B cells and follicular T-helper cells in patients with lung tuberculosis

Full Text

Введение

Туберкулез (ТБ) до сих пор является одной из самый распространенных инфекционных патологий в мире и остается одной из ведущих причин смертности от инфекционных заболеваний, несмотря на прогресс в области диагностики, терапии и профилактики [41]. Особую озабоченность вызывает распространение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) и устойчивостью к рифампицину (RR-TБ), однако только 44% пациентов с такими формами начали лечение. В структуре впервые выявленных случаев доля МЛУ/РР-ТБ составила 3,2%, среди ранее леченных больных — 16% [1, 32]. Дополнительным фактором, осложнившим эпидемиологическую ситуацию, стала пандемия COVID-19, которая привела к снижению охвата диагностикой и лечением туберкулеза в большинстве стран, увеличению числа недоучтенных случаев, а также нарушению функционирования программ химиопрофилактики и вакцинации [23]. Туберкулез легких имеет большое количество клинических форм и может обладать разной активностью, что отражает динамику развития патологического процесса [22].

Туберкулез характеризуется сложным взаимодействием между возбудителем Mycobacterium tuberculosis (МБТ) и иммунной системой хозяина. Как известно из ранее проведенных исследований, патогенез туберкулеза легких связан с первым типом иммунного ответа, результатом которого является формирование туберкулезной гранулемы [7]. Иммуногистохимический анализ гранулем, полученных при экспериментальном заражении лабораторных животных [16], а также образцов гранулем, полученных от приматов [27] и инфицированных МБТ пациентов [35] выявил наличие в их составе оформленных скоплений лимфоцитов, включающих не только CD3⁺, но и CD19⁺ лимфоциты, формировавшие структуры, напоминавшие зародышевые центры лимфатических узлов и содержащие пролиферирующие В-клетки. Более того, формирование в составе гранулем высокоорганизованных эктопических лимфоидных скоплений, содержащих CXCR5⁺ T-клетки, было тесно связано с благоприятным исходом в случае латентной туберкулезной инфекции (ЛТИ), тогда как слабо организованные или диффузные лимфоидные образования с низким уровнем Tfh клеток формировались при активной форме ТБ и обладали слабовыраженными защитными свойствами в отношении микобактерий [30].

Таким образом, В-лимфоциты принимают непосредственное участие в формировании туберкулезной гранулемы. Эти клетки защищают организм от МБТ не только посредством продукции антиген-специфических антител, но и вследствие презентации антигенов микобактерии, продукции иммунорегуляторных цитокинов, а также регуляции функций Т-лимфоцитов как на системном уровне (периферические лимфоидные органы), так и в очаге воспаления (ткани легкого, гранулемы и т. д.) [12]. Отдельно следует отметить тот факт, что В-лимфоциты принимают участие в формировании третичной лимфоидной ткани в пораженных МБТ легких как у человека [36], так и у лабораторных животных [35]. Более того, с использованием мышиных моделей туберкулезной инфекции было показано, что уровень В-лимфоцитов существенно повышался в легочной ткани при инфицировании, причем В-клетки располагались в непосредственной близости от дендритных клеток, окружавших Т-лимфоциты [35]. В экспериментах на приматах также было показано, что локализующиеся по периферии туберкулезной гранулемы В-клетки в цитоплазме высоко экспрессировали маркер пролиферативной активности Ki-67, а на своей поверхности — молекулы CXCR3 и HLA-DR [27]. Кроме того, при анализе биопсионного материала, полученного из тканей легкого пациентов с ТБ, также отмечалось накопление CD19⁺ В-клеток в очаге воспаления по сравнению с образцами от здоровых индивидуумов [18].

Однако результаты исследования течения инфекции, вызванной МБТ, у мышей с делецией В-лимфоцитов были весьма противоречивы. Так, Johnson и соавт. не выявили значимых различий между группами наивных животных и животных с дефицитом В-клеток при анализе контроля аэрозольной инфекции и продукции IFNg [14]. С другой стороны, было показано, что отсутствие В-лимфоцитов способствует распространению патогена в организме инфицированных мышей [37], а также снижает эффективность накопления эффекторных популяций лимфоцитов в тканях легкого [4], что указывало на ослабление протективных свойств иммунной системы в целом. Следует отметить, что элиминация В-клеток у приматов при помощи ритуксимаба до инфицирования МБТ или на ранних сроках после начала эксперимента сопровождалась увеличением числа IL-2-, IL-10- и IL-17-продуцируюших Т-клеток в составе гранулем, хотя и не было связано с увеличением тяжести течения заболевания [26].

