют репрессор, обеспечивающий поддержание лизогенного состояния, и интегразу, опосредующую сайт-специфическую интеграцию фаговой ДНК в геном бактерии. Для некоторых представителей кластера A описаны экстрахромосомные профаги с системами parАВ вместо интегразы [61]. При этом в составе отдельных кластеров встречаются фаги, образующие прозрачные бляшки и ведущие себя как литические, но являющиеся производными умеренных фагов и утратившие, например, ген репрессора, как это показано для фага D29 субкластера A2 [18].

Первыми полноценно охарактеризованными микобактериофагами, выделенными на территории Российской Федерации, стали фаги Vic9 и Yasnaya_Polyana, описанные в двух независимых исследованиях (табл. 1). Фаг Vic9 (NCBI: PP526940.2) относится к субкластеру B2 — группе литических фагов с характерной сифовирусной морфологией и сравнительно консервативной геномной организацией [64]. Его геном длиной 67,5 тыс. п.н. содержит 89 открытых рамок считывания (ОРС) и демонстрирует высокий уровень сходства с другими фагами субкластера (более 97% идентичности по нуклеотидной последовательности с фагом Godines [NC_042050]). Одновременно Vic9 имеет ряд уникальных особенностей, таких как вставка длиной 435 п.н. в кластере генов синтеза квеозина и рекомбинация в структурном модуле, что подчеркивает генетическую вариабельность даже в пределах близкородственных фагов кластера.

 

Таблица 1. Таксономические и геномные характеристики российских изолятов микобактериофагов

Table 1. Taxonomic and genomic characteristics of Russian mycobacteriophage isolates

Фаг Phage	Кластер/ субкластер Cluster/subcluster	Предсказанный жизненный цикл фага на основании принадлежности к кластеру* Life cycle prediction inferred from cluster membership*	Длина генома, п.н. Genome length, bp	Количество открытых рамок считывания Number of open reading frames	Количество генов tRNA Number of tRNA genes	GC%
G2-B	A/A2	лизогенный temperate	51396	84	1	63,4
Cat**	A/A3	лизогенный temperate	48360	77	1	63,6
G1-d	A/A3		46587	76	2	63,8
G1-Х	A/A3		45703	72	1	63,9
KB	A/A3		46729	74	1	63,8
Sheep	A/A3		46641	74	1	63,8
Vic9**	B/B2	литический lytic	67543	89	–	69,0
С4	F/F3	лизогенный temperate	57090	95	–	61,5
Yasnaya_Polyana**	K/K4	лизогенный temperate	57979	94	1	67
Ground-B			57682	94	1	67.9
Duck2	M1	лизогенный temperate	80948	137	19	61,6
Ground-D	P1	лизогенный temperate	46983	75	–	67,2
Ksenia**	S	литический lytic	65635	110	–	63,4
Аrbat	Singleton	н/д n/d	108989	195	22	63
Nadezda**	Y	лизогенный temperate	75356	125	2	65

Примечание. *Представления о типе жизненного цикла фагов, принадлежащих к кластеру, основываются на экспериментальных данных, подтверждающих получение настоящих лизогенов, по крайней мере, для некоторых фагов в этом кластере. Тем не менее случайные события (утрата генов лизогении) может приводить к появлению литических фагов в составе лизогенного кластера. **Фаги, депонированные в международную базу данных NCBI: Cat (PQ642456), Nadezda (PQ495709), Ksenia (PQ736089), Yasnaya_Polyana (PQ495710), Vic9 (PP526940.2).

Notes. *Predictions regarding the lifecycle type (temperate vs virulent) for phages within a given cluster are based on experimental evidence demonstrating true lysogeny establishment for at least some cluster members. Nevertheless, stochastic events, such as the loss of lysogeny-related genes, can result in the emergence of phages with a lytic phenotype even within a cluster classified as lysogenic. **Phages deposited in the international database NCBI: Cat (PQ642456), Nadezda (PQ495709), Ksenia (PQ736089), Yasnaya_Polyana (PQ495710), Vic9 (PP526940.2).

