Impaired vascular endothelium functional properties during the acute phase of influenza A(H3N2) virus-induced infection

Full Text

Введение

Вирусы гриппа (ВГ) ежегодно становятся причиной инфицирования 5–15% всего населения, вызывая до 5 млн случаев тяжелого течения заболевания и обуславливая до 650 тыс. летальных исходов [20].

В этиологической структуре гриппозной инфекции ведущая роль принадлежит вирусам гриппа А (ВГА) подтипов H1N1 и Н3N2, которые обладают более высокой вирулентностью по сравнению с ВГ типа В и чаще ассоциированы с тяжелым течением гриппа. В свою очередь, при тяжелых формах гриппа нередко диагностируют осложнения со стороны сердечно-сосудистой системы, включая развитие различных аритмий, миокардита, ишемии и инфаркта миокарда, перикардита, кардиомиопатии [10, 11, 18]. Генез данного рода осложнений связан с эндотелиотропностью ВГА.

Так, многочисленные исследования in vitro указывают на тот факт, что ВГА способны инфицировать и поражать клетки эндотелия кровеносных сосудов, экспрессирующие на своей поверхности сиаловые кислоты с α2–6- и α2–3-гликозидной связью — специфические рецепторы для адсорбции вируса [3, 7, 20]. В ходе репродукции ВГА оказывает на клетки цитопатическое действие, тем самым значительно изменяя морфофункциональные свойства эндотелиоцитов (in vitro). В частности, со стороны инфицированных клеток регистрируют изменение морфологии, снижение метаболических процессов, модуляцию экспрессии ряда специфичных для эндотелия белков, участвующих в регуляции сосудистого тонуса, процессов коагуляции и фибринолиза, воспалительной реакции и других процессов [4, 21].

В свою очередь, в исследованиях in vivo было показано, что ВГ A(H1N1)pdm09 также способен инфицировать и поражать эндотелий кровеносных сосудов легких (на локальном уровне), а также опосредованно приводить к активации эндотелиоцитов и нарушению функциональной активности кровеносных сосудов брыжейки крыс стока Вистар (системный уровень). В частности, у животных, инфицированных ВГ A(H1N1)pdm09, выявляли изменение экспрессии ряда эндотелиальных факторов, регулирующих сосудистый тонус (eNOS), а также систему фибринолиза (PAI-1) [13].

Так как эпидемиологические данные указывают на более тяжелый характер эпидемического процесса в сезоны с преимущественной циркуляцией ВГ А(H3N2) [12], представляло интерес изучить влияние данного подтипа ВГ на эндотелий кровеносных сосудов в эксперименте.

Цель — изучить влияние вируса гриппа A(H3N2) на морфофункциональные свойства клеток эндотелия кровеносных сосудов крыс в остром периоде нелетальной инфекции.

Материалы и методы

Лабораторные животные. В данном исследовании были использованы 15 крыс-самцов линии Вистар (возраст 4–5 недель; вес 180–210 г). Содержание животных осуществляли в отдельном помещении с использованием фиксированного свето-темнового режима (свет : темнота — 12 : 12 ч). Пищевой рацион полностью соответствовал нормативам питания для данного типа лабораторных животных.

Работу с крысами проводили на базе вивария ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России согласно рекомендациям Коллегии Евразийской экономической комиссии «О руководстве по работе с лабораторными (экспериментальными) животными при проведении доклинических (неклинических) исследований». Протокол исследования был одобрен комиссией по биоэтике ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России (№ 13 от 17.07.2023 и № 31 от 21.10.2024 г.).

Вирус гриппа. В исследовании был использован адаптированный к крысам ВГ А/Port Chalmers/1/1973 (H3N2), чья инфекционная активность составляла 6,5 lg ЭИД₅₀/мл, а титр в РГА — 1:2048.

Экспериментальная гриппозная инфекция. Крыс из двух экспериментальных групп (n = 5) помещали в камеру для наркотизации и воздействовали севофлураном (Abbot Laboratories, Великобритания) с последующим интраназальным заражением исследуемым вирусом в объеме 0,1 мл. Из эксперимента животных выводили через 1 и 4 дня после инфицирования. В свою очередь, в контрольную группу входили крысы (n = 5), которым после наркотизации интраназально вводили 0,1 мл среды DMEM (Биолот, Россия) с выведением из опыта через 1 день. Животных ежедневно взвешивали на лабораторных весах (PR4202, Ohaus, США) и определяли выраженность клинических симптомов.

Вирусная нагрузка в гомогенатах тканей легких и брыжейки. После некропсии ткани легких и брыжейки крыс помещали на стерильную чашку Петри, определяя их массу на лабораторных весах (PR124, Ohaus, США). Затем повторно взвешивали ткани правого легкого, а также часть тканей брыжейки и помещали их в центрифужные пробирки (Corning, США) с добавлением среды DMEM в соотношении 1:10. Далее с помощью лабораторного гомогенизатора (SHM2, Stuart, Великобритания) получали гомогенаты, которые осаждали при помощи центрифугирования в течение 15 мин (1000g). Полученные супернатанты использовали для последующей инокуляции в аллантоисную полость развивающихся куриных эмбрионов (12–13-дневных) в разведениях 10^–1 – 10^–8. Вирусную нагрузку определяли в реакции гемагглютинации согласно общепринятой методике.

Массовый коэффициент легких. У животных из контрольной и опытных групп после их выведения из эксперимента определяли массовый коэффициент легких, который рассчитывали по формуле:

$\frac{масса легких}{масса тела}\times 100.$

Гистологическое исследование. Ткани левого легкого и части брыжейки помещали в 10% забуференный формалин для фиксации на 24–48 ч. После гистологической проводки материал был залит в блоки с парафином. С помощью ротационного микротома получали срезы образцов толщиной 3–5 мкм, с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином.

Иммуногистохимическое исследование. В эндотелии кровеносных сосудов легких и брыжейки проводили детекцию нуклеопротеина ВГ, а также эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS). Для этого срезы инкубировали в течение часа при комнатной температуре (20–25°C) с первичными моноклональными антителами: анти-eNOS (Abcam, США, ab76198; разведение 1:500) и анти-NP (клон 6D11, получены из лаборатории биотехнологии диагностических препаратов ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева»; разведение 1:1000). Визуализацию выполняли с использованием системы детекции на основе пероксидазы хрена и хромогена 3,3'-диаминобензидина (Dako, Дания).

Для оценки уровня экспрессии eNOS проводили морфометрический анализ с использованием программного обеспечения Nis-Elements BR 4.40 (Nikon, Япония). В качестве основного анализируемого параметра применяли соотношение суммарной интенсивности сигнала к площади положительного окрашивания в зоне интереса (ROI, region of interest); диапазон детекции составлял 0–105.

Степень поражения эндотелия кровеносных сосудов легких и брыжейки оценивали по трем основным параметрам, которые включали дистрофические изменения, десквамацию и изменение морфологии. Полуколичественную оценку осуществляли с использованием 4-балльной шкалы, где 0 баллов — отсутствие морфопатологических изменений, 1 балл — наличие слабовыраженных изменений, 2 балла — наличие умеренных изменений, 3 балла — наличие выраженных изменений. При этом от каждого животного исследовали по 3–5 кровеносных сосудов.

Вазомоторную активность артерий брыжейки оценивали с использованием проволочного миографа (DMT 620M, Дания). С этой целью в ходе некропсии у животных извлекали ткани брыжейки и перемещали их в охлажденный (4±2°С) раствор Кребса–Хензеляйта. Далее от каждой крысы выделяли и монтировали в камерах миографа по 3 артерии 3-го порядка (диаметр 200–500 мкм). Следует отметить, что данные кровеносные сосуды относятся к резистивным, так как оказывают наибольшее сопротивление кровотоку, а также регулируют кровоток в обменных микрососудах 4-го порядка [16, 17].