Таким образом, приведенные выше данные литературы указывают на важную роль В-лимфоцитов в защите от МБТ как в рамках реализации реакций не только гуморального, но и клеточного иммунного ответа. Поэтому целью данного исследования был анализ субпопуляционного состава В-лимфоцитов, отвечающих за эффекторные реакции гуморального иммунного ответа, и фолликулярных Т-хелперов, осуществляющих контроль за функционированием В-клеток, в периферической крови пациентов с ТБ легких.

Материалы и методы

Нами проведено проспективное исследование c 2019 по 2022 гг. с анализом результатов иммунологического исследования периферической крови больных ТБ легких с бактериовыделением (n = 37, основная группа) в возрасте от 18 до 65 лет в сравнении с группой здоровых доноров (n = 39, контрольная группа).

Критерии включения: наличие клинико-рентгенологически и бактериологически подтвержденного туберкулеза легких. Критерии невключения: наличие иммуносупрессии, ВИЧ-инфекции, онкологических заболеваний, аутоиммунной патологии, беременности, грудного вскармливания; алкоголизм, наркомания и хроническая патология в стадии обострения. В группу контроля были включены здоровые лица, не имеющие контактов с больными ТБ, без хронической патологии с отсутствием изменений по данным рентгенограммы органов грудной клетки и с отрицательными результатами по данным иммунодиагностики (проба с «Диаскинтестом»).

В качестве контроля использовали периферическую венозную кровь условно-здоровых доноров (n = 39), сопоставимых по полу и возрасту с больными ТБ легких. Все инструментальные исследования проводились исключительно после добровольного информированного согласия испытуемых, а также в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Работа была одобрена Локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ им. В. А. Алмазова» Минздрава России (протокол № 10-22 от 3 октября 2022 г.). Характеристика больных туберкулезом представлена в таблице. Диагноз туберкулеза легких верифицирован обнаружением M. tuberculosis в мокроте и/или ДНК МБТ по данным молекулярно-генетического и бактериологического методов, с наличием типичных изменений по данным лучевого обследования.

 

Таблица. Относительное и абсолютное содержание основных субпопуляций В-лимфоцитов периферической крови у пациентов с ТБ и группы контроля

Table. The relative and absolute frequencies of circulating B cell subsets in patients with lung TB and healthy controls

Популяция клеток B cell subsets		Пациенты с ТБ TB n = 37	Группа контроля HC n = 39	р
«Наивные», IgD+CD27–СD38– “Naïve”, IgD+CD27–СD38–	%	4,87 (3,64; 7,75)	7,22 (5,07; 10,41)	0,045
	#	12 (5; 16)	14 (8; 25)	0,238
Активированные «наивные», IgD+CD27–CD38+ Activated “naïve”, IgD+CD27–CD38+	%	52,12 (45,21; 62,65)	44,94 (37,91; 52,03)	0,008
	#	117 (63; 160)	101 (57; 131)	0,301
Предшественники клеток зародышевых центров, IgD+CD27–CD38++ Germinal center cell precursors, IgD+CD27–CD38++	%	8,86 (5,32; 14,87)	5,50 (3,13; 8,25)	0,009
	#	14 (11; 27)	11 (5; 21)	0,068
В-клетки памяти, IgD+CD27+ Memory B cells, IgD+CD27+	%	9,14 (4,90; 12,36)	16,86 (10,62; 20,38)	0,000
	#	14 (8; 34)	34 (17; 47)	0,002
В-клетки памяти, IgD–CD27+ Memory B cells, IgD–CD27+	%	14,73 (7,33; 18,49)	18,97 (11,74; 26,56)	0,006
	#	27 (11; 43)	39 (20; 53)	0,065
«Дважды-негативные» В-клетки памяти, IgD–CD27– “Double-negative memory B cells, IgD–CD27–	%	4,13 (2,63; 5,88)	5,32 (3,49; 6,40)	0,100
	#	8 (6; 14)	10 (6; 17)	0,358

Примечание. % — процент клеток от общего пула CD19⁺ В-лимфоцитов периферической крови; # — абсолютное содержание клеток в 1 мкл цельной крови; результаты приведены в виде групповые медианы и диапазоны квартилей (Med (Q₂₅; Q₇₅)); статистический анализ был выполнен с помощью U-критерия Манна–Уитни.

Note. % — the relative frequency of B cell subset within total CD19⁺ B cells; # — the absolute number of cell per 1 μL of whole blood; the data are presented as the group medians and quartile ranges (Med (Q₂₅; Q₇₅)); the statistical analysis was performed with the Mann–Whitney U test.