 

Второй охарактеризованный изолят, Yasnaya_Polyana (PQ495710), принадлежит к субкластеру K4 [57]. Фаги этой группы относятся к умеренным и способны инфицировать как быстро-, так и медленнорастущие микобактерии. Геном фага Yasnaya_Polyana (57,9 тыс. п.н., 94 ОРС) также продемонстрировал высокий уровень сходства с другими представителями K4 (более 98% идентичности с фагом Malthus [MN369761]). При этом показано, что фаг Yasnaya_Polyana, как и другие фаги субкластера K4, имеет специфические особенности в организации регуляторных элементов, включая редуцированное содержание SAS/ESAS-мотивов и специфические варианты этих элементов.

Помимо опубликованных фагов, в ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина ФМБА России были выделены еще 13 микобактериофагов, распределенных по восьми кластерам (A2, A3, F1, K4, M1, P1, S, Y), а также один синглтон (Arbat) (табл. 1). Их распределение по кластерам в целом соответствует мировым данным и характеризуется преобладанием умеренных фагов. Исключения составляют фаг Ksenia (кластер S), относящийся к группе вирулентных фагов и лишенный модуля интеграции, и фаг Arbat, для которого тип жизненного цикла не определен.

Большинство фагов представляют собой сифовирусы с икосаэдрическими головками, что является типичным для микобактериофагов. Исключением является фаг Nadezda, для которого характерна вытянутая форма головки, что согласуется с данным Actinobacteriophage Database для фагов кластера Y. Морфология вирионов фага Arbat не уточнена.

Морфология бляшек выделенных фагов демонстрирует значительную вариабельность. Наиболее мелкими бляшками (1–2 мм в диаметре) характеризуются изоляты кластеров F, M и P, а также синглтон Arbat. Фаг Vic9 (субкластер B2) формирует бляшки среднего размера (до 3 мм) с мутным центром. Для представителей субкластеров A3 и K4, в свою очередь, характерно образование крупных бляшек (5–7 мм) с выраженными мутными кольцами, что не является универсальным признаком для всех фагов этих групп. Наибольший размер бляшек демонстрирует фаг Ksenia (кластер S) — до 8 мм в диаметре с двойным кольцом, что существенно отличает его от других представителей данного кластера, обычно образующих мелкие бляшки.

Геномный анализ выявил заметную вариабельность как в размерах геномов, так и в уровне GC-состава, при этом все значения укладываются в диапазоны, характерные для соответствующих кластеров. Особый интерес представляют микроэволюционные различия внутри фагов субкластера A3: фаги KB и Sheep сохраняют полноценный интеграционный модуль, тогда как изоляты Cat, G1-X и G1-d содержат частичные или полные делеции генов репрессора и/или интегразы, что свидетельствует о переходе от умеренного к потенциально вирулентному фенотипу. Подобные делеции ранее описаны для D29 [18], что указывает на активные эволюционные процессы в локальных популяциях микобактериофагов.

Отдельного внимания заслуживает фаг Arbat, демонстрирующий крайне низкий уровень сходства с известными микобактериофагами и обладающий крупнейшим геномом. Эти особенности делают его перспективным объектом для дальнейшего структурного и функционального анализа.

Фаготерапия при микобактериальной инфекции

Несмотря на значительное таксономическое разнообразие микобактериофагов, выявленное на модельном микроорганизме M. smegmatis, лишь ограниченная их часть обладает активностью в отношении M. tuberculosis и других клинически значимых микобактерий. Наиболее изученными фагами, способными эффективно лизировать M. tuberculosis, являются представители кластеров G, K и AB, а также субкластеров A2 и A3 кластера A [22, 33]. При этом большинство этих фагов, за исключением представителей кластера AB, характеризуются лизогенным жизненным циклом, что ограничивает их прямое терапевтическое применение.

