In vivo comparative analysis of live influenza vaccine candidates obtained by reverse genetics and classical reassortment

Full Text

Введение

Постоянный контроль за циркуляцией вирусов гриппа и необходимость регулярного обновления вакцинных препаратов ставят задачи максимально быстрого и эффективного получения актуальных вакцинных штаммов. Среди широкого разнообразия существующих гриппозных вакцин особое место занимают живые и инактивированные реассортантные вакцины, штаммы для которых готовятся скрещиванием актуального эпидемического вируса с вирусом-донором генов, кодирующих внутренние белки. В настоящей работе речь идет о реассортантных вакцинных штаммах живой гриппозной вакцины (ЖГВ). Существует два пути получения реассортантных штаммов: (1) с применением метода классической (естественной) реассортации (natural reassortment, NR) в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) или (2) генно-инженерная сборка с использованием плазмид (reverse genetics, RG).

От используемого метода зависит продолжительность работы над получением штаммов ЖГВ, а это является очень важным критерием в условиях необходимости оперативной подготовки актуальных сезонных и пандемических вакцин. В настоящее время вакцинные штаммы для ЖГВ в России получают методом классической реассортации. Этот метод хорошо зарекомендовал себя за годы использования и позволяет получать вакцинные штаммы, стабильно наследующие от донора аттенуации признаки безопасности — температурочувствительность и холодоустойчивость (ТЧ/ХА) репродукции. Однако метод классической реассортации достаточно трудоемкий и не гарантирует быстрого получения штаммов с необходимой формулой генома. Более широкие перспективы открываются с использованием плазмидной технологии при разработке штаммов для ЖГВ, которая позволяет готовить их существенно быстрее.

Ранее пары реассортантов, полученных классическим скрещиванием в РКЭ или собранных генно-инженерными методами, были охарактеризованы нами в системе in ovo [5]. Для окончательного вывода о возможности использования генно-инженерных конструкций в качестве адекватной замены вакцинным штаммам, полученным методом классической реассортации, необходимо было проведение исследований на лабораторных животных, чтобы продемонстрировать сопоставимую иммуногенность вакцинных штаммов, полученных обоими методами. В настоящей работе проведены исследования, направленные на сравнение гуморального иммунного ответа на введение лабораторным животным штаммов ЖГВ, созданных на основе сезонных вирусов гриппа А(H3N2) с использованием двух технологий.

Материалы и методы

Вирусы. Эпидемические вирусы гриппа A(H3N2) были получены из Центра ВОЗ по гриппу (The Crick Worldwide Influenza Centre, London, Великобритания) и Центра по контролю за заболеваемостью (CDC, Atlanta, GA, США). Пассажная история полученных вирусов составляла от Е4 до Е7 пассажей в РКЭ. Также в работе использовали штаммы ЖГВ, полученные на основе указанных выше «диких» вирусов методом классической реассортации в РКЭ — ЖГВ_NR, или методом обратной генетики — ЖГВ_RG. Подготовка этих реассортантов описана в [5]. Независимо от способа получения, штаммы ЖГВ представляют собой аттенуированные 6:2 реассортанты, которые содержат гены, кодирующие белки PB2, PB1, PA, NP, M, NS от донора безвредных свойств, а белки HA и NA — от эпидемического родителя. Донор аттенуации для ЖГВ А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) получен из Музея штаммов Отдела вирусологии и иммунологии им. А.А. Смородинцева (ФГБНУ «ИЭМ»). Полный список использованных в работе вирусов представлен в табл. 1.

 

Таблица 1. Список использованных в работе эпидемических вирусов гриппа A(H3N2) и реассортантов, подготовленных на их основе

Table 1. List of wild type influenza A(H3N2) viruses and reassortants prepared on their basis used in the work