 

Объектом исследования служила венозная кровь, полученная путем пункции периферической вены, и собранная в вакуумные пробирки с содержанием K₃ЭДТА в качестве блокатора свертывания. До начала подготовки образцов для цитометрического анализа периферическая кровь хранились не более 6 часов при комнатной температуре (20–22°С) в защищенном от прямого света месте.

Для выявления основных субпопуляций В-лимфоцитов периферической крови применяли набор моноклональных антител, включавший антитела против CD45 (клон J33, флуорохром Krome Orange, кат. № B36294, производитель Beckman Coulter, США), CD19 (клон ALB9, флуорохром APC-AF750, кат. № B49212, производитель Beckman Coulter, США), IgD (клон IA6-2, флуорохром Alexa Fluor 488, кат. № 348216, производитель BioLegend Inc., США), CD24 (клон J3-119, флуорохром APC, кат. № A87785, производитель Beckman Coulter, США), CD27 (клон 1A4CD27, флуорохром PC7, кат. № A54823, производитель Beckman Coulter, США) и CD38 (клон LS198-4-3, флуорохром PE, кат. № 348216, производитель Beckman Coulter, США).

Для выявления циркулирующих в периферической крови фолликулярных Т-хелперов и их основных субпопуляций применяли набор моноклональных антител, состоявший из антител против CD3 (клон HIT3a, флуорохром APC/Cy7, кат. № 300318, производитель BioLegend Inc., США), CD4 (клон 13B8.2, флуорохром АРС, кат. № IM2468, производитель Beckman Coulter, США), CD45RA (клон HI100, флуорохром Brilliant Violet 510, кат. № 304142, производитель BioLegend Inc., США), CD185 или CXCR5 (клон J252D4, флуорохром PE/Dazzle™ 594, кат. № 356928, производитель BioLegend Inc., США), CD183 или CXCR3 (клон G025H7, флуорохром Alexa Fluor 488, кат. № 353710, производитель BioLegend Inc., США), а также CD194 или CCR4 (клон L291H4, флуорохром PerCP/Cy5.5, кат. № 359406, производитель BioLegend Inc., США).

Детальная характеристика основных этапов подготовки образцов для анализа была описана нами ранее [19]. Вкратце: 200 мкл цельной периферической крови окрашивали указанными выше коктейлями антител по рекомендациям производителей. Для удаления эритроцитов из образцов использовали лизирующий раствор VersaLyse (Beckman Coulter, США), добавляя к 975 мкл лизирующего раствора 25 мкл фиксирующего раствора IOTest 3 Fixative Solution (Beckman Coulter, США); после разрушения эритроцитов образцы однократно отмывали избытком физиологического раствора при 330g в течение 7 минут, клеточный осадок ресуспендировали в физиологическом растворе с рН 7,2–7,4, содержащем 2% параформальдегида (Sigma-Aldrich, США).

Обработку цитофлуориметрических данных проводили при помощи пакета программ Kaluza™ v.2.0 (Beckman Coulter, США). Алгоритм выявления ключевых популяций В-клеток и фолликулярных Т-хелперов был описан детально ранее [19]. Для получения абсолютных значений популяций В- и Т-клеток использовали частицы для абсолютного подсчета Flow-Count™ Fluorospheres (Beckman Coulter, США) согласно инструкции производителя в отдельной пробирке без отмывки.

Статистическую обработку проводили при помощи программного обеспечения Statistica 8.0 (StatSoft, США) и GraphPad Prism 4.00 for Windows (GraphPad Prism Software Inc., США). Результаты выражали в виде процента позитивных клеток от искомой популяции, приводили в виде медианы и интерквартильного размаха (25%; 75%). Нормальность распределения проверяли по критерию согласия Пирсона хи-квадрат. Для оценки достоверности различий использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Корреляционные взаимосвязи оценивали при помощи критерия Спирмена.

Результаты

При анализе общего пула циркулирующих в крови CD19⁺ В-лимфоцитов не было выявлено достоверных различий как по относительному, так и по абсолютному содержанию этих клеток между пациентами с ТБ легких и условно здоровыми добровольцами (9,48% (6,35; 15,01) против 11,09% (9,03; 13,28) при р = 0,355 и 179 кл/мкл (122; 321) против 228 179 кл/мкл (161; 287) при р = 0,300 соответственно).

В ходе дальнейших исследований общий пул В-лимфоцитов на основании экспрессии IgD, CD27 и CD38 был разделен на шесть типов клеток, включая «наивные» В-клетки с фенотипом IgD⁺CD27^–СD38^–, активированные «наивные» В-клетки с фенотипом IgD⁺CD27^–СD38⁺, клетки-предшественники клеток зародышевых центров («наивные» В-клетки с фенотипом IgD^–CD27⁺СD38⁺⁺), а также три типа В-клеток памяти, в том числе «не переключившие» класс синтезируемых антител IgD⁺CD27⁺ В-клетки памяти, IgD^–CD27⁺ В-клетки памяти, которые переключили класс синтезируемых антител в ходе реакций в зародышевых центрах В-клеточных фолликулов, а также «дважды-негативные» IgD^–CD27^– В-клетки памяти (как это было описано нами ранее [19]). Как показано в таблице, относительное содержание IgD⁺CD27^–СD38^– «наивных» В-клеток достоверно снижалось при ТБ, тогда как доли активированных «наивных» клеток и клеток-предшественников достоверно возрастали. При анализе В-клеток памяти у пациентов с ТБ было отмечено снижение как относительного, так и абсолютного содержания IgD⁺CD27⁺ клеток. Кроме того, при ТБ наблюдалось уменьшение доли IgD^–CD27⁺ В-клеток памяти в рамках общего пула В-лимфоцитов (табл.).

В ходе дальнейших исследований в рамках общего пула циркулирующих в крови В-лимфоцитов на основании яркой экспрессии CD24 и CD38 нами были выявлены регуляторные В-клетки (Bregs, рис. 1, A). Было показано, что относительное и абсолютное содержание этих CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺ В-клеток при ТБ достоверно возрастало относительно значений условно здорового контроля (7,83% (5,61; 15,14) против 4,84% (2,38; 7,15) и 15 кл/мкл (10; 26) против 9 кл/мкл (4; 17) при р = 0,001 и р = 0,010, соответственно, рис. Б и В). Кроме того, увеличение уровня CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺ Breg было тесно связано со снижением в циркуляции «наивных» В-клеток и трех типов клеток памяти (рис. 1, Г, Ж, З и И).

 

Рисунок 1. CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺ В-клетки периферической крови при туберкулезе легких

Figure 1. Circulating CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺ B cells in patients with lung tuberculosis

Примечание. Гистограмма А — выявление субпопуляции CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺ клеток в рамках общего пула В-лимфоцитов периферической крови. По оси абсцисс — экспрессия CD38, по оси ординат — экспрессия CD24; область «CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺» содержит популяцию регуляторных В-клеток с фенотипом CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺. Гистограммы Б и В — относительное (% от общего пула В-клеток) и абсолютное (кол-во клеток в 1 мкл периферической крови) содержание регуляторных В-клеток с фенотипом CD24⁺⁺⁺CD38⁺+. Черные кружки обозначают пациентов с туберкулезом легких (ТБ, n = 37); белые кружки — условно здоровых доноров (КГ, n = 39). Каждая точка представляет отдельного обследованного, а горизонтальные полосы обозначают групповые медианы и диапазоны квартилей (Med (Q₂₅; Q₇₅). Статистический анализ был выполнен с помощью U-критерия Манна–Уитни. Гистограммы Г–И — взаимосвязи относительного содержания регуляторных В-клеток с фенотипом CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺ и В-клеток основных субпопуляций, приведенных в таблице 2. Статистический анализ был выполнен с помощью ранговой корреляции Спирмена.

Note. Plot A — “Gaiting strategy” used for identification of CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺ B cells based on co-expression of CD38 (x-axis) and CD24 (y-axis); gate “CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺” contains Bregs with CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺ phenotype. Plots B and C — the relative (% within total CD19⁺ B cell subset) and absolute (number of cell per 1 μL of whole blood) of circulating CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺ Bregs. Black circles denote patients with lung tuberculosis (ТВ, n = 37); white circles — healthy individuals (HC, n = 39). Each dot represents individual subjects, and horizontal bars depict the group medians and quartile ranges (Med (Q₂₅; Q₇₅)). The statistical analysis was performed with the Mann–Whitney U test. Plots D — I — Graphs showing the correlation between the frequency of CD24^hiCD38^hi B cells and the frequencies of other circulating subsets of B cells that were mentioned in Table 1. Spearman’s rho was performed to calculate correlation coefficients and their significance.

 

Важнейшую роль в регуляции процессов созревания и дифференцировки В-лимфоцитов играет особая субпопуляция CD4⁺ Т-лимфоцитов, получившая название фолликулярные Т-хелперы (Tfh) и отвечающая за процессы переключения класса синтезируемых антител и соматический мутагенез [5]. Как показано на рис. 2 (гистограммы А–В), Tfh клетки выявляются в рамках общего пула CD4⁺ Т-лимфоцитов памяти на основании наличия CXCR5, отвечающего за миграцию Tfh в В-зависимые зоны периферических лимфоидных органов. Следует отметить, что значимых различий по содержанию общего пула Tfh клеток памяти между сравниваемыми группами нами отмечено не было (24,40% (18,47; 28,29) против 24,17% (20,52; 27,25) при р = 0,832 и 93 кл/мкл (56; 143) против 119 кл/мкл (75; 168) при р = 0,099).

 

Рисунок 2. Нарушения в субпопуляционном составе циркулирующих фолликулярных Т-хелперов памяти при туберкулезе легких

Figure 2. Alterations in follicular Th subsets in patients with lung tuberculosis

Примечание. Гистограммы А–Г — пошаговый алгоритм вяления («тактика гейтирования») основных субпопуляций фолликулярных Т-хелперов памяти (гистограмма А — удаление регуляторных Т-клеток (область «Tregs») из зоны анализа; гистограмма Б — выявление общего пула Т-клеток памяти по отсутствую CD45RA на клеточной мембране; гистограмма В — выявление общего пула фолликулярных Т-клеток памяти по наличию на клеточной мембране хемокинового рецептора CXCR5; гистограмма Г — разделение общего пула фолликулярных Т-клеток памяти на Tfh1 с фенотипом CXCR3⁺CCR6^–, Tfh2 с фенотипом CXCR3^–CCR6^–, Tfh17 и DP Tfh с фенотипами CXCR3^–CCR6⁺ и CXCR3⁺CCR6⁺ соответственно. Гистограммы Д–З и И–М — относительное (% от общего пула фолликулярных Т-клеток памяти с фенотипом CD45RA^–CXCR5⁺, CD45RA^– Tfh) и абсолютное (количество клеток в 1 мкл периферической крови) основных субпопуляций фолликулярных Т-хелперов соответственно. Черные кружки обозначают пациентов с туберкулезом легких (ТБ, n = 37); белые кружки — условно-здоровых доноров (КГ, n = 39). Каждая точка представляет отдельного обследованного, а горизонтальные полосы обозначают групповые медианы и диапазоны квартилей (Med (Q₂₅; Q₇₅)). Статистический анализ был выполнен с помощью U-критерия Манна–Уитни.

Note. Dot plots A–D — “Gaiting strategy” used for identification of follicular Th subsets (dot plot A — discrimination between regulatory T cells and conventional Th cells; dot plot B — identification of memory CD45RA^– Th cells; dot plot C — gaiting of CXCR5⁺ follicular Th cell within total memory Th cells; dot plot D — identification of four main Tfh cell subsets, including CXCR3⁺CCR6^– Tfh1, CXCR3^–CCR6^– Tfh2, CXCR3^–CCR6⁺ Tfh17, and “double-positive DP CXCR3⁺CCR6⁺ Tfh cells. Plots E–H and I–L — the relative (% within total CD45RA^–CXCR5⁺ Tfh cells) and absolute (number of cell per 1 μL of whole blood) of four distinct circulating Th cell subsets. Black circles denote patients with lung tuberculosis (ТВ, n = 37); white circles — healthy individuals (HC, n = 39). Each dot represents individual subjects, and horizontal bars depict the group medians and quartile ranges (Med (Q₂₅; Q₇₅)). The statistical analysis was performed with the Mann–Whitney U test.

 

В настоящее время принято подразделять Tfh клетки на четыре основные субпопуляции на основании анализа экспрессии хемокиновых рецепторов CCR6 и CXCR3. CD3⁺CD4⁺CD45RA^–CXCR5⁺ Tfh были разделены на CXCR3⁺CCR6^– Tfh1, CXCR3^–CCR6^– Tfh2, CXCR3^–CCR6⁺ Tfh17 и CXCR3⁺CCR6⁺ DP Tfh клетки (рис. 2, гистограмма Г). Причем Tfh1 клетки обладают способностью подавлять развитие гуморального иммунного ответа, тогда как Tfh2 и Tfh17 способствуют дифференцировке В-клеток в плазматические клетки, что позволяет рассматривать эти популяции Tfh клеток в качестве «провоспалительных». Было показано (рис. 2), что у пациентов с ТБ снижается относительное и абсолютное содержание Tfh1 клеток по сравнению с таковым в группе контроля (27,86% (22,36; 32,04) против 32,27% (26,02; 36,65) при р = 0,009 и 26 кл/мкл (14; 45) против 37 кл/мкл (26; 48) при р = 0,011, соответственно, рис. 2). Кроме того, нами также было отмечено увеличение доли Tfh2 клеток в циркуляции у пациентов с ТБ (20,55% (15,84; 26,20) против 16,86% (14,39; 22,05) при р = 0,022).