Ограниченность природных литических фагов, активных против патогенных микобактерий, определяет необходимость применения двух взаимодополняющих стратегий: создание фаговых коктейлей и получение литических производных умеренных фагов методами генной инженерии [22]. Комбинирование нескольких генетически различающихся фагов в коктейль позволяет одновременно взаимодействовать с разными мишенями на поверхности микобактерий, снижая вероятность возникновения резистентности и обеспечивая устойчивый литический эффект. Для формирования таких коктейлей учитываются спектры литической активности, профили перекрестной резистентности и комплементарность механизмов инфицирования [34].

Второй ключевой подход заключается в целенаправленном получении литических производных от умеренных фагов. Наиболее отработанной и широко применяемой технологией для этой цели является метод BRED (Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA), позволяющий проводить сайт-специфические генетические модификации, в том числе удаление генов репрессора или интегразы [41]. Реализация таких целевых изменений переводит умеренные фаги в литическое состояние при сохранении их исходной специфичности к патогенным микобактериальным видам. За последние годы с использованием BRED было создано несколько литических вариантов фагов кластеров K и A, продемонстрировавших высокую активность против микобактерий, включая штаммы с множественной лекарственной устойчивостью [14, 46].

Одним из примеров практической реализации этого подхода является полученный в России литический вариант фага Yasnaya_Polyana [57]. Модифицированный фаг YPΔ47 был получен путем удаления гена репрессора, контролирующего поддержание лизогении, что привело к резкому снижению частоты образования лизогенов с 18 до 0,0096% и формированию стабильного литического фенотипа. При этом YPΔ47 сохранил высокую активность против M. tuberculosis, включая клинические изоляты, устойчивые к бедаквилину, деламаниду и линезолиду, что подчеркивает терапевтический потенциал генетически модифицированных фагов кластера K.

Эффективность подходов, основанных на комбинировании фагов и использовании модифицированных изолятов, подтверждается накопленными клиническими данными. Хотя большинство успешных случаев применения относятся к инфекциям, вызванным нетуберкулезными микобактериями, полученные результаты дают важное представление о терапевтическом потенциале микобактериофагов и принципах их рационального использования.

Первый документально подтвержденный случай фаготерапии при диссеминированной инфекции, вызванной M. abscessus, продемонстрировал клиническую эффективность и отсутствие побочных эффектов при внутривенном введении коктейля, состоящего из трех фагов (Muddy, BPs33ΔHTH-HRM10, ZoeJΔ45) [15]. При этом фаги BPs33ΔHTH-HRM10 и ZoeJΔ45 представляли собой литические производные от лизогенных предшественников (табл. 2).

 