Сократительную активность артерий брыжейки оценивали в рамках протокола кумулятивного дозозависимого ответа на фенилэфрин (ФЭ). Для этого на кровеносные сосуды воздействовали увеличивающейся от 10^–7 до 10^–5 М концентрацией ФЭ. В свою очередь, эндотелий-зависимое расслабление кровеносных сосудов изучали в ответ на ацетилхолин (АХ) при тех же концентрациях. Полученные данные регистрировали в программном обеспечении (ПО) LabChart 8 (ADInstruments, Новая Зеландия).

Полученные кривые описывали с использованием двух параметров: 1) ЕС50 (мкМ) — концентрация, обеспечивающая 50% ответ сосуда на агонист; 2) Emax (%) — величина максимального ответа. Кроме того, также определяли площадь под кривой (AUC).

Статистическую обработку данных проводили при помощи ПО MS Office Excel 2016 и GraphPad Prism 8, используя однофакторный дисперсионный анализ и метод нелинейной регрессии. Для описания полученных данных использовали следующие параметры описательной статистики: среднее арифметическое (Mean), стандартную ошибку среднего (SEM) и стандартное отклонение (SD). Статистическую значимость оценивали с помощью критериев Манна–Уитни и Тьюки. Нулевую гипотезу отвергали для значений p < 0,05.

Результаты

Клинические симптомы, масса тела и массовый коэффициент легких. У животных, инфицированных исследуемым ВГ A(H3N2), клинических симптомов не выявляли. Кроме того, масса тела инфицированных животных на протяжении всего периода исследования статистически не отличалась от группы контроля (данные не представлены). Несмотря на это, массовый коэффициент легких (соотношение массы легких к массе тела) крыс, инфицированных ВГ A(H3N2) через 1 и 4 дня, был значимо выше (p < 0,05) по сравнению с контрольными значениями (рис. 1).

 

Рисунок 1. Массовый коэффициент легких крыс (Mean±SD)

Примечание. *p < 0,05 — в сравнении с контрольной группой, критерий Тьюки, n = 5.

Figure 1. Lung weight coefficient in rats (Mean±SD)

Note. *p < 0.05 compared to the control group, Tukey test, n = 5.

 

Вирусная нагрузка в гомогенатах тканей легких и брыжейки. Титр инфекционной активности исследуемого ВГ в гомогентах легких через 1 день после заражения животных составлял 6,3 lg ЭИД₅₀/мл. Через 4 дня после заражения регистрировали снижение титра до 2,1 lg ЭИД₅₀/мл (табл. 1). В свою очередь, в гомогенатах тканей брыжейки инфицированных крыс вирусная нагрузка была неопределяемой.

 

Таблица 1. Вирусная нагрузка вируса гриппа A/Port Chalmers/1/1973 (H3N2) в гомогенатах тканей легких и брыжейки крыс (Mean±SD, *p < 0,05 по сравнению с группой контроля, критерий Манна–Уитни, n = 5)

Table 1. Viral titer of Influenza A/Port Chalmers/1/1973 (H3N2) virus in pulmonary and mesenteric homogenates of rats (Mean±SD, *p < 0.05 compared to the control group, Mann–Whitney test, n = 5)

Дни после инфицирования Days post infection	Инфекционный титр вируса гриппа (lg ЭИД50/мл) Influenza virus infectious titer (lg EID50/mL)
	Инфицированные крысы | Infected rats		Контроль | Control
	Легкие | Lungs	Брыжейка | Mesentery	Легкие | Lungs	Брыжейка | Mesentery
1-й день | 1st day	6,3±0,3*	0,0±0,0	0,0±0,0	0,0±0,0
4-й день | 4th day	2,1±0,3*	0,0±0,0

 

Детекция нуклеопротеина ВГ в тканях и кровеносных сосудах легких и брыжейки. Факт продуктивной инфекции ВГ в кровеносных сосудах легких и брыжейки животных подтверждали путем детекции вирусного структурного белка нуклеопротеина (рис. 2 и 3).

 

Рисунок 2. Выявление нуклеопротеина ВГ в кровеносных сосудах легких крыс

Примечание. Контрольная группа (А), через 1 (Б) и 4 дня (В) после заражения (ув. ×200 для А, Б; ×400 для В).

Figure 2. Detection of influenza virus nucleoprotein in pulmonary blood vessels

Note. Control group (A), at 1 day (B) and 4 days post infection (C) (magnification ×200 for A, B; ×400 for C).

 

Рисунок 3. Выявление нуклеопротеина ВГ в кровеносных сосудах брыжейки крыс

Примечание. Контрольная группа (А), через 1 (Б) и 4 дня (В) после заражения (ув. ×400 для А; ×200 для Б, В).

Figure 3. Detection of influenza virus nucleoprotein in mesentery blood vessels

Note. Control group (A) and at 1 day (B) and 4 days post infection (C) (magnification ×200 for A; ×400 for B, C).

 

Из рис. 2 видно, что нуклеопротеин вируса гриппа обнаруживался в эндотелиоцитах кровеносных сосудов на протяжении всего периода исследования (1 и 4 сутки). Также следует отметить, что данный вирусный белок в тканях и сосудах брыжейки крыс контрольной и опытной групп не обнаруживался (рис. 3).

Таким образом, данные иммуногистохимического исследования согласуются и подтверждают результаты изучения вирусной нагрузки в гомогенатах тканей легких и брыжейки животных (табл. 1).

Степень поражения эндотелия кровеносных сосудов легких и брыжейки. В ходе проведенного гистологического исследования удалось выявить существенные изменения со стороны клеток сосудистого эндотелия легких инфицированных животных (рис. 4).

 

Рисунок 4. Гистологическое исследование кровеносных сосудов легких и брыжейки крыс

Примечание. Кровеносный сосуд крысы контрольной группы (А), через 1 (Б) и 4 дня (В) после заражения, а также кровеносный сосуд брыжейки контрольной группы (Г), через 1 (Д) и 4 дня (Е) после инфицирования (ув. ×400, окрашивание гематоксилин-эозином).

Figure 4. Histological assay of pulmonary and mesenteric blood vessels

Note. Blood vessel of lungs in control group (A), at 1 day (B) and 4 days post infection (C) and blood vessels of mesentery in control group (D), at 1 day (E) and 4 days post infection (F) (magnification ×400, hematoxylin and eosin staining).

 

Так, через 1 день после инфицирования (рис. 5) наблюдали умеренные изменения всех трех параметров: степень дистрофических изменений составляла 1,07±0,15 балла, степень десквамации — 0,73±0,12 балла, изменение морфологии — 1,13±0,13 балла, что выше контрольных значений — 0,05±0,05 балла (p < 0,05). В свою очередь, через 4 дня регистрировали тенденцию к снижению выраженности дистрофических изменений и десквамации эндотелия по сравнению с 1 днем — 0,67±0,12 и 0,47±0,13 балла соответственно, тогда как изменения морфологии эндотелиоцитов были более выражены — 2,13±0,13 балла (p < 0,05).

 

Рисунок 5. Полуколичественная оценка поражения эндотелия кровеносных сосудов легких крыс (Mean±SEM, баллы)

Примечание. *p < 0,05 в сравнении с контрольной группой, ^#p < 0,05 в сравнении с группой крыс, инфицированных ВГ А(H3N2) через 1 день, критерий Тьюки, 3–4 сосуда от каждой крысы, n = 5.

Figure 5. Semi-quantitative score of histological alteration in vascular endothelium of lungs in rats (Mean±SEM, score)

Note. *p < 0.05 compared with control group; ^#p < 0.05 compared with group rats of infected with influenza A(H3N2) virus at 1 day post infection; Tukey test, 3–4 blood vessels from each rat (n = 5).

 

Следует отметить, что морфология клеток сосудистого эндотелия кровеносных сосудов брыжейки у инфицированных крыс в ходе данного эксперимента не изменялась.

Итак, ВГ А(Н3N2) индуцировал умеренные дистрофические и морфологические изменения со стороны клеток эндотелия, кровеносных сосудов легких через 1 день, а также вызывал десквамацию эндотелия. Через 4 дня дистрофические изменения и десквамация эндотелия становились менее выражены, тогда как изменения морфологии клеток эндотелия становились максимально выраженными.

Определение экспрессии eNOS в эндотелии кровеносных сосудов легких и брыжейки крыс. На рис. 6 представлены данные иммуногистохимического анализа, демонстрирующие экспрессию эндотелиальной NO-синтазы в сосудистом эндотелии легких и брыжейки крыс, инфицированных вирусом гриппа A(H3N2).

 

Рисунок 6. Иммуногистохимический анализ экспрессии eNOS в эндотелиоцитах кровеносных сосудов легких и брыжейки крыс

Примечание. Кровеносный сосуд легких крыс контрольной группы (А), сосуд легких крыс через 1 (Б) и 4 дня (В) после заражения; кровеносный сосуд брыжейки крыс контрольной группы (Г), а также кровеносный сосудов брыжейки через 1 (Д) и 4 дня после инфицирования (Е) (ув. ×400 для А-В, Д и Е, ув. ×400 для Г).

Figure 6. Imminohistochemical assay of eNOS expression in endothelial cells of pulmonary and mesenteric blood vessels

Note. Blood vessel of lungs in control group (A), at 1 day (B), 4 days post infection (C), and mesenteric blood vessels in control group (D), at 1 day (E) and 4 days post infection (F) (magnification ×400 for A–C, F, G; ×400 for D).

 

В ходе иммуногистохимического анализа выявляли снижение экспрессии eNOS в эндотелии легких крыс, зараженных ВГ A(H3N2), через 1 день (722,41±54,37) на 8,76% по сравнению с группой контроля (791,77±33,89; p < 0,05) (рис. 7). Через 4 дня после заражения наблюдалась тенденция к снижению экспрессии eNOS до 738,75±87,52 (p = 0,0755 по сравнению с контролем).

 

Рисунок 7. Динамика изменения уровня экспрессии eNOS в эндотелиоцитах кровеносных сосудов легких крыс (Mean±SD, у.е.)

Примечание. *p < 0,05 в сравнении с контрольной группой, критерий Даннета, 3–4 сосуда от каждой крысы, n = 5.

Figure 7. Dynamics of changes in eNOS expression level in endothelial cells of rat pulmonary blood vessels (Mean±SD, c.u.)

Note. *p < 0.05 compared with control group, Dunnett test, 3–4 blood vessels from each rat (n = 5).

 

При изучении экспрессии эндотелиальной NO-синтазы в клетках эндотелия кровеносных сосудов брыжейки были получены следующие результаты (рис. 8): 1) у инфицированных животных через 1 день уровень экспрессии eNOS снижался и составлял 735,92±61,84 у.е.; 2) через 4 дня регистрировали дополнительное снижение — до 708,41±83,56 у.е., что ниже значений контрольной группы (794,58±26,77) на 7,38 и 10,85% соответственно (p < 0,05).

 

Рисунок 8. Динамика изменения уровня экспрессии eNOS в эндотелиоцитах кровеносных сосудов брыжейки крыс (Mean±SD, у.е.)

Примечание. *p < 0,05 в сравнении с контрольной группой, критерий Даннета, 3–4 сосуда от каждой крысы, n = 5.

Figure 8. Dynamics of changes in eNOS expression level in endothelial cells in rat mesenteric blood vessels (Mean±SD, c.u.)

Note. *p < 0.05 compared with control group, Dunnett test, 3–4 blood vessels from each rat (n = 5).

 

Вазомоторная активность артерий брыжейки. Показатели ответа артерий брыжейки животных на ФЭ и АХ представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Значения показателей вазомоторной активности артерий брыжейки крыс (Mean±SEM)

Table 2. Parameters of vasomotor activity of mesenteric arteries of rats (Mean±SEM)

Агонист | Agonist	Фенилэфрин | Phenylephrine		Ацетилхолин | Acetylcholine
Параметр | Parameter	log EC50, M	Emax, %	log EC50, M	Emax, %
Контрольная группа/Control group
ч/з 1 день | at 1 day	–5,54±0,07	77,33±3,70	–6,44±0,11	100,13±0,25
Крысы, инфицированные вирусом гриппа A(H3N2)/Rats infected with Influenza A(H3N2) virus
ч/з 1 день | at 1 day	–5,34±0,18	63,69±7,73	–6,40±0,22	93,53±5,00
ч/з 4 дня | at 4 days	–5,75±0,09	71,31±7,36	–6,37±0,16	93,70±4,50

Примечание. p > 0,05 по сравнению с контрольной группой, критерий Даннета, 3 артерии от каждой крысы, n = 5.

Note. p > 0.05 compared with control group, Dunnett test, 3 arteries of each rat, n = 5.

 

Из табл. 2 видно, что имеется тенденция к повышению чувствительности артерий брыжейки на ФЭ на 4 день после инфицирования по сравнению с контрольной группой. Кроме того, также наблюдается тенденция к снижению максимального ответа на АХ как через 1, так и 4 дня после заражения.

Данные кумулятивного ответа кровеносных сосудов брыжейки крыс представлены на рис. 9.

 

Рисунок 9. Дозозависимые кривые «концентрация-ответ» артерий брыжейки крыс (Mean±SEM)

Примечание. *p < 0,05 в сравнении с контрольной группой, ^#p < 0,05 в сравнении с группой крыс, инфицированных ВГ через 1 день, критерий Брауна–Форсайта, 3 кровеносных сосуда от каждой крысы, n = 5.

Figure 9. Curves of dose-dependent response of rat mesenteric arteries (M±SE)

Note. *p < 0.05 compared with control group; ^#p < 0.05 compared with group rats of infected with influenza A(H3N2) virus at 1 day post infection; Brown–Forsythe test, 3 blood vessels from each rat, n = 5. PE — phenylephrine, ACh — acetylcholine.

 

Как видно из рис. 9А, через 1 день после заражения определяли тенденцию к снижению ответа артерий брыжейки крыс на средние концентрации ФЭ по сравнению с контролем. В свою очередь, через 4 дня у инфицированных животных наблюдали значимое повышение ответа кровеносных сосудов на средние концентрации ФЭ (10^–6,3 и 10^–6,0 М) на 97,6 и 87,13% (p < 0,05) по сравнению с 1 днем.

При изучении ответа кровеносных сосудов на АХ через 1 день выявляли тенденцию к снижению дозозависимого ответа артерий брыжейки (рис. 8Б), тогда как через 4 дня регистрировали значимое снижение ответа — на 26,15% (p < 0,05) (на концентрацию АХ 10^–5,5 М) по сравнению с контролем и тенденцию к снижению (p = 0,0529) на предмаксимальные концентрации (10^–5,3 М).

На рис. 10, показаны данные по интегрального ответу артерий брыжейки животных, зараженных ВГ A(H3N2).

 

Рисунок 10. Интегральный ответ артерий брыжейки крыс (Mean±SEM)

Примечание. p > 0,05 в сравнении с контрольной группой, критерий Даннета, n = 5.

Figure 10. Integral response of mesenteric arteries of rats (Mean±SEM)

Note. p > 0.05 compared with control group, Dunnett test, 3 arteries of each rat, n = 5. PE — phenylephrine, ACh — acetylcholine.

 

Согласно данным интегрального ответа кровеносных сосудов (рис. 10), наблюдалась тенденция к снижению данного показателя на ФЭ через 1 день, с последующим усилением ответа через 4 дня (p = 0,0585). Интегральный ответ сосудов на вазодилататор (АХ) характеризовался тенденцией к снижению через 1 день и более выраженному снижению через 4 дня (p = 0,0551).

Таким образом, наиболее выраженные изменения вазомоторной активности артерий брыжейки крыс, инфицированных вирусом гриппа A(H3N2), регистрировали через 4 дня, что также согласуется с наибольшим снижением экспрессии eNOS на данном временном интервале.

Обсуждение

Согласно данным эпидемиологических исследований, наибольшая частота осложнений со стороны сердечно-сосудистой системы на фоне гриппа наблюдается в те эпидемические сезоны, когда преимущественно циркулирует ВГА подтипа H3N2 [6]. Исходя из вышесказанного, представляло интерес изучить особенности воздействия ВГ A(H3N2) на эндотелий.

В настоящей работе изучали влияние ВГ A/Port Chalmers/1/1973 (H3N2) на морфофункциональные свойства клеток эндотелия кровеносных сосудов в остром периоде нелетальной гриппозной инфекции — на протяжении первых 4 дней. Особый интерес представляло сравнение полученных данных с результатами ранее проведенных экспериментов, в ходе которых изучали влияние ВГ A(H1N1)pdm09 на эндотелий кровеносных сосудов легких и брыжейки.

Так, в ходе данного исследования было установлено, что инфекционная активность ВГ A(H3N2) в гомогенатах легких крыс была максимальной через 1 день после заражения и составляла 6,3 lg ЭИД₅₀/мл. Через 4 дня у животных определяли снижение титра инфекционной активности вируса до 2,1 lg ЭИД₅₀/мл. Важно подчеркнуть, что сопоставимая динамика изменения инфекционного титра вируса в легочной ткани наблюдалась у крыс, инфицированных ВГ A(H1N1)pdm09 на тех же временных сроках (через 1 и 4 дня после заражения — 6,5 lg и 2,2 lg ЭИД₅₀/мл соответственно) [14]. Полученные результаты подтверждают факт развития продуктивной инфекции при интраназальном заражении крыс ВГ подтипа А(H3N2) и A(H1N1)pdm09 (после адаптации ВГ), а также позволяет напрямую сравнить влияние двух подтипов вируса на эндотелий. Важно подчеркнуть, что репликация ВГ А(H3N2), а также A(H1N1)pdm09 в тканях и сосудах брыжейки крыс не происходила.

Стоит отметить, что у зараженных ВГ A(H3N2) животных, на фоне субклинического течения инфекции и отсутствия статистически значимого снижения массы тела через 1 и 4 дня, регистрировали повышение массового коэффициента легких (соотношение массы легких к массе тела) на протяжении всего периода исследования. Вероятно, данные изменения являются следствием отека легочной паренхимы в результате воспалительной реакции, что, в свою очередь, может усиливать активацию эндотелия кровеносных сосудов легких. Интересно, что ВГ A(H1N1)pdm09 не приводил к статически значимому изменению массового коэффициента легких крыс через 1 день.

Со стороны эндотелия легких крыс, инфицированных ВГ А(Н3N2), регистрировали ряд гистопатологических изменений. Так, ВГ А(Н3N2) вызывал умеренные дистрофические, морфологические изменения и десквамацию эндотелия кровеносных сосудов легких крыс через 1 день, в то время как через 4 дня степень дистрофических изменений и десквамации снижалась, а изменения морфологии эндотелия (по типу «частокола», или «высокого» эндотелия) носили наиболее выраженный характер. Данные изменения, с одной стороны, необходимы для миграции иммунных клеток из сосудистого русла в очаг воспаления, что позволяет подавлять репродукцию ВГ, а с другой стороны, могут стать причиной выраженной активации и последующей дисфункции эндотелия [15]. Следует отметить, что гистопатологические изменения клеток эндотелия выявлялись только в кровеносных сосудах легких, где эндотелиоциты непосредственно вовлекались в инфекционный процесс и не обнаруживались в эндотелии кровеносных сосудов брыжейки. Интересно, что ВГ A(H1N1) вызывал более выраженные гистопатологические изменения через 1 и 4 дня, чем ВГ A(H3N2). Вероятно, это связано с тем, что штамм A/Санкт-Петербург/48/16 (H1N1)pdm09 обладал повышенной вирулентностью в отношении эндотелия кровеносных сосудов, что согласуется с более высокой инфекционной активностью в тканях легких [14].

В ходе изучения экспрессии eNOS в клетках сосудистого эндотелия легких крыс удалось определить статистически значимое понижение уровня экспрессии данного белка через 1 сутки после заражения и тенденцию к снижению на 4 день. Можно сделать предположение, что столь значительное понижение титра инфекционной активности вируса (на 4 lg) на 4-й день по сравнению с 1-м днем также снижает процесс активации эндотелия, позволяя до некоторой степени восстановить экспрессию eNOS. В сравнении с ВГ A(H3N2), подтип A(H1N1)pdm09 вызывал более выраженное снижение уровня экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота через 1 день, а также приводил к резкому повышению eNOS через 4 дня, чего не отмечалось в случае инфекции, связанной с ВГ A(H3N2) [13].

В свою очередь, значимое снижение экспрессии эндотелиальной NO синтазы в клетках эндотелия кровеносных сосудов брыжейки крыс были выявлены на протяжении первых 4 суток после инфицирования исследуемым ВГ A(H3N2). Причиной может являться гипоксия тканей на фоне отека легочной паренхимы, выявленной в ходе гистологического анализа. Другими возможными причинами активации эндотелия при гриппозной инфекции на фоне отсутствия репликации вируса в тканях брыжейки является оксидативный стресс и цитокинемия [1, 5, 9]. Снижение eNOS в эндотелии кровеносных сосудов брыжейки в остром периоде гриппозной инфекции также характерны и для ВГ A(H1N1)pdm09 [2].

При исследовании вазомоторной активности артерий брыжейки удалось выявить значимое повышение ответа кровеносных сосудов при низких концентрациях вазоконстриктора ФЭ через 4 дня после заражения по сравнению с первым днем, а также тенденцию к повышению ответа артерий на ФЭ через 4 дня. В свою очередь, у крыс, инфицированных ВГ A(H3N2), через 1 и 4 дня выявляли тенденцию к снижению дозозависимого ответа артерий на вазодилататор АХ, что также было подтверждено данными интегрального ответа кровеносных сосудов. В частности, через 4 суток после инфицирования у животных выявляли выраженную тенденцию к снижению (p = 0,055) интегрального ответа со стороны сосудов брыжейки на АХ по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, через 1 день после инфицирования наблюдали вазопатическое действие со стороны исследуемого ВГ A(H3N2), что резко отличается от воздействия ВГ A(H1N1)pdm09 на вазомоторную функцию сосудов брыжейки [2].

Заключение

Вирус гриппа А подтипа H3N2 индуцирует нарушение морфофункциональных свойств клеток эндотелия кровеносных сосудов легких и функциональных свойств эндотелиоцитов брыжейки в остром периоде инфекции, что свидетельствует об активации эндотелия на локальном и системном уровне. В свою очередь, наиболее выраженные изменения морфофункциональной активности эндотелия кровеносных сосудов брыжейки регистрируют через 4 дня на фоне резкого снижения титра инфекционной активности вируса в тканях легких.

About the authors

Vladimir A. Marchenko

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: vmarcenco@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6870-3157
SPIN-code: 4463-7720
Scopus Author ID: 57218869259

PhD (Medicine), Associate Professor, Medical Microbiology Department

Russian Federation, St. Petersburg

Irina A. Zelinskaya

V.A. Almazov National Medical Research Centre of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: irina.selinskaja@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1971-3444

Researcher, Laboratory of Bioprosthetics and Cardiac Protection, Institute of Experimental Medicine

Russian Federation, St. Petersburg

Darya V. Mukhametdinova

V.A. Almazov National Medical Research Centre of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: mukh.dv@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7109-1187

Research Laboratory Assistant, Laboratory of Bioprosthetics and Cardiac Protection, Institute of Experimental Medicine

Russian Federation, St. Petersburg

Yana G. Toropova

V.A. Almazov National Medical Research Centre of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: yana.toropova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1629-7868

DSc (Biology), Head of the Laboratory of Bioprosthetics and Cardiac Protection, Institute of Experimental Medicine

Russian Federation, St. Petersburg

Michael M. Galagudza

V.A. Almazov National Medical Research Centre of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: galagoudza@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5129-9944

DSc (Medicine), Professor, RAS Corresponding Member, Director of the Institute of Experimental Medicine

Russian Federation, St. Petersburg

Irina N. Zhilinskaya

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: s_zhilinskaya@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0084-1323

DSc (Medicine), Professor of the Medical Microbiology Department

Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files