Далее нами были проанализированы взаимосвязи между различными популяциями В-лимфоцитов, которые являются эффекторными клетками при специфическом гуморальном ответе, и отдельными типами Tfh клеток, осуществляющими контроль за функциональной активностью В-лимфоцитов. Так, повышение содержания Tfh1 клеток коррелировало с увеличением доли IgD⁺CD27^–CD38⁺⁺ клеток-предшественников В-клеток зародышевых центров (r = 0,425 при р = 0,017), тогда как уровень Tfh17 клеток находился в обратной зависимости от данной популяции В-лимфоцитов (r = –0,370 при р = 0,040). Кроме того, нами была обнаружена положительная взаимосвязь между процентным содержанием Tfh2 клеток и активированными «наивными» В-лимфоцитами с фенотипом IgD⁺CD27^–CD38⁺ (r = 0,415 при р = 0,020). И, наконец, нами была обнаружена прямая корреляционная зависимость между уровнями «противовоспалительных» Tfh1 клеток и CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺ Breg, тогда как содержание «провоспалительных» Tfh17 находилось в обратной зависимости от уровня Breg (рис. 3).

 

Рисунок 3. Анализ взаимосвязей относительного содержания регуляторных В-клеток с фенотипом CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺ и основных субпопуляций фолликулярных Т-хелперов

Figure 3. The correlations between the frequency of CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺ B cells and the frequencies of four follicular Th cell subsets in patients with lung tuberculosis

Примечание. Статистический анализ был выполнен с помощью ранговой корреляции Спирмена.

Note. Spearman’s rho was performed to calculate correlation coefficients and their significance.

 

Обсуждение

Приведенные в настоящей работе результаты указывают на отсутствие достоверных различий по относительному и абсолютному содержанию общего пула В-клеток в периферической крови пациентов с ТБ и условно здоровых добровольцев. Однако нарушения субпопуляционного состава В-лимфоцитов позволяет говорить об активации гуморального звена иммунитета при микобактериальной инфекции. Многочисленные данные по динамике В-лимфоцитов при туберкулезе, приведенные в литературе, весьма противоречивы. Так, при исследовании уровня этой популяции лимфоцитов у пациентов с активным ТБ отмечалось не только увеличение [39] или снижение [8, 13] общего уровня В-клеток по сравнению с контрольными показателями, но в некоторых работах было показано отсутствие какой-либо динамики по данному показателю [3]. Следует отметить и тот факт, что у пациентов с ЛТИ и у пациентов на фоне проведения противотуберкулезной терапии уровни В-лимфоцитов достоверно не отличались от контрольных значений, тогда как для пациентов с активным ТБ было отмечено снижение этих клеток в циркуляции [15].

Несмотря на отсутствие изменений по содержанию общего пула В-лимфоцитов у пациентов с ТБ, нами были отмечены существенные нарушения субпопуляционого состава этой популяции лимфоцитов. Эти нарушения были связаны со снижением содержания «наивных» клеток, а также двух типов В-клеток памяти с фенотипами IgD⁺CD27⁺ и IgD^–CD27⁺, равно как и увеличением в циркулирующей крови «активированных» популяций В-лимфоцитов, включая IgD⁺CD27^–CD38⁺ активированные «наивные» В-клетки и IgD⁺CD27^–CD38⁺⁺ клетки-предшественники В-клеток зародышевых центров периферических лимфоидных органов (табл.). Следует отметить, что для пациентов с активной формой ТБ было отмечено некоторое снижение в циркуляции IgD⁺CD27^– «наивных» В-клеток, тогда как уровни клеток памяти, циркулирующих предшественников плазмабластов и CD24^hiCD38^hi клеток достоверно не изменялись по сравнению с контролем [15]. Однако отмечалось увеличение в циркуляции «атипичных» или «дважды-негативных» популяций В-клеток памяти с фенотипами CD21^–CD27^– и IgD^–CD27^–, что, как считается в настоящее время, может быть свойственно широкому кругу аутоиммунных [10] и инфекционных заболеваний, включая COVID-19 [24]. Также снижение «наивных» В-клеток при латентной форме ТБ было отмечено Roy Chowdhury и соавт. [28]. Однако приведенные выше результаты не подтверждаются наблюдениями La Manna и соавт., которые не выявили достоверных изменений по уровням IgD⁺CD27^–, IgD^–CD27⁺ и IgD^–CD27^– В-клеток у пациентов с активным и латентным ТБ, но отметили снижение доли IgD⁺CD27⁺ В-клеток у пациентов с латентной инфекцией [21]. Следует отметить, что у пациентов с МЛУ ТБ также наблюдалось снижение уровня IgD⁺CD27⁺ В-клеток памяти, а также циркулирующих предшественников плазматических клеток, тогда как уровни IgD⁺CD38⁺⁺, CD69⁺ и TLR9⁺ В-клеток достоверно возрастали относительно значений контроля [2]. Вместе с тем было показано, что уровни IgM⁺CD27⁺ В-клеток памяти и IgM⁺CD138⁺CD27⁺ циркулирующих предшественников плазмобластов достоверно снижались на фоне терапии при анализе когорты пациентов из Южной Африки [6]. Следует отметить, что нами не было выявлено изменений в содержании циркулирующих предшественников плазматических клеток с фенотипами CD38⁺⁺CD24^– и CD27⁺⁺CD38⁺⁺ (данные не приведены), которые упоминаются в некоторых цитируемых выше работах. По-видимому, нарушения в субпопуляционном составе В-клеток при туберкулезе могут зависеть от формы течения заболевания и возрастных особенностей пациентов. Несмотря на вышеприведенный факт, у некоторых пациентов оценка субпопуляционного состава В-лимфоцитов может применяться в качестве одного из маркеров для оценки эффективности применяемой терапии. Кроме того, как нами было показано ранее, выявление определенных популяций В-клеток может помочь в дифференциальной диагностике туберкулеза с другими системными гранулематозными заболеваниями [25, 31].

В ходе проведенного исследования нами было выявлено увеличение как относительного, так и абсолютного числа регуляторных В-клеток с фенотипом CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺ у пациентов с ТБ легких (рис. 2). Известно, что Breg с фенотипом CD19⁺CD24^hiCD38^hi обладают способностью подавлять дифференцировку Th1 и Th17 клеток, играющих важную роль в противотуберкулезном иммунитете, а также способствуют дифференцировке FoxP3⁺ Tregs, обладающих выраженными супрессорными свойствами, что существенно ограничивает развитие воспалительной реакции и элиминацию патогенов [9]. В рамках работы, проведенной Zhang и соавт., у пациентов с активным ТБ было отмечено увеличение IL-10-продуцирующих регуляторных В-клеток с фенотипом CD19⁺CD1d⁺CD5⁺, обладавших выраженными супрессорными свойствами, причем их уровень находился в обратной зависимости от уровня Th17 клеток [40]. Кроме того, уровень CD1d⁺CD5⁺ В-клеток в тканях пораженных МБТ легких превосходил значения, полученные для парных образцов периферической крови [18], что косвенно может свидетельствовать о важной роли этих регуляторных В-клеток в поддержании воспаления при ТБ. С другой стороны, сравнительно недавно было отмечено, что уровень CD5⁺ Breg (с фенотипом CD19⁺CD24^hiCD38^hiCD5⁺) при активном ТБ существенно снижался по сравнению со значениями контрольной группы и пациентов с ЛТИ, тогда как по уровням CD24^hiCD38^hi В-клеток все три группы достоверно не различались [11]. Таким образом, собственные результаты и данные литературы указывают на важную роль регуляторных В-клеток в патогенезе ТБ, которая, по-видимому, связана со способностью этих клеток подавлять эффективное развитие как гуморального, так и клеточного иммунного ответа, направленного на элиминацию M. tuberculosis. Поиск новых терапевтических подходов, направленных на подавление активности этих популяций В-клеток представляется весьма перспективным с точки зрения терапии ТБ.

Столь же важную роль в регуляции функций В-лимфоцитов и эффективном развитии специфического гуморального иммунного ответа играют фолликулярные Т-хелперы. Так, снижение эффективности формирования Tfh клеток было тесно связано со снижением эффективности миграции В-клеток в ткани и повышением распространения МБТ по органам лабораторных животных [34]. Более того, эффективное развитие третичной лимфоидной ткани в очагах поражения МБТ защищало от летальных доз МБТ при повторном введении патогена у приматов [17]. Было отмечено, что у пациентов с ТБ в периферической крови повышались уровни Tfh клеток с фенотипами CD4⁺CXCR5⁺, CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺ и CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺, а также повышался уровень IL-21 — одного из главных эффекторных цитокинов Tfh клеток [33]. В ходе собственных исследований нами было обнаружено снижение пула циркулирующих Tfh1 клеток у пациентов с ТБ легких (рис. 2). В настоящее время исследования, посвященные динамике различных субпопуляций Tfh клеток при инфицировании M. tuberculosis, весьма малочисленны. Нарушения в функциональной активности циркулирующих Tfh клеток отмечались в рамках исследования, проведенного Kumar и соавт. на периферической крови больных с активной формой ТБ [20]. Было показано, что не только уровень IL-21-продуцирующих клеток в крови больных был снижен относительно контрольных значений, но и концентрации данного цитокина в системном кровотоке в случае инфицирования микобактериями были ниже таковых в группе сравнения. Более того, уровень IFNg, продукция которого традиционно связывается с популяцией Tfh1 клеток, также у больных был снижен, что подтверждает полученные нами результаты по изменениям в субпопуляционном составе Tfh лимфоцитов у больных ТБ. В другом исследовании у пациентов с активной и латентной туберкулезной инфекцией Wang и соавт. показали, что при активном туберкулезном процессе в периферической крови увеличиваются Tfh2 и снижаются Tfh1 по сравнению с ЛТИ [38], что согласуется с полученными нами данными (рис. 2). Причем нами также было показано, что уровень Tfh1 положительно коррелирует с уровнем Breg периферической крови пациентов с легочным ТБ (рис. 3). Учитывая одну из функций Tfh1, заключающуюся в подавлении активации В-клеток [29], а также противовоспалительный репертуар Breg, мы предполагаем подавление активации гуморального иммунного ответа как на уровне очага воспаления, так и на уровне периферических лимфоидных органов.

Заключение

Таким образом, в рамках проведенного нами исследования были обнаружены существенные нарушения в субпопуляционном составе циркулирующих в крови В-лимфоцитов и фолликулярных Т-клеток памяти у пациентов с ТБ легких. Более того, были выявлены тесные взаимосвязи между CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺⁺ регуляторными В-лимфоцитами, с одной стороны, и субпопуляциям В-клеток и фолликулярных Т-хелперов с другой. Полученные результаты позволяют рассматривать эти популяции клеток в качестве новых маркеров для выявления пациентов с ТБ, тогда как дальнейшие исследования позволят оценить перспективность использования некоторых популяций этих клеток в качестве мишеней для терапии. Проблема диагностики ТБ и оценки иммунного статуса пациентов носит многоплановый характер и требует интеграции молекулярно-генетических, иммунологических и клинико-лабораторных подходов. Необходима стандартизация диагностических алгоритмов с учетом индивидуальных иммунологических особенностей пациента, особенно в группах высокого риска. Развитие персонализированной иммунодиагностики на основе биомаркеров T-клеточного и В-клеточного ответа представляется перспективным направлением для разработки новых тестов и критериев активности ТБ инфекции.

About the authors

Igor V. Kudryavtsev

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: igorek1981@yandex.ru

PhD (Biology), Head of the Cell Immunology Laboratory, Department of Immunology

Russian Federation, St. Petersburg

Artem A. Rubinstein

Institute of Experimental Medicine

Email: arrubin6@mail.ru

Junior Researcher, Cell Immunology Laboratory, Department of Immunology

Russian Federation, St. Petersburg

Anna A. Starshinova

Almazov National Medical Research Centre; St. Petersburg State University

Email: starshinova_777@mail.ru

DSc (Medicine), Head of the Research Department, Almazov National Medical Research Centre; Head Researcher, Laboratory of Probabilistic Methods of Analysis, Faculty of Mathematics and Computer Science, St. Petersburg State University

Russian Federation, St. Petersburg; St. Petersburg

Adilya R. Sabirova

St. Petersburg State University; Bashkir State Medical University

Email: starshinova_777@mail.ru

Junior Researcher, Laboratory of Probabilistic Methods of Analysis, Faculty of Mathematics and Computer Science, St. Petersburg State University; Assistant Professor, Department of Phthisiology, Bashkir State Medical University

Russian Federation, St. Petersburg; Ufa

Ekaterina N. Belyaeva

St. Petersburg State University

Email: igorek1981@yandex.ru

PhD (Medicine), Senior Researcher, Laboratory of Probabilistic Methods of Analysis, Faculty of Mathematics and Computer Science

Russian Federation, St. Petersburg

Dmitry A. Kudlai

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); National Research Center — Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency of Russia; Lomonosov Moscow State University

Email: D624254@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1878-4467
SPIN-code: 4129-7880

DSc (Medicine), Professor, RAS Corresponding Member, Professor of Pharmacology Department, Institute of Pharmacy, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); Leading Researcher, Laboratory of Personalized Medicine and Molecular Immunology, National Research Center — Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency of Russia; Professor of the Department of Pharmacognosy and Industrial Pharmacy, Faculty of Fundamental Medicine, Lomonosov Moscow State University

Russian Federation, Moscow; Moscow; Moscow

References

Supplementary files