Таблица 2. Примеры фаготерапии микобактериозов

Table 2. Examples of mycobacteriosis phage therapy

Фаг Phage	Микобактерия-мишень Target mycobacterium	Сопутствующее заболевание Comorbid condition	Результат терапии Treatment result	Ссылка Reference
Muddy, BPs33ΔHTH-HRM10, ZoeJΔ45	M. abscessus	Муковисцидоз, микобактериоз на фоне иммуносупрессивной терапии, состояние после трансплантации легких Cystic fibrosis, mycobacteriosis in the setting of immunosuppressive therapy, post-lung transplant status	Закрытие очагов кожных поражения, улучшение функций печени The treatment resulted in the resolution of skin lesions and improved liver function	[15]
Muddy, BPs33ΔHTH-HRM10, ZoeJΔ45		Иммунокомпетентный пациент с бронхоэктатической болезнью A case of bronchiectasis in an immunocompetent patient	К концу лечения наблюдался выраженный нейтрализующий иммунный ответ, терапия неэффективна By the end of treatment, a pronounced neutralizing immune response was observed; however, the therapy was ineffective	[13]
BPsΔ33HTH_HRM10, D29_HRM		Муковисцидоз Cystic fibrosis	Значительное улучшение, несмотря на появление антител к одному из фагов Notable improvement occurred irrespective of seroconversion to one phage	[43]
Muddy		Серонегативный артрит, иммуносупрессивная терапия Seronegative arthritis on immunosuppression	Заживление поражений кожи Healing of skin lesions	[38]
Muddy, BPsΔ33 HTH_HRM10		Идиопатический легочный фиброз, состояние после трансплантации легких, остеомиелит Idiopathic pulmonary fibrosis, post-lung transplantation status, osteomyelitis	Отмечен положительный ответ на фаготерапию в сочетании с антибиотиками Positive response to phage–antibiotic combination	[10]
Muddy, BPs33ΔHTH-HRM10, ZoeJΔ45, D29_HRM GD40, D29_HRM GD40		17 пациентов с диагнозами: муковисцидоз (n = 12) и/или состояние после трансплантации легких (n = 4), бронхоэктатическая болезнь легких (n = 1) 17 patients with the following diagnoses: cystic fibrosis (n = 12), post-lung transplantation status (n = 4), and bronchiectasis (n = 1)	Нет ответа на терапию — 4 пациента, сомнительный ответ — 5 пациентов, положительный ответ — 8 пациентов Response to therapy: no response (n = 4), equivocal response (n = 5), positive response (n = 8)	[16]
		Серонегативный артрит, иммуносупрессивная терапия Seronegative arthritis on immunosuppression	Положительный ответ Positive response
		EDIT2	Положительный ответ Positive response
		Муковисцидоз Cystic fibrosis	Положительный ответ Positive response

 

Несмотря на первоначальный успех, дальнейшие исследования применения бактериофагов для лечения инфекций, вызванных M. abscessus, показали существование ряда ограничений. Так, значительное влияние на эффективность терапии оказывал морфотип бактерий. Чувствительность к фагам демонстрировали преимущественно шероховатые морфотипы (~80% случаев), тогда как гладкие чаще сохраняли резистентность [17]. Несмотря на это, фаготерапия может способствовать позитивному исходу. Например, в 2024 г. при лечении тяжелой, резистентной к антибиотикам инфекции, вызванной смесью морфотипов M. abscessus, фаговая терапия оказала синергическое действие с меропенемом, приведя к улучшению состояния пациента [10].

Другим существенным ограничением подхода являлась индукция нейтрализующих антител у иммунокомпетентных пациентов. В одном из клинических случаев отмечена полная нейтрализация фагового коктейля через два месяца внутривенного введения, несмотря на сохранение у возбудителя чувствительности к фагу [13]. Последующая аэрозольная доставка обеспечила недолговременный клинический ответ с последующим рецидивом [12]. Однако в отдельных случаях эрадикация возбудителя возможна даже при развитии иммунного ответа. Так, при лечении инфекции, вызванной M. abscessus у 26-летнего пациента с муковисцидозом, 18-месячная внутривенная фаготерапия в комбинации с антибиотиками позволила устранить инфекцию, несмотря на иммунологическую нейтрализацию одного компонента коктейля, что создало условия для успешной трансплантации легких [43]. Полученные данные указывают на необходимость дальнейшего изучения иммуногенности фаговых препаратов и оптимизации режимов их введения.

Положительные результаты фаготерапии продемонстрированы и при инфекциях, вызванных другими нетуберкулезными микобактериями. Так, в случае диссеминированной кожной инфекции, вызванной Mycobacterium chelonae, у пациента с серонегативным артритом комбинированное лечение (фаги + антибиотики + хирургическая санация) привело к значительному регрессу кожных поражений. Биопсия через 2 и 5 месяцев подтвердила отсутствие гистопатологических признаков инфекции. Важно, что в течение 6 месяцев внутривенного введения фага не наблюдалось ни снижения эффективности, ни серьезных побочных реакций, несмотря на потенциальные риски развития резистентности или нейтрализующих антител [38].

Более масштабные данные были получены в исследовании 2023 г. с участием 20 пациентов с лекарственно-устойчивыми инфекциями, вызванными M. abscessus, M. chelonae, M. avium и M. bovis BCG [16]. При режиме дозирования 10¹⁰ БОЕ дважды в сутки благоприятный клинико-микробиологический ответ был достигнут у 55% пациентов. Серьезные побочные эффекты и развитие резистентности к фагам отсутствовали даже при использовании монофаговой терапии. У 40% пациентов (8 из 20) были зафиксированы антитела к применяемым фагам, однако наличие иммунного ответа не коррелировало с клиническими исходами, подтверждая, что образование антител не всегда приводит к потере эффективности лечения.

Несмотря на представленные успехи терапии инфекций, вызванных нетуберкулезными микобактериями, данные относительно клинической эффективности фаготерапии в отношении M. tuberculosis остаются крайне ограниченными. На сегодняшний день отсутствуют документально подтвержденные случаи целенаправленной фаготерапии легочного туберкулеза у человека. Это связано с рядом фундаментальных ограничений, ключевыми среди которых являются внутриклеточная локализация возбудителя, затрудняющая доступ фагов, наличие плотной клеточной стенки, снижающей эффективность инфицирования, а также формирование специфических гранулематозных структур, создающих физический и иммунологический барьер для терапевтических агентов. Таким образом, несмотря на обнадеживающие результаты доклинических исследований, переход фаготерапии туберкулеза в область клинической практики требует преодоления этих препятствий.

Решением данной проблемы может стать разработка новых методов доставки фагов. Одним из перспективных вариантов является использование в качестве средства доставки непатогенной бактерии M. smegmatis. Данный штамм способен выполнять несколько ключевых функций в рамках фаговой терапии: выступать в роли носителя, проникающего в макрофаги и обеспечивающего транспортировку фага к M. tuberculosis; служить хозяином при размножении фага, увеличивая число фаговых частиц и повышая эффективность инфицирования целевых бактерий [6]. Недостатками данного подхода являются его потенциальная иммуногенность, риск горизонтального переноса генов, а также дополнительные сложности, связанные с применением живого бактериального носителя. Другим подходом является инкапсуляция фага в липосомы, которая позволяет преодолеть иммунологические барьеры и повысить эффективность его проникновения в инфицированные макрофаги [44].

В Российской Федерации также достигнуты определенные успехи в разработке фаговых препаратов для лечения туберкулеза, в частности, созданы и экспериментально обоснованы липосомальные формы микобактериофагов [1]. Исследования продемонстрировали, что инкапсуляция фага D29 в липосомы размером 400 нм существенно повышает его терапевтическую эффективность. Количественная ПЦР в реальном времени показала, что проникновение липосомальной формы в инфицированные макрофаги в 6,7 раз превышает аналогичный показатель для свободного фага (8,4 × 10⁶ против 1,1 × 10⁶) [1]. На модели туберкулезной гранулемы, сформированной из мононуклеарных клеток периферической крови человека, липосомальный препарат фага D29 полностью подавлял рост M. tuberculosis, тогда как свободный фаг лишь ограничивал его, допуская образование многочисленных мелких колоний [4]. В экспериментах на мышах линии C57BL/6, инфицированных вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv, интраназальное введение липосомальной формы фага D29 вызывало выраженный антимикобактериальный эффект, что было подтверждено гистологически [4]. Схожие результаты были продемонстрированы и против клинического изолята M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью: терапия вызывала снижение числа колониеобразующих единиц в легких инфицированных мышей на три порядка по сравнению с контролем [5]. Важно отметить, что очищенный препарат микобактериофага D29 не оказывал токсического действия на культуру макрофагов RAW 264.7 [36]. Данные in vivo также подтверждают его благоприятный профиль безопасности: в исследованиях на мышах не было выявлено признаков острой или хронической токсичности даже при введении доз, значительно превышающих терапевтические [5]. В совокупности эти результаты позволяют рассматривать липосомальные формы микобактериофагов как перспективный препарат для эндобронхиального введения пациентам с туберкулезом легких, особенно в случаях лекарственной устойчивости возбудителя.

Микобактериофаги в диагностике

Диагностические методы с применением бактериофагов исторически развивались по двум направлениям: тесты биологической амплификации фагов (от англ. phage amplified biologically, PhAB) и анализы с использованием фаговых репортеров (от англ. phage reporter assays, PRA). Оба подхода опираются на ключевое свойство микобактериофагов — способность размножаться только в жизнеспособных, метаболически активных клетках микобактерий, что позволяет использовать их для фенотипической оценки жизнеспособности и лекарственной чувствительности возбудителя.

В методе PhAB после короткой инкубации бактериальной культуры с фагом внеклеточные вирионы полностью инактивируются, тогда как фаговое потомство, образовавшееся внутри живых клеток, сохраняется и подлежит детекции. Этот принцип был впервые описан Wilson et al. в 1997 г., став основой коммерческой системы FASTPlaqueTB™ (Biotec Laboratories Ltd.) [62]. Позднее появились модификации для определения лекарственной устойчивости (FASTPlaqueRIF™, FASTPlaqueTB-MDR™, FASTPlaqueTB-Response™), где жизнеспособность микобактерий оценивается по способности к поддержанию фаговой репликации в присутствии антибиотика. Благодаря сочетанию высокой чувствительности, короткого времени анализа и низкой стоимости такие тесты стали востребованной альтернативой молекулярным методам в странах с низким и средним уровнем дохода. Кроме того, фаговые PhAB-подходы были успешно адаптированы и для диагностики других видов микобактерий [45].

Варианты детекции в PhAB-методах включают три основных подхода. Наиболее ранним является культуральная регистрация фаговой репликации по образованию бляшек, использованная, в частности, в системе FASTPlaqueTB™ [45]. Позднее был разработан комбинированный подход Phage-PCR, в котором фаговый лизис используется для освобождения микобактериальной ДНК с последующей ПЦР-идентификацией. Его усовершенствованная коммерческая версия Actiphage^® позволяет проводить прямое ПЦР-обнаружение ДНК из лизированных фагами микобактерий без культурального этапа, что сокращает время анализа до нескольких часов [60]. Третье направление основано на количественной ПЦР по фаговой ДНК (qPCR-PhAB), где прирост фагового генетического материала служит высокочувствительным фенотипическим индикатором жизнеспособности и лекарственной чувствительности M. tuberculosis [8, 47].

Второе направление фаговой диагностики связано с использованием репортерных фагов, в которых микобактериофаги служат носителями генов, кодирующих детектируемый сигнал. Наиболее разработанной группой являются люциферазные репортерные фаги (от англ. luciferase reporter phages, LRP), содержащие ген люциферазы светлячка. После инфицирования жизнеспособных микобактерий происходит экспрессия люциферазы, и при добавлении люциферина регистрируется люминесценция, величина которой напрямую отражает метаболическую активность клеток. Противотуберкулезные препараты, подавляющие синтез АТФ, блокируют экспрессию люциферазы, что позволяет использовать LRP для фенотипического определения лекарственной устойчивости [23]. Первые LRP-системы, использующие фаг phAE40, обладали ограниченной чувствительностью (не менее 10⁴ клеток/мл), однако последующие модификации, включая фаги на основе D29 и TM4, обеспечили расширение спектра хозяев, включая M. tuberculosis, и улучшение аналитических характеристик [45, 52].

Более современным вариантом PRA стали флуоромикобактериофаги, доставляющие в микобактерии гены флуоресцентных белков (gfp, ZsYellow, mCherry) [48, 63]. Эти системы обеспечивают более высокую чувствительность (до < 100 клеток/мл), позволяют визуализировать отдельные инфицированные клетки и выявлять лекарственно-устойчивые субпопуляции в смешанных образцах. Дополнительным преимуществом является отсутствие необходимости в экзогенных субстратах и возможность фиксации образцов, что повышает биобезопасность и упрощает транспортировку. Несмотря на то, что методы на основе PRA требуют специализированного оборудования (проточная цитометрия или флуоресцентная микроскопия), внедрение светодиодных флуоресцентных систем сделало их потенциально доступными для лабораторий с ограниченными ресурсами. Тем не менее, в отличие от PhAB-тестов, PRA пока остаются преимущественно исследовательским инструментом и не получили широкого клинического распространения [45].

В Российской Федерации также разработан собственный вариант qPCR-PhAB-подхода. Тест «ТБ-фаг-ЛЧ», созданный на базе ФГБУ «НМИЦ ФПИ» Минздрава России, использует литический микобактериофаг D29 для фенотипического определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis [2]. Метод адаптирован для рутинной лабораторной практики и демонстрирует высокое соответствие традиционным культуральным тестам: совпадение результатов с методом на среде Левенштейна–Йенсена составило 90,9% для препаратов первого ряда и 87% для препаратов второго ряда, а с системой Bactec MGIT — 96%. Существенным преимуществом является короткое время анализа (4 дня), крайне низкая себестоимость (около 150 рублей за тест), а также возможность изменять спектр тестируемых антибиотиков. Фаговый препарат сохраняет стабильность при хранении при 4°C до 10 месяцев, что дополнительно повышает практическую применимость технологии [3].

Заключение и перспективы использования микобактериофагов в России

Благодаря усилиям научного сообщества, прежде всего коллектива под руководством Грэма Хэтфула, микобактериофаги стали одной из наиболее изученных групп бактериофагов. Обширная коллекция фагов, ее таксономическое разнообразие и сформированные базы данных создали прочную основу для перехода от накопления знаний к практическому применению. На этом фоне в последние годы наблюдается устойчивый рост числа исследований, посвященных использованию микобактериофагов не только в терапии и диагностике, но и в молекулярной биологии. Такая динамика отражает как уникальные свойства самих фагов, так и особенности микобактерий — их медленный рост, устойчивость к антибиотикам и высокую клиническую значимость. Все это подтверждает, что интерес к микобактериофагам не случаен, а опирается на реальные потребности и научную обоснованность, открывая широкие перспективы для дальнейшего развития этого направления.

Среди возможных направлений практического применения микобактериофагов терапия в настоящее время выглядит наиболее перспективной и активно развивающейся. Успешные единичные примеры лечения микобактериозов за рубежом демонстрируют реальность клинического применения фагов и одновременно обозначают существующие ограничения, которые важно учитывать при масштабировании подхода [16]. Этот накопленный опыт представляет особую ценность для отечественной науки и может быть использован при формировании собственных клинических стратегий. В то же время туберкулез остается одним из немногих направлений, где фаготерапия пока не получила клинической реализации, что делает вклад российских разработок особенно значимым [4]. Именно в этом сегменте, вероятно, существует реальная возможность выйти на международный уровень первыми.

Для успешного внедрения фаговой терапии необходимо комплексное решение целого ряда научных, технологических и регуляторных задач [56]. На первом этапе стоит задача рационального отбора эффективных фагов: несмотря на тысячи изолятов, высокую активность против клинически значимых микобактерий демонстрируют лишь представители отдельных кластеров. Наиболее перспективным подходом остается создание фаговых коктейлей, способных не только повысить эффективность терапии, но и снизить риск формирования устойчивости — данное направление уже развивается в России. Важной задачей остается и выбор оптимального пути введения фагов: в зависимости от локализации инфекции это может быть внутривенное, местное или ингаляционное применение. Перспективными также считаются липосомальные формы доставки и использование модифицированных, в том числе невирулентных, фагов. Дополнительную сложность представляет феномен резистентности, включая как природную или приобретенную устойчивость бактерий, так и индукцию нейтрализующих антител со стороны иммунной системы. Наконец, одной из ключевых проблем остаются регуляторные ограничения: в настоящее время нормативная база в России практически не предусматривает широкое применение индивидуализированных фаговых препаратов, что сдерживает клиническую реализацию даже при наличии научных и технологических предпосылок.

Диагностическое применение микобактериофагов продолжает оставаться важным и перспективным направлением, особенно в контексте поиска недорогих, быстрых и фенотипически ориентированных методов выявления микобактериальных инфекций. Несмотря на то что в последние годы опубликовано множество исследований, посвященных фагодиагностике, ее внедрение в рутинную практику все еще ограничено рядом объективных факторов [45, 56]. Среди них — необходимость работы с живыми микобактериями, потенциальная неспецифичность большинства фагов, непостоянство выхода фаговых частиц из зараженных клеток, нестабильность детекции низких концентраций бактерий, а также конкуренция со стороны автоматизированных молекулярных тестов, уже широко внедренных в здравоохранение. Однако фаговые тесты обладают рядом уникальных преимуществ: они способны определять жизнеспособность клеток, обладают высокой чувствительностью при низкой себестоимости и не требуют сложного оборудования, что делает их особенно актуальными для применения в условиях с ограниченными ресурсами. Развитие таких направлений, как qPCR по фаговой ДНК, колориметрические варианты детекции, использование магнитных носителей для повышения эффективности заражения и стандартизация методик, открывает возможности преодоления существующих ограничений. В российском контексте, где фокус сделан на молекулярную диагностику, фаговые подходы пока не получили широкого применения, однако опыт разработки отечественных тестов (например, ТБ-фаг-ЛЧ) подтверждает наличие потенциала в этой области. В перспективе фагодиагностика может занять свою нишу в дополнение к существующим методам, особенно при необходимости фенотипической верификации, в условиях ограниченного доступа к современным ПЦР-системам или в задачах оперативного тестирования лекарственной чувствительности.

Таким образом, бактериофаги — это инструмент с огромным потенциалом, способный произвести революцию в лечении и диагностике бактериальных инфекций. Их уникальные свойства, такие как специфичность действия, способность уничтожать биопленки и адаптация к изменяющимся условиям, делают их перспективной альтернативой в условиях растущей проблемы устойчивости к антибиотикам. Разработка технологий производства, стандартизация процедур и дальнейшие клинические испытания имеют решающее значение для полной реализации их потенциала в здравоохранении по всему миру.

About the authors

Marina V. Zaychikova

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Author for correspondence.
Email: marinaz15@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5016-2089

PhD (Biology), Researcher, Laboratory of Molecular Genetics of Microorganisms

Russian Federation, Moscow

Vadim V. Avdeev

National Medical Research Center for Phthisiopulmonology and Infectious Diseases, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: Vadim.avdeev@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-4769-5933
SPIN-code: 1559-2376

Researcher, Research Laboratory of Immunopathology and Immunodiagnostics of Tuberculosis Infection

Russian Federation, Moscow

Sofya M. Kuznetsova

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Email: sofya.kuznetsova.2001@list.ru

Research Laboratory Assistant, Laboratory of Molecular Genetics of Microorganisms

Russian Federation, Moscow

Maja V. Malakhova

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Email: maja_m@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7510-163X

PhD (Biology), Researcher, Laboratory of Molecular Genetics of Microorganisms

Russian Federation, Moscow

Egor A. Shitikov

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Email: eshitikov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4865-6004

DSc (Biology), Head of the Laboratory of Molecular Genetics of Microorganisms

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files