Клайд Clade	Штамм вируса гриппа A(H3N2) Designation of the influenza A(H3N2) virus strain		203***
3С.2а1	A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016 (E6)	WT*	Thr
	A/17/Singapore/RG	ЖГВ** LAIV**	Thr
	A/17/Singapore/NR		Ile
3С.2а1	A/Singapore/GPO454/2018 (E5)	WT	Thr
	A/17/Singapore/RG	ЖГВ LAIV	Thr
	A/17/Singapore/NR		Thr
3С.3а	A/Kansas/14/2017 (E7)	WT	Thr
	A/17/Kansas/RG	ЖГВ LAIV	Thr
	A/17/Kansas/NR		Thr
3С.2а2	A/Brisbane/190/2017 (E4)	WT	Thr/Ile
	A/Brisbane/190/2017 (E4/E2)	WT	Ile
	A/17/Brisbane/RG	ЖГВ LAIV	Thr
	A/17/Brisbane/NR		Ile
3С.2а2	A/Switzerland/8060/2017 (E6)	WT	Thr
	A/17/Switzerland/RG	ЖГВ LAIV	Thr
	A/17/Switzerland/NR		Ile
3C.2a1b	A/Abu Dhabi/240/2018 (E5)	WT	Thr
	A/17/Abu Dhabi/RG	ЖГВ LAIV	Thr
	A/17/Abu Dhabi/NR		Thr
3C.2a1b	А/South Australia/34/2019 (E5)	WT	Thr
	А/17/South Australia/RG	ЖГВ LAIV	Thr
	А/17/South Australia/NR		Thr
3C.2a1b.2a.2	A/Darwin/09/2021 (E5)	WT	Thr
	A/17/Darwin/RG	ЖГВ LAIV	Thr
	A/17/Darwin/NR		Thr
А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) донор аттенуации для ЖГВ А/Leningrad/134/17/57 (H2N2) MDV for LAIV

Примечание. *Эпидемический (дикий) вирус гриппа; **штаммы для ЖГВ, полученные методом классической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах (natural reassortment, NR) или методами обратной генетики (reverse genetics, RG); ***остаток аминокислоты в 203–й позиции HA1.

Note. *Wild type virus; **LAIV candidates obtained by classical reassortment in developing chicken eggs (natural reassortment, NR) or by reverse genetics (reverse genetics, RG); ***amino acid residue at position 203 of HA1.

 

Культивирование вирусов проводили в 10– 11-дневных РКЭ при температуре 32–33°С в течение 48 часов по стандартной методике [18]. Накопленные для проведения исследований вирусы, после центрифугирования и фильтрования, хранили в аликвотах при температуре, пониженной до –70°С. Инфекционный титр вирусов рассчитывали по методу Reed и Muench [15] и выражали в lg ЭИД₅₀/мл. Оптимальная доза заражения РКЭ для накопления биомассы вирусов соответствовала 3,0 lg ЭИД₅₀/мл.

Иммунизация лабораторных животных и оценка иммуногенности вакцинных реассортантов. Изучение иммуногенных свойств пар вакцинных реассортантов проводилось на самках белых мышей линии BALB/c весом 16–20 г и самках морских свинок весом 250–350 г, поставляемых из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» НИЦ «Курчатовский институт» России (Всеволожский район, Ленинградская область). Иммунизация мышей проводилась двукратно с интервалом в 3 недели путем интраназального введения аттенуированного вируса дозой 7,0 lg ЭИД₅₀/мышь (объем — 50 мкл) с использованием легкого эфирного наркоза (10 животных на группу). Взятие крови у мышей осуществляли из ретроорбитального синуса глаза пастеровской пипеткой на 21-й и 42-й дни эксперимента. Иммунизация морских свинок (5 животных на группу) проводилась однократно интраназально под легким эфирным наркозом дозой вируса 6,0 lg ЭИД₅₀/свинку (объем — 400 мкл). Взятие крови у морских свинок осуществляли пункцией сердца на 14-й и 42-й дни эксперимента. Опыты с участием лабораторных животных проводились в полном соответствии с этическими нормами и принципами [3] и были одобрены локальным этическим комитетом ФГБНУ «ИЭМ» (протокол № 4/24 от 24 октября 2024 г.). Сыворотки обрабатывали ферментом, разрушающим неспецифические ингибиторы гемагглютинации (RDE (II) «SEIKEN» Co., Japan) согласно инструкции производителя. Уровень специфических гуморальных антител определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) по стандартному протоколу [18]. При постановке РТГА и РГА использовали 1% эритроциты человека 0(I) Rh+, поскольку современные вирусы гриппа A(H3N2) плохо агглютинируют эритроциты кур [12, 14].

Оценка термостабильности гемагглютинина. Вирусы инкубировали в течение 20 мин при температурах от 37 до 65°C, как описано в [17]. Контрольные образцы инкубировали в течение того же времени при комнатной температуре. Затем проводили РГА с использованием 1% эритроцитов человека. Если вирус сохранял свою гемагглютинирующую активность при температурах 58°С и выше, его считали термостабильным. Если вирус сохранял гемагглютинирующую активность при температурах ниже 58°С, его считали термочувствительным.

Выделение вирусов из легких мышей проводилось в 10–11-дневных РКЭ. Эмбрионы заражали 10-кратными падающими разведениями суспензий легких, полученных на 3 сутки после интраназального заражения самок мышей линии BALB/c весом 16–20 г (6 животных на группу) вирусом в дозе 6,0 lg ЭИД₅₀/мышь, как описано в [4]. Инфекционный титр вируса рассчитывали по методу Reed и Muench [15] и выражали в lg ЭИД₅₀/мл. В такой постановке опыта нижний предел чувствительности метода составляет 1,5 lg ЭИД₅₀/мл.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 10.5.0 с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA).

Результаты

Сравнительный анализ гуморального иммунного ответа у мышей на иммунизацию парами штаммов ЖГВ, полученных методами обратной генетики и классической реассортации. Группы по десять мышей двукратно иммунизировали парами вакцинных штаммов ЖГВ_NR и ЖГВ_RG, как описано в разделе «Материалы и методы». Сыворотки крови, собранные на 21 и 42 сутки от начала вакцинации, были исследованы в РТГА.

В первой серии экспериментов определяли титры антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных интраназально RG- и NR-вакцинными штаммами. Для иммунизации использовали пять пар вакцинных штаммов, у которых, как было показано ранее [5], аминокислотные последовательности поверхностных белков HA и NA были идентичны. Не было выявлено статистически достоверных различий в титрах антител внутри каждой из пяти пар вакцинных штаммов (рис. 1).

 

Рисунок 1. Гуморальный иммунный ответ мышей BALB/c, иммунизированных штаммами ЖГВ

Примечание. По оси Х: эпидемические вирусы, на основе которых подготовлены вакцинные штаммы; 21-NR, 42-NR — дни после иммунизации животных вакцинным штаммом, подготовленным методом классической реассортации; 21-RG, 42-RG — дни после иммунизации животных вакцинным штаммом, подготовленным методом обратной генетики. По оси Y: титр антител в сыворотке крови животных, иммунизированных штаммами ЖГВ. В каждой паре вакцинных штаммов (NR- и RG-) гемагглютинин в 203 позиции содержал Thr. Черные столбики — NR-штаммы, белые столбики — RG-штаммы. P-values рассчитывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA); ns — различия не достоверны (no significant difference).

Figure 1. Humoral immune response of BALB/c mice immunized with LAIV candidates

Note. X-axis: epidemic virus used as the basis for the vaccine candidate development; 21-NR, 42-NR are days after immunization of animals with the vaccine candidate prepared by the classical reassortment; 21-RG, 42-RG are days after immunization of animals with the vaccine candidate prepared by the reverse genetics. Y-axis: antibody titer in the serum of animals immunized with LAIV candidate. In each pair of vaccine strains (NR- and RG-), hemagglutinin at position 203 contained Thr. Black bar shows NR strain, white bar shows RG strain. P-values were calculated using one-way analysis of variance (ANOVA); ns — no significant difference.

 

В следующей серии экспериментов изучали гуморальный иммунный ответ у мышей, иммунизированных тремя парами RG- и NR-вакцинных штаммов, отличающихся между собой аминокислотным остатком в 203 позиции НА1 [1]. Аминокислотную замену Thr-203-Ile приобрели три штамма ЖГВ_NR в результате прохождения серии пассажей в РКЭ в процессе классической реассортации. Собранные генно-инженерным путем вакцинные реассортанты ЖГВ_RG аминокислотных замен в НА1 не содержали; так же, как их эпидемические штаммы-предшественники, они имели Thr в 203 позиции НА1. И при такой постановке опыта не было выявлено достоверных различий в титрах антител, сформированных в ответ на введение вакцинного штамма с Thr или Ile в 203 позиции НА1 (рис. 2).

 

Рисунок 2. Гуморальный иммунный ответ мышей BALB/c, иммунизированных штаммами ЖГВ, отличающимися между NR- и RG-вариантами по 203 позиции в НА1

Примечание. По оси Х: эпидемические вирусы, на основе которых подготовлены вакцинные штаммы; 21-NR, 42-NR — дни после иммунизации животных вакцинным штаммом, подготовленным методом классической реассортации; 21-RG, 42-RG — дни после иммунизации животных вакцинным штаммом, подготовленным методом обратной генетики. По оси Y: титр антител в сыворотке крови животных, иммунизированных штаммами ЖГВ. В каждой паре вакцинных штаммов (NR и RG) гемагглютинин NR-штаммов содержал аминокислотную замену Thr-203-Ile. У RG-штаммов в 203 позиции находится Thr. Черные столбики — NR-штаммы, белые столбики — RG-штаммы. P-values рассчитывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA); ns — различия не достоверны (no significant difference).

Figure 2. Humoral immune response of BALB/c mice immunized with LAIV candidates, differing in NR- and RG-variants at position 203 in HA1

Note. X-axis: epidemic virus used as the basis for the vaccine candidate development; 21-NR, 42-NR are days after immunization of animals with the vaccine candidate prepared by the classical reassortment; 21-RG, 42-RG are days after immunization of animals with the vaccine candidate prepared by the reverse genetics. Y-axis: antibody titer in the serum of animals immunized with LAIV candidate. In each pair of vaccine candidates, hemagglutinin of NR-strain contained the amino acid substitution Thr-203-Ile. RG-strain had Thr at position 203. Black bar shows NR strain, white bar shows RG strain. P-values were calculated using one-way analysis of variance (ANOVA); ns — no significant difference.

 

Представленные на рис. 1 и 2 результаты свидетельствуют о том, что гуморальный иммунный ответ у мышей характеризуется низкими значениями через 14 дней от начала исследования и незначительным приростом титров к 42 дню наблюдения. Значимых отличий в иммунном ответе мышей на вакцинацию классическими реассортантами и вакцинными штаммами, собранными приемами обратной генетики, не выявлено. Наблюдаемые незначительные колебания в средних значениях титров сывороток животных не являются статистически достоверными. Не наблюдалось также значимых отличий в уровне гуморального иммунного ответа мышей на вакцинацию штаммами ЖГВ_NR, содержащими и не содержащими адаптационную к клеткам птиц мутацию Thr-203-Ile.

Сравнительный анализ гуморального иммунного ответа у морских свинок на иммунизацию парами штаммов ЖГВ, полученных методами обратной генетики и классической реассортации. Гуморальный иммунный ответ на вакцинацию штаммами, отличающимися между собой аминокислотной заменой в позиции НА1 Thr-203-Ile, исследовали также на морских свинках. Результаты, представленные на рис. 3, демонстрируют статистически значимые (p < 0,01) превышения титров гуморальных антител, наблюдаемых через 2 недели после начала исследования у свинок, вакцинированных штаммами ЖГВ_NR, и несущих приобретенную аминокислотную замену Thr-203-Ile, в сравнении со штаммами ЖГВ_RG. К 42 дню после иммунизации средние значения титров сывороток значительно снижены и различия в иммунном ответе между вакцинными вариантами ЖГВ_NR с аминокислотной заменой и ЖГВ_RG становятся недостоверными.

 

Рисунок 3. Гуморальный иммунный ответ морских свинок, иммунизированных штаммами ЖГВ, отличающимися между NR- и RG-вариантами по 203 позиции в НА1

Примечание. По оси Х: эпидемические вирусы, на основе которых подготовлены вакцинные штаммы; 14-NR, 42-NR — дни после иммунизации животных вакцинным штаммом, подготовленным методом классической реассортации; 14-RG, 42-RG — дни после иммунизации животных вакцинным штаммом, подготовленным методом обратной генетики. По оси Y: титр антител в сыворотке крови животных, иммунизированных штаммами ЖГВ. В каждой паре вакцинных штаммов (NR и RG) гемагглютинин NR-штаммов содержал аминокислотную замену Thr-203-Ile. У RG-штаммов в 203 позиции находится Thr. Черные столбики — NR-штаммы, белые столбики — RG-штаммы. P-values рассчитывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA); **p < 0,01; ns — различия не достоверны (no significant difference).

Figure 3. Humoral immune response of guinea pigs immunized with LAIV candidates differing between NR- and RG-variants at position 203 in HA1

Note. X-axis: epidemic virus used as the basis for the vaccine candidate development; 21-NR, 42-NR are days after immunization of animals with the vaccine candidate prepared by the classical reassortment; 21-RG, 42-RG are days after immunization of animals with the vaccine candidate prepared by the reverse genetics. Y-axis: antibody titer in the serum of animals immunized with LAIV candidate. In each pair of vaccine candidates, hemagglutinin of NR-strains contained the amino acid substitution Thr-203-Ile. RG-strains had Thr at position 203. Black bar shows NR strains, white bar shows RG strains. P-values were calculated using one-way analysis of variance (ANOVA); **p < 0,001; ns — no significant difference.

 

Оценка степени аттенуации штаммов ЖГВ_NR и ЖГВ_RG по результатам их репродукции в легких мышей. Репродукцию в легких мышей штаммов ЖГВ_NR и ЖГВ_RG изучали на примере двух штаммов ЖГВ, подготовленных на основе сезонного вируса гриппа A/Brisbane/190/2017 (H3N2). Этот вирус в процессе выделения от больного прошел 4 пассажа в РКЭ (Е4) и его пул имел гетерогенный состав Thr/Ile по 203 позиции гемагглютинина. Дополнительные 2 пассажа в РКЭ (Е4/Е2) привели к накоплению биомассы вируса, содержащей аминокислотную замену Thr-203-Ile. Штамм ЖГВ_NR, подготовленный на этом эпидемическом вирусе, также содержал Thr-203-Ile замену, тогда как собранный генно-инженерным способом вакцинный кандидат ЖГВ_RG в 203 позиции НА содержал Thr. На рис. 4 представлены результаты выделения из легких эпидемического вируса A/Brisbane/190/2017 и штаммов ЖГВ_NR, ЖГВ_RG на 4-е сутки после их интраназального введения мышам.

 

Рисунок 4. Титры штаммов ЖГВ в легких мышей BALB/c на 4 сутки после интраназального введения

Примечание. Штаммы подготовили на основе WT вируса гриппа A/Brisbane/190/2017 методом классической реассортации (NR) или методом обратной генетики (RG). Гемагглютинин NR- и WT-штаммов содержал аминокислотную замену Thr-203-Ile. У RG-штамма в 203 позиции находится Thr. По оси Х: 4-NR, 4-RG, 4-WT — 4 сутки после заражения мышей вакцинными штаммами или WT вирусом. P-values рассчитывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA); ***p < 0,001, ns — различия не достоверны (no significant difference); ● значение титра вируса для индивидуального животного.

Figure 4. LAIV strains titers in the lungs of BALB/c mice on day 4 after intranasal inoculation

Note. LAIV candidates prepared on the base of WT A/Brisbane/190/2017 influenza virus. LAIV candidates were developed by classical reassortment (NR) or reverse genetics (RG). The hemagglutinin of the NR- and WT-strains contained the amino acid substitution Thr-203-Ile. The RG-strain has Thr at position 203. X-axis: 4-NR, 4-RG, 4-WT — 4 days after infection of mice with vaccine strains or the epidemic virus. P-values were calculated using one-way analysis of variance (ANOVA); ***p < 0.001; ns — no significant difference; ● virus titer value for an individual animal.

 

Аттенуированные штаммы ЖГВ_NR и ЖГВ_RG выделялись из легких в одинаковых титрах, независимо от наличия или отсутствия яично-адаптационной аминокислотной замены Thr-0203-Ile. Эти титры были в среднем на 2 lg ЭИД₅₀/мл ниже титра эпидемического предшественника вакцинных штаммов, что свидетельствует об их ограниченной репродукции в нижних дыхательных путях мышей и аттенуированной природе.

Оценка стабильности физико-химических свойств реассортантных штаммов ЖГВ_NR и ЖГВ_RG на примере температурной устойчивости гемагглютинина. Температурную устойчивость гемагглютинина изучали по способности исследуемых штаммов агглютинировать эритроциты человека 0(I) Rh+ после прогревания вирусов в интервале температур от 37 до 65°С. По длительности сохранения гемагглютинирующей активности 25 исследованных эпидемических вирусов и вакцинных штаммов сероподтипа А(H3N2) разделились на две группы — устойчивые (4 штамма) и чувствительные (21 штамм) к нагреванию. В первую группу вошли штаммы, несущие в головке гемагглютинина аминокислотную замену Thr-203-Ile, во вторую — штаммы, у которых эта замена не была выявлена. Штамм A/Brisbane/190/2017 (E4), гетерогенный по этой позиции, проявлял чувствительность к нагреванию (табл. 2).

 

Таблица 2. Термостабильность гемагглютинина эпидемических вирусов гриппа A(H3N2) и вакцинных штаммов, подготовленных на их основе, в зависимости от присутствия в 203 позиции HA1 треонина или изолейцина

Table 2. Thermal stability of hemagglutinin of epidemic influenza A(H3N2) viruses and vaccine strains prepared on their basis, depending on the presence of threonine or isoleucine residue in position 203 of HA1

Клайд Clade	Штамм вируса гриппа A(H3N2) Designation of the influenza A(H3N2) virus strain		203***	Титр вируса в РГА (lg2) после нагревания при температуре Virus titer in RHA (lg2) after heating at temperature
				RT****	37°С	50°С	54°С	56°С	58°С	60°С	65°С
3С.2а1	A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016 (E6)	WT*	Thr	8	7	5	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/17/Singapore/16/RG	ЖГВ** LAIV**	Thr	6	6	5	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/17/Singapore/16/NR		Ile	7	7	7	7	7	3	< 1	< 1
3С.2а1	A/Singapore/GPO454/2018 (E5)	WT	Thr	7	6	3	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/17/Singapore/18/RG	ЖГВ LAIV	Thr	7	7	2	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/17/Singapore/18/NR		Thr	7	6	3	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
3С.3а	A/Kansas/14/2017 (E7)	WT	Thr	6	6	2	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/17/Kansas/2017/631911/RG	ЖГВ LAIV	Thr	7	7	2	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/17/Kansas/NR		Thr	6	6	2	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
3С.2а2	A/Brisbane/190/2017 (E4)	WT	Thr/Ile	6	4	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/Brisbane/190/2017 (E4/E2)	WT	Ile	7	7	7	7	6	2	< 1	< 1
	A/17/Brisbane/RG	ЖГВ LAIV	Thr	5	5	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/17/Brisbane/NR		Ile	7	7	8	8	5	2	< 1	< 1
3С.2а2	A/Switzerland/8060/2017 (E6)	WT	Thr	6	6	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/17/Switzerland/RG	ЖГВ LAIV	Thr	6	6	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/17/Switzerland/NR		Ile	9	7	7	7	4	2	< 1	< 1
3C.2a1b	A/Abu Dhabi/240/2018 (E5)	WT	Thr	7	6	3	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/17/Abu Dhabi/RG	ЖГВ LAIV	Thr	7	7	2	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/17/Abu Dhabi/NR		Thr	7	6	3	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
3C.2a1b	А/South Australia/34/2019 (E5)	WT	Thr	7	5	2	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	А/17/South Australia/RG	ЖГВ LAIV	Thr	6	6	2	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	А/17/South Australia/NR		Thr	6	6	2	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
3C.2a1b.2a.2	A/Darwin/09/2021 (E5)	WT	Thr	7	6	3	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/17/Darwin/RG	ЖГВ LAIV	Thr	6	6	2	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
	A/17/Darwin/NR		Thr	6	6	2	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1

Примечание. *Эпидемический (дикий) вирус гриппа; **штаммы для ЖГВ, полученные методом классической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах (natural reassortment, NR) или методами обратной генетики (reverse genetics, RG); ***остаток аминокислоты в 203-й позиции HA1; ****комнатная температура.

Note. *Wild type virus; **LAIV candidates obtained by classical reassortment in developing chicken eggs (natural reassortment, NR) or by reverse genetics (reverse genetics, RG); ***amino acid residue at position 203 of HA1; ****room temperature.

 

Обсуждение

Штаммы живой гриппозной реассортантной вакцины должны удовлетворять ряду обязательных требований [2]. Прежде всего, они должны наследовать от доноров аттенуации такие важные биологические свойства, как аттенуация и иммуногенность. Ранее было установлено, что аттенуация является следствием приобретения штаммом ЖГВ от донора признака температурочувствительности репродукции [8, 10, 11]. В свою очередь, свойство температурочувствительности приобретено донорами аттенуации в процессе холодовой адаптации вируса-предшественника к репродукции в РКЭ при пониженной температуре. Поэтому ТЧ- и ХА-признаки всегда признавались неотъемлемыми свойствами аттенуированных штаммов. Однако ранее нами было показано, что штаммы ЖГВ_RