The effectiveness of SARS-CoV-2 infection emergency prevention with the immunostimulating antigens complex of opportunistic pathogenic bacteria

Full Text

Введение

Пандемия COVID-19 послужила причиной гибели более 7 млн человек во всем мире и выявила недостаточную готовность мировой системы здравоохранения к борьбе с подобными биологическими угрозами. В ходе пандемии зарегистрировано несколько подъемов заболеваемости, связанных с появлением и широким распространением новых эпидемически значимых вариантов SARS-CoV-2. Так, высокая изменчивость нового коронавируса в условиях пандемического распространения способствовала появлению варианта Omicron, что привело к резкому снижению эффективности вакцинопрофилактики заболевания [11, 13]. В мае 2023 г. ВОЗ сообщила об окончании пандемии COVID-19, однако вероятность появления новых антигенных вариантов вируса и связанного с этим роста заболеваемости остается высокой. Кроме того, важным фактором возникновения новых эпидемий коронавирусных заболеваний является возможность межвидовой трансмиссии коронавирусов от животных человеку, что подтверждается вспышками тяжелых респираторных заболеваний, вызванных коронавирусами животного происхождения SARS-CoV и MERS-CoV, происходившими в разных странах мира в начале XXI века. В связи с вышеизложенным, необходимость поиска препаратов, направленных на стимуляцию врожденного иммунитета, для неспецифической профилактики коронавирусных заболеваний не вызывает сомнений.

Эффективным подходом к активации врожденного иммунитета для экстренной профилактики инфекционных заболеваний различной этиологии является применение препаратов на основе бактериальных лизатов [3, 4]. Профилактическое применение таких препаратов снижает вероятность инфицирования и возникновения опасных осложнений. Защитные механизмы препаратов на основе бактериальных лизатов основаны на активации основных эффекторов врожденного и приобретенного иммунитета [3]. В последние десятилетия появились новые данные о роли врожденного иммунитета в формировании резистентности к широкому спектру возбудителей. Установлены механизмы распознавания микроорганизмов на основе наличия у них общих патогенассоциированных молекулярных структур (pathogen-associated molecular patterns — PAMPs) с помощью наследственно закодированных рецепторов клеток-эффекторов врожденного иммунитета [3, 18, 19]. В Российской Федерации зарегистрирован иммуностимулирующий препарат Иммуновак-ВП-4, в состав которого входит комплекс антигенов четырех видов условно-патогенных бактерий (КАУПБ): Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus. В основе механизма лечебно-профилактического действия КАУПБ лежит активность бактериальных антигенов, содержащих РАМРs (липополисахарид, пептидогликан, тейхоевая кислота, белковые антигены клеточных стенок). В ряде исследований показано, что КАУПБ эффективен в лечении и экстренной профилактике острых респираторных, хронических аллергических и воспалительных заболеваний [1, 3, 8]. В связи с вышеизложенным, нам представилось интересным исследовать эффективность неспецифической профилактики инфекции SARS-CoV-2 с помощью иммуностимулирующего препарата КАУПБ.

Материалы и методы

Исследуемый препарат. В работе использовали КАУПБ, входящий в состав иммуностимулирующего лекарственного препарата Иммуновак-ВП-4 (регистрационное удостоверение: ЛСР-001293/10), представляющего собой раствор для интраназального, перорального, ингаляционного и подкожного введения.

Вирус. Для моделирования новой коронавирусной инфекции использовали Ухань-подобный штамм SARS-CoV-2 «Dubrovka» (идентификационный номер GenBank: MW14307.1), который был выделен летом 2020 г. у пациента с COVID-19 и охарактеризован в ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова [2].

Накопление и титрование SARS-CoV-2 осуществляли в культуре клеток почки африканской зеленой мартышки Vero CCL-81 (ATCC) согласно ранее описанному протоколу [2]. С целью накопления вируса клетки заражали малой дозой штамма «Dubrovka» (множественность заражения от 0,01 до 0,0001) и инкубировали 3–4 суток при 37°C в атмосфере с 5% CO₂. После появления выраженного цитопатического эффекта собирали вируссодержащую жидкость, очищали от клеточных обломков центрифугированием, делали аликвоты, титровали и замораживали при –80°C до дальнейшего использования. Определение титра вируса проводили путем определения конечной точки цитопатического эффекта на культуре клеток. Расчет титра осуществляли по методу Ramakrishnan M.A. [23] и выражали в lg ТЦД₅₀/мл.

Моделирование коронавирусной пневмонии проводили на самках золотистых сирийских хомячков (Mesocricetus auratus, далее — хомячки) 6–8-недельного возраста, полученных из питомника Института биоорганической химии РАН (г. Пущино, Московская область). Заражение животных проводили интраназально под легким наркозом изофлураном, вводя 100 мкл вирусной суспензии в обе ноздри в дозе 10³ ТЦД₅₀. За состоянием животных осуществляли ежедневное наблюдение на протяжении всего эксперимента. Содержание животных соответствовало требованиям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в научных целях [14], а также стандартам по устройству и содержанию вивариев (ГОСТ 33215-2014). По окончанию эксперимента животных безболезненно умерщвляли путем передозировки изофлурана с последующей дислокацией шейных позвонков согласно внутренним нормативам учреждения. Все манипуляции с животными были одобрены Локальным этическим комитетом ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова до начала эксперимента (Протокол № 2 от 24.05.2021 г.). При выполнении исследований соблюдались все институциональные и национальные стандарты по работе с лабораторными животными.

Изучение профилактического потенциала КАУПБ в отношении инфекции SARS-CoV-2 in vivo. Профилактическое применение КАУПБ проводили путем введения хомячкам препарата в различных дозах и схемах введения в соответствии протоколами экспериментов 1 и 2 (табл. 1 и 2). После введения препарата животных интраназально заражали штаммом SARS-CoV-2 «Dubrovka». В рамках первого эксперимента было сформировано пять экспериментальных групп, каждая из которых включала по шесть хомячков, распределенных по группам случайным образом (табл. 1).

 

Таблица 1. Схема первого эксперимента по оценке эффективности различных дозировок и схем введения КАУПБ для экстренной профилактики инфекции SARS-CoV-2 у хомячков

Table 1. Study design of the first experiment to evaluate the efficacy of different doses and administration regimens of ACOPB for the emergency prevention of SARS-CoV-2 infection in Syrian hamsters

Дни Days	Группа 1 Group 1	Группа 21/2 дозы Group 21/2 dose	Дни Days	Группа 3 Group 3	Дни Days	Группа 4/Спрей Group 4/Spray	Группа 5/ВК Group 5/VC
1	1 капля НАЗ 1 drop NAS	1 капля НАЗ 1 drop NAS	–	–	–	–	–
2	2 капли НАЗ 2 drop NAS	2 капли НАЗ 2 drop NAS	–	–	–	–	–
3	4 капли НАЗ 4 drop NAS	4 капли НАЗ 4 drop NAS	1	1 капля НАЗ 1 drop NAS	–	–	–
5	0,25 мл ОР 0.25 mL OR	0,25 мл ОР 0.25 mL OR	2	2 капли НАЗ 2 drops NAS	1	2×НАЗ, 2×ОР 2×NAS, 2×OR	–
8	1 мл ОР 1 mL OR	1 мл ОР 1 mL OR	3	4 капли НАЗ 4 drops NAS	2	2×НАЗ, 2×ОР 2×NAS, 2×OR	–
11	2 мл ОР 2 mL OR	2 мл ОР 2 mL OR	5	0,5 мл ПК 0.5 mL SC	3	2×НАЗ, 2×ОР 2×NAS, 2×OR	–
14	2 мл ОР 2 mL OR	2 мл ОР 2 mL OR	8	0,5 мл ПК 0.5 mL SC	4	2×НАЗ, 2×ОР 2×NAS, 2×OR	–
17	2 мл ОР 2 mL OR	2 мл ОР 2 mL OR	11	0,5 мл ПК 0.5 mL SC	5	2×НАЗ, 2×ОР 2×NAS, 2×OR	–
18/0	Заражение Inoculation		12/0	Заражение Inoculation	6/0	Заражение Inoculation
3	Взятие легких Taking of lungs		3	Взятие легких Taking of lungs	3	Взятие легких Taking of lungs
6	Взятие легких Taking of lungs		6	Взятие легких Taking of lungs	6	Взятие легких Taking of lungs

Примечание. НАЗ — введение интраназально; ОР — введение перорально; ПК — введение подкожно; ВК — вирусный контроль (контрольная зараженная группа без препарата). «2×» означает 2 впрыска спрея.

Note. NAS — intranasal administration; OR — peroral administration; SC — subcutaneous administration; VC — viral control (infected control group without the drug). “2×” means 2 spray injections

 

Во второй серии экспериментов животных случайным образом разделили на три группы по шесть хомячков (табл. 2).

 

Таблица 2. Схема второго эксперимента по оценке эффективности различных дозировок и схем введения КАУПБ для экстренной профилактики инфекции SARS-CoV-2 у хомячков

Table 2. Study design of the second experiment to evaluate the efficacy of different doses and administration regimens of ACOPB for the emergency prevention of SARS-CoV-2 infection in Syrian hamsters

Дни Days	Группа 1/Спрей Group 1/Spray	Группа 2/Ингаляция Group 2/Inhalation	Группа 3/ВК Group 3/VC
1	2×НАЗ, 2×ОР 2×NAS, 2×OR	3 мл/15 мин 3 mL/15 min	–
2	2×НАЗ, 2×ОР 2×NAS, 2×OR	3 мл/15 мин 3 mL/15 min	–
3	2×НАЗ, 2×ОР 2×NAS, 2×OR	3 мл/15 мин 3 mL/15 min	–
4	2×НАЗ, 2×ОР 2×NAS, 2×OR	3 мл/15 мин 3 mL/15 min	–
5	2×НАЗ, 2×ОР 2×NAS, 2×OR	3 мл/15 мин 3 mL/15 min	–
6/0	Инфицирование SARS-CoV-2 | Challenge with SARS-CoV-2
2	Взятие легких | Taking of lungs
3	Взятие легких | Taking of lungs
5	Взятие легких | Taking of lungs

Примечание. НАЗ — введение интраназально; ОР — введение перорально; ПК — подкожное введение; ВК — вирусный контроль (контрольная зараженная группа без препарата).

Note. NAS — intranasal administration; OR — peroral administration; SC — subcutaneous administration; VC — viral control (infected control group without the drug).

 

Протективную активность КАУПБ против инфекции SARS-CoV-2 у сирийских хомячков оценивали по изменению массы тела, титру вируса в легких и морфологическим изменениям в легочной ткани у леченных и контрольных животных. Ежедневно фиксировали данные массы тела, при этом изменения рассчитывали индивидуально для каждого хомячка, выражая результат в процентах относительно исходного веса до заражения. Итоговые данные представлены как средние значения изменения веса по группе в процентах с указанием стандартной ошибки (SE).

В исследованиях на хомячках препарат готовили согласно инструкции по применению и применяли в количестве, соответствующем однократной дозе для человека. Для введения КАУПБ использовали различные способы: интраназально и перорально препарат вводили хомячкам по одной капле (50 мкл), подкожно — стерильным шприцем в объеме 0,5 мл. Для введения в виде спрея применяли специальную насадку-распылитель, осуществляя по два введения в рот и в нос (примерно 500 мкл на голову). Ингаляционное введение осуществляли в закрытой камере (35 × 20 × 15 см) с использованием компрессорного ингалятора C25 (OMRON, Япония) в режиме: 3 мл/15 минут (0,2 мл/мин), размер аэрозольных частиц 2,5–2,75 мкм.

Анализ легочной ткани хомячков. В разные сроки после заражения (2 и 6 сутки в первом эксперименте; 2, 3 и 5 сутки во втором) у животных были взяты образцы легких с учетом правил асептики и антисептики. Для морфологического анализа использовали правое легкое — его трижды промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и помещали в пробирку с 10% забуференным нейтральным формалином и передавали для гистологического исследования в отделение экспериментальной фармакологии и токсикологии МНИОИ им. П.А. Герцена (Москва). Далее заливали образцы легкого в парафин, готовили серийные срезы толщиной 3–5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином и оценивали степень патологических изменений в легких.

Левое легкое использовали для оценки инфекционной активности вируса. Его гомогенизировали в 1 мл охлажденного стерильного ФСБ с использованием гомогенизатора «Tissue Lyser LT» (Qiagen). Полученный гомогенат освобождали от обломков ткани центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант использовали для титрования вируса в культуре клеток Vero CCL-81 по конечной точке ЦПД, оценивая выживаемость клеток с помощью МТТ-теста [21]. Критериями противовирусной активности было уменьшение вирусной нагрузки в легких не менее чем на 1,5 lg ТЦД₅₀/мл, достоверная защита от потери массы тела (р < 0,05), а также меньшая выраженность патоморфологических изменений в легких по сравнению с контрольной группой не леченных животных.

Меры биологической безопасности. Все манипуляции с вирусом SARS-CoV-2, включая накопление вируса в культуре клеток, заражение и содержание животных, осуществлялись в лаборатории 3-го уровня биобезопасности, соответствующей требованиям, предъявляемым к работе с ПБА II группы патогенности.

Оценка влияния КАУПБ на содержание секреторного иммуноглобулина А (sIgA) в верхних дыхательных путях у пациентов с COVID-19. Исследование проводили в период с декабря 2020 г. по май 2021 г. Пациенты (n = 78) с диагнозом COVID-19 средней степени тяжести (поражение легких на уровне 25–50%) в возрасте от 18 до 60 лет, проходившие лечение в стационаре, были разделены случайным образом на две группы. Пациенты первой группы (n = 45, средний возраст 45,2±13,8 года, 30 мужчин и 15 женщин) получали только базисную терапию в соответствии с «Временными методическими рекомендациями по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции (COVID-19) в Российской Федерации». Пациенты второй группы (n = 33, средний возраст 41,9±9,9 года, 24 мужчины и 9 женщин) в дополнение к базисной терапии ежедневно, с первого по десятый день госпитализации, принимали раствор препарата КАУПБ, приготовленный согласно инструкции по применению, в дозе 20 мг (2 мл) внутрь и по 1 мг (2 капли) в каждую ноздрю интраназально. Клинико-лабораторные характеристики включенных в исследование пациентов представлены в табл. 3.

 

Таблица 3. Клинико-лабораторные характеристики пациентов с результатами КТ ОГК

Table 3. Clinical and laboratory characteristics of the studied patients and indicators of computed tomography of the chest organs

Показатели | Parameters	Вся выборка (n = 78)
	M±SD	Me (Q1; Q3)
Возраст, лет Age, years	44,7±10,9	43 (37,2; 49)
Индекс массы тела, кг/м2 Body mass index, kg/m2	29,5±3,01	30 (27,1; 32,3)
Длительность заболевания до госпитализации, дни Duration of illness before hospitalization, days	7,3±1,64	7 (6; 8)
Температура тела, °С Body temperature, °C	37,5±0,43	37,5 (37,1; 37,8)
Частота дыхания, мин Respiratory rate, min	23,7±1,25	24 (23; 24)
Частота сердечных сокращений, в мин Heart rate, in min	89,8±7,94	88 (82; 100)
SpO2, %	92,8±1,01	92,5 (92; 93)
Лейкоциты, ×109/л White blood cells, 109/L	6,5±2,8	6,0 (4,3; 7,5)
Тромбоциты, ×109/л Platelets, 109/L	213,9±78,39	189 (150; 270)
Лимфоциты, ×109/л Lymphocytes, 109/L	0,9±0,37	0,8 (0,7; 0,9)
Лимфоциты, % Lymphocytes, %	15,3±6,1	15,6 (11,9; 21,8)
СРБ, мг/л CRP, mg/L	66,7±27,85	74 (42; 96)
Фибриноген, г/л Fibrinogen, g/L	5,4±1,37	5,4 (4,4; 5,7)
Д-димеры D-dimers	0,6±0,33	0,6 (0,4; 0,9)
КТ ОГК, % поражения легких C CT, % of lung damage	44,7±5,26	45 (39; 50)

Примечание. SpO₂ — насыщение крови кислородом, СРБ — С-реактивный белок, КТ ОГК — компьютерная томография органов грудной клетки.

Note. SpO₂ — blood oxygen saturation, CRP — C-reactive protein, C CT — chest computed tomography.

 

У всех пациентов диагноз COVID-19 был подтвержден выявлением в мазке из ротоглотки РНК SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР-РВ, а также клинико-рентгенологическими данными. Базисная терапия заключалась в применении фавипиравира (200 мг по схеме); эноксапарина (0,4 мг/сут подкожно); дексаметазона (8–12 мг/сут). При уровне С-реактивного белка ≥ 60 мг/л внутривенно применяли тоцилизумаб в дозе 400 мг/сут.

Дополнительно образцы биоматериала брали у здоровых, непривитых и не болевших ранее COVID-19 медицинских работников (n = 10). Показатели, полученные при исследовании этих пациентов, были приняты за норму.

В начале исследования до начала лечения (1-й день), перед выпиской из стационара (14-й день), а также через 30 дней после начала лечения у пациентов брали образцы биоматериала. Взятие образцов проводили из носовых ходов (соскоб со слизистой оболочки носа), глотки (мазок) и ротовой полости (слюна). Слюну отбирали под наблюдением врача утром, при естественном выделении без кашля, до еды и чистки зубов. Соскоб брали цитощеткой типа D (Юнона, Россия) в полипропиленовые центрифужные микропробирки 1,5 мл с физиологическим раствором. Для осаждения эпителиальных клеток образцы центрифугировали (5 мин, 2000 об/мин) Образцы биоматериала хранили и транспортировали в лабораторию при температуре от +2 до +8°C. В течение 24 часов с момента сбора образцы биоматериала исследовали на содержание секреторного иммуноглобулина А (sIgA) методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора реагентов «IgA секреторный-ИФА-БЕСТ» (Вектор-Бест, Россия) согласно инструкции по применению. ИФА проводили с использованием сертифицированного лабораторного оборудования на базе ЦКП ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова.

Статистический анализ. Расчеты и графические построения производились с использованием программ GraphPad Prism и R Project for Statistical Computing. Данные изменения массы тела хомячков были подвергнуты статистической обработке в программе Microsoft Excel с использованием метода Краскела–Уоллиса. Достоверность различий в значениях титров вируса в органах хомячков и уровней sIgA у разных групп определяли согласно U-критерию Манна–Уитни с 95% доверительным интервалом (ДИ). Для сравнения показателей связанных выборок применяли тест Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Противовирусная активность КАУПБ в отношении инфекции SARS-CoV-2 на животной модели коронавирусной пневмонии

В первом эксперименте на хомячках исследовано влияние разных способов и дозировок введения КАУПБ на репродукцию SARS-CoV-2 в легких и развитие пневмонии, в том числе при интраназальном и пероральном введении (группа 1), интраназальном и пероральном введении ¹/₂ дозы (группа 2), интраназальном и подкожном введении (группа 3), интраназальном введении в виде спрея (группа 4) в сравнении с контрольными животными, не получавшими препарат (группа 5). Использование КАУПБ подкожно и в форме спрея показало выраженную противовирусную активность на животной модели COVID-19. Профилактическое введение препарата хомячкам не приводило к статистически значимым изменениям веса животных по сравнению с группой зараженных, но не леченных хомячков. Вместе с тем как подкожное введение препарата, так и применение спрея приводило к значительному снижению вирусной нагрузки в легких на 3 и 6 сутки после заражения (≥ 2,5 lg ТЦД₅₀/мл) относительно зараженных, но не леченных животных (p < 0,05) (рис. 1).

 

Рисунок 1. Влияние КАУПБ на содержание SARS-CoV-2 в легких хомячков на 3 и 6 дни после заражения при различных дозировках и схемах введения (Эксперимент 1). Титр SARS-CoV-2 в гомогенатах легких на 3 и 6 сутки после заражения

Figure 1. The effect of ACOPB on the content of SARS-CoV-2 in the lungs of hamsters on days 3 and 6 after infection at various dosages and administration regimens (Experiment 1). SARS-CoV-2 titer in lung homogenates on days 3 and 6 after infection

Примечание. Группа 1 — интраназальное и пероральное введение, группа 2 — интраназальное и пероральное введение половинной дозы препарата, группа 3 — интраназальное и подкожное введение, группа 4 — введение в виде спрея, группа 5 — вирусный контроль (без препарата). * — разница между исследуемой группой и вирусным контролем достоверная (р < 0,05).

Note. Group 1 — intranasal and oral administration, Group 2 — intranasal and oral administration of half the dose of the drug, Group 3 — intranasal and subcutaneous administration, Group 4 — spray administration, Group 5 — viral control (without the drug). * — significant difference between the study group and the viral control (p < 0.05).

 

Гистологический анализ показал, что у животных, не получавших препарат (вирусный контроль, группа 5), на третьи сутки после заражения формировались выраженные воспалительные и деструктивные изменения, характерные для интерстициальной вирусной пневмонии: в легочной ткани отмечались обширные зоны уплотнения и сниженной воздушности, которые могли занимать до 30–60% площади среза. В группах 1 и 2, где КАУПБ вводили интраназально (капли) и перорально, морфологическая картина легких не отличалась от таковой у контрольных животных — у всех животных развилась выраженная интерстициальная пневмония. Среди хомячков, получавших препарат интраназально и подкожно (группа 3), у одного животного был выявлен крупный очаг интерстициальной пневмонии с признаками экссудации, аналогичный изменениям в контрольной группе, а у другого — небольшие и средние очаги альвеолита при сохранении нормальной структуры остальной легочной ткани. У остальных особей этой группы патологии не обнаружено. При применении КАУПБ в виде спрея (группа 4), легкие всех животных сохраняли нормальное строение, признаки вирусной пневмонии отсутствовали. Таким образом, введение КАУПБ подкожно или в форме спрея способствовало улучшению морфологического состояния легких у хомячков.

Учитывая, что в первом эксперименте наилучший профилактический эффект был отмечен при использовании КАУПБ в форме спрея, было решено воспроизвести эти результаты в независимом эксперименте. Также нам представилось интересным оценить эффективность введения препарата в виде аэрозоля, формируемого компрессионным ингалятором (табл. 2).

Результаты второго эксперимента показали, что как спрей, так и ингаляционное введение КАУПБ обеспечивали выраженную защиту животных от инфекции SARS-CoV-2: в обеих группах на 3 и 5 дни исследования наблюдалось значительное снижение вирусной нагрузки в легких хомячков (рис. 2). Титр вируса в легких хомячков, получавших препарат, на 3 сутки после заражения был на 3,4 (спрей) и 4,4 (ингаляция) lg ТЦД₅₀/мл ниже, чем в контрольной группе (p < 0,05). К 5 дню после заражения наблюдаемая разница в титре вируса у животных первой и второй групп с вирусным контролем имела тенденцию к уменьшению, но оставалась при этом достоверной (p < 0,05). Применение КАУПБ также защищало животных от потери веса. Если животные контрольной группы потеряли в весе 5,6±2,8%, то животные, получавшие КАУПБ в виде спрея или ингаляционно, на 3 сутки после заражения в среднем прибавили в весе на 4,2±3,0% (p < 0,05) и 8,8±1,3% (p < 0,001) соответственно.

 

Рисунок 2. Влияние КАУПБ на содержание SARS-CoV-2 в легких хомячков на 3 и 6 дни после инфицирования при различных дозировках и схемах введения (Эксперимент 2). Титр SARS-CoV-2 в гомогенатах легких на 3 и 6 сутки после заражения

Figure 2. The effect of ACOPB on the content of SARS-CoV-2 in the lungs of hamsters on days 3 and 6 after infection at various dosages and administration regimens (Experiment 2). SARS-CoV-2 titer in lung homogenates on days 3 and 6 after infection

Примечание. Группа 1 — введение в виде спрея, группа 2 — ингаляционное введение, группа 3 — вирусный контроль (без препарата). (*) — разница между исследуемой группой и вирусным контролем достоверная (р < 0,05).

Note. Group 1 — spray administration, Group 2 — inhalation administration, Group 3 — viral control (without the drug). * — significant difference between the study group and the viral control (p < 0.05).

 

Влияние КАУПБ на клиническое течение заболевания и секрецию sIgA у пациентов с диагнозом COVID-19 средней степени тяжести

В ходе клинического наблюдения, которое проводилось, протяжении всего срока исследования, у пациентов, принимавших КАУПБ (группа 2), не было выявлено системных или местных реакций. В то же время у пациентов второй группы отмечалось достоверное уменьшение срока госпитализации (16 [11–20] дней), по сравнению с первой группой (19 [16–21] дней), получавшей только базисную терапию (p = 0,05). Для группы пациентов, получавших КАУПБ, было также характерно статистически значимое уменьшение длительности лихорадки в среднем до 1 дня [от 0,5 до 2], тогда как во второй группе, получавшей только базисную терапию, лихорадка длилась в среднем 3 дня [от 0,5 до 6] (p = 0,03).

Определение уровня sIgA в различных участках верхних дыхательных путей на момент госпитализации показало значительное отличие концентрации sIgA в слюне и соскобах из носа от соответствующих показателей в норме (табл. 4).

 

Таблица 4. Концентрация sIgA в слюне, назальных и фарингеальных мазках (при госпитализации)

Table 4. Concentration of sIgA in saliva, nasal and pharyngeal swabs (at the time of hospitalization)

Точка отбора Site of sampling	sIgA — Med(Q1; Q3)	Норма	p
В слюне In saliva	172,1 (86,9; 244,0)	71,7	< 0,001
Соскоб из носа Nasal scraping	91,4 (42,3; 145,9)	29,9	< 0,001
Соскоб из глотки Pharyngeal scraping	4,8 (0,7; 20,0)	6,5	> 0,05

Примечание. p — тест Вилкоксона.

Note. p — Wilcoxon signed-rank test.

 

Концентрация sIgA в различных участках дыхательных путей у пациентов с COVID-19 изменялась по-разному и зависела от проводимого лечения (рис. 3). Наиболее выраженные отличия в уровне sIgA выявлены между пациентами первой и второй групп в соскобах из носа (рис. 3А). На протяжении всего исследования уровень sIgA в соскобах из носа пациентов второй (контрольной) группы неуклонно и достоверно снижался с 1-го по 30-й день исследования: 99,9 (58,6–178,0) мг/л на 1-й день, 59,0 (21,9–138,1) на 14-й день и 37,3 (8,4–66,9) мг/л на 30-й день (р = 0,007). Уровень sIgA в соскобах из носа пациентов первой группы (КАУПБ) оставался стабильным в период между 1-м и 14-м днем наблюдения (p = 0,07), но к 30-му дню наблюдения достоверно увеличился до 113,4 (39,8–156,7) мг/л по сравнению со значениями, измеренными на 14-й день наблюдения — 60,2 (23,3–102,9) мг/л (p = 0,03).

 

Рисунок 3. Концентрация sIgA на 1-й, 14-й и 30-й день наблюдения в соскобе из носа (А), соскобе из глотки (Б) и слюне (В) у пациентов с COVID-19 средней степени тяжести

Figure 3. sIgA concentrations on days 1, 14, and 30 of follow-up in nasal scraping (A), pharyngeal scraping (B), and saliva (C) in patients with moderate COVID-19

Примечание. Контроль — первая группа пациентов, получавших базисную терапию (n = 45); КАУПБ — вторая группа пациентов (n = 33), получавших КАУПБ в дополнение к базисной терапии; Норма — группа здоровых непривитых и не болевших ранее COVID-19 лиц (n = 10).

Note. Control was the first group of patients who received basic therapy (n = 45); ACOPB was the second group of patients (n = 33) who received ACOPB in addition to basic therapy; Norm was a group of healthy, unvaccinated and previously free from COVID-19 (n = 10).

 

Сходная динамика подъема уровня sIgA с 1-го по 30-й день наблюдения выявлена в соскобе из глотки у пациентов второй группы, получавшей КАУПБ дополнительно к базисной терапии — с 1,5 (0,2–16,5) мг/л до 29,8 (3,6–106,8) мг/л (p = 0,02) (рис. 3Б). В то же время, в соскобе из глотки пациентов контрольной группы достоверных изменений в концентрации sIgA не выявлено. Показатели уровня sIgA на протяжении всего периода наблюдения соответствовали нормальным в обеих группах.

Концентрация sIgA в слюне пациентов первой и второй групп в период с 1 по 30 день наблюдения была достоверно выше, чем у группы здоровых лиц. В то же время достоверных различий в уровне sIgA между группами исследования и в динамике этого показателя не было обнаружено на протяжении всего периода наблюдения (рис. 3В).

Обсуждение

Быстрая эволюция и появление новых антигенных вариантов нового коронавируса стало причиной снижения эффективности вакцинопрофилактики COVID-19. Несмотря на формирование популяционного иммунитета в результате естественно перенесенной инфекции или вакцинопрофилактики, сохраняется высокая вероятность новых подъемов заболеваемости. В этих условиях разработка подходов к борьбе с заболеванием, направленных на активацию неспецифических эффекторов врожденного иммунитета непосредственно во входных воротах инфекции, приобретает особую актуальность. Интраназальное введение иммуномодулирующих препаратов на основе бактериальных лизатов способствует активации мукозального иммунитета, и, как следствие, подавлению размножения и распространения патогена, а также способно предотвращать реинфекцию [4, 8]. Данные литературы свидетельствуют о важности факторов мукозального иммунитета, включая sIgA, в борьбе с SARS-CoV-2 [10, 20]. Полученные нами на животной модели коронавирусной пневмонии результаты подтвердили важность стимуляции эффекторов врожденного иммунитета на слизистых оболочках дыхательных путей комплексом бактериальных антигенов КАУПБ в защите от нового коронавируса. В экспериментах на сирийских хомячках определены наиболее эффективные способы и схемы введения КАУПБ. Профилактическое введение препарата животным в виде спрея и ингаляционно оказалось наиболее эффективным, что проявлялось в защите хомячков от потери веса, снижении вирусной репродукции в легких и отсутствии выраженных нарушений морфологии легочной ткани.

Положительное влияние препарата на мукозальный иммунитет и клиническое течение заболевания получило подтверждение в проведенных клинических исследованиях по сочетанному интраназальному и пероральному применению КАУПБ у пациентов с COVID-19 [5, 6, 7, 9, 16, 17]. В настоящем исследовании показано достоверное повышение уровня sIgA в верхних отделах респираторного тракта у пациентов с COVID-19 средней тяжести, получавших в дополнение к базисному лечению иммуностимулирующий препарат КАУПБ. К 30-му дню наблюдения уровень sIgA в фарингеальных и назальных мазках был выше у пациентов, ежедневно получавших КАУПБ перорально и интраназально с первого по десятый день пребывания в стационаре. Важно отметить, что применение КАУПБ в дополнение к базисному лечению также способствовало достоверному снижению сроков госпитализации и уменьшению длительности лихорадки. Вполне вероятно, что КАУПБ также оказал положительное влияние и на другие показатели врожденного и адаптивного иммунитета, что способствовало улучшению общего состояния пациентов.

Уровень секреторного IgA, обнаруживаемого в просвете дыхательных путей или кишечника, является отражением напряженности иммунного ответа на вирусную или бактериальную инфекцию [12, 15, 22]. Важнейшей защитной функцией sIgA при вирусной инфекции является связывание с поверхностными антигенами вируса и предотвращение его рецепторно-опосредованного проникновения в клетки слизистой оболочки. Можно предположить, что активация под влиянием КАУПБ синтеза sIgA в верхних отделах дыхательных путей у пациентов COVID-19 не только вносит вклад в улучшение клинического состояния пациентов, но и в дальнейшем будет способствовать снижению частоты присоединения и других респираторных инфекций. Однако для определения точных механизмов противокоронавирусной активности КАУПБ, отдаленного клинического эффекта и роли sIgA необходимы дальнейшие исследования.

Ранее Егоровой Н.Б. с соавт. была сформулирована иммунотерапевтическая концепция использования КАУПБ для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами и вирусами [3]. Согласно этой концепции, микробные антигены, входящие в состав КАУПБ, активируют не только адаптивный иммунитет к четырем соответствующим видам условно-патогенных микроорганизмов, но и активируют эффекторы врожденного иммунитета, программируют дифференцировку Т-лимфоцитов по Тh1-типу, корректируют синтез изотипов иммуноглобулинов в сторону повышения IgG, IgA, sIgA и снижения IgE, стимулируют фагоцитарную активность макрофагов и выработку α- и γ-интерферонов. Клиническое применение КАУПБ позволяло значительно сократить число и тяжесть рецидивов (обострений) различных заболеваний — аллергических, гнойно-воспалительных, герпесвирусной и острой респираторной вирусной инфекции и др. [3]. Таким образом, противоинфекционная активность КАУПБ проявляется в отношении широкого спектра вирусов и условно-патогенных бактерий и определяется в первую очередь неспецифическими механизмами врожденного иммунитета.

Заключение

Профилактическое введение КАУПБ сирийским хомячкам в виде спрея и ингаляционно способствовало защите организма от инфекции нового коронавируса и его патогенного воздействия. Протективная активность препарата проявлялась в защите хомячков от потери веса, снижении вирусной репродукции в легких и отсутствии выраженных нарушений морфологии легочной ткани. Применение КАУПБ в составе комплексной терапии пациентов с COVID-19 средней степени тяжести было ассоциировано с повышением концентрации sIgA в носовой полости и глотке и с улучшением клинического состояния пациентов. Полученные результаты показали, что иммуностимулятор бактериального происхождения КАУПБ представляет интерес для дальнейшего исследования в качестве средства экстренной профилактики и лечения новой коронавирусной инфекции.

Благодарности

Выражаем благодарность за участие в работе сотрудникам ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова (Москва) Глубоковой Е.А., Карташовой Н.П., а также сотрудникам МНИОИ им. П.А. Герцена (Москва) Труновой Г.В. и Хохловой В.А. за проведение гистологического исследования легких.

About the authors

Oxana A. Svitich

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; I.M. Sechenov First State Medical University (Sechenov University)

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1757-8389

DSc (Medicine), Professor, RAS Full Member, Director of I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Professor of the Department of Microbiology, Virology and Immunology, I.M. Sechenov First State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Vitaly V. Zverev

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; I.M. Sechenov First State Medical University (Sechenov University)

Email: vitalyzverev@outlook.com
ORCID iD: 0000-0001-5808-2246

DSc (Medicine), Professor, RAS Full Member, Scientific Director, I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russian Federation; Head of the Department of Microbiology, Virology and Immunology, I.M. Sechenov First State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Irina A. Leneva

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: wnyfd385@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7755-2714

DSc (Biology), Head of Laboratory of Experimental Virology

Russian Federation, Moscow

Natalia A. Mikhailova

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: n_michailova@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-6652-2093

DSc (Medicine), Professor, Head of Laboratory of Protective Antigens

Russian Federation, Moscow

Anna V. Ivanina

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: ivanina.anna97@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7289-693X

Junior Researcher, Laboratory of Experimental Virology

Russian Federation, Moscow

Evgeny B. Faizuloev

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7385-5083

DSc (Biology), Head of Laboratory of Applied Virology

Russian Federation, Moscow

Anastasiia V. Gracheva

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: anastasiia.gracheva.95@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8428-4482

Researcher, Laboratory of Molecular Virology

Russian Federation, Moscow

Ekaterina R. Korchevaya

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: c.korchevaya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6417-3301

Junior Researcher, Laboratory of Applied Virology

Russian Federation, Moscow

Alena V. Soldatenkova

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: sol.alena.v@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5480-1397

Leading Researcher, Laboratory of Protective Antigens

Russian Federation, Moscow

Mikhail P. Kostinov

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; I.M. Sechenov First State Medical University (Sechenov University)

Email: monolit.96@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1382-9403

DSc (Medicine), Professor, RAS Corresponding Member, Head of the Laboratory of Vaccine Prophylaxis and Allergic Disease Immunotherapy, I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Head of Department of Epidemiology and Modern Vaccination Technologies, I.M. Sechenov First State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Valery N. Osiptsov

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Medical Institute of Continuing Education, Russian Biotechnological University

Email: valetsosiptsov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1027-7620

Researcher, Laboratory of Vaccine Prophylaxis and Allergic Disease Immunotherapy, I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Lecturer, Department of Internal Medicine, Medical Institute of Continuing Education, Russian Biotechnological University

Russian Federation, Moscow; Moscow

Viliya V. Gaynitdinova

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; I.M. Sechenov First State Medical University (Sechenov University)

Email: vv_08@mail.ru
SPIN-code: 9128-7119

DSc (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Vaccine Prophylaxis and Allergic Disease Immunotherapy, I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Professor of the Department of Pulmonology, N.V. Sklifosovskiy Institute of Clinical Medicine, I.M. Sechenov First State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Anna E. Vlasenko

Samara State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: vlasenkoanna@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0001-6454-4216

PhD (Tech.), Head Researcher, Center for Evidence-Based Medicine and Biostatistics

Russian Federation, Samara

Irina B. Semenova

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: bsemenova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6630-4838

DSc (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Therapeutic Vaccines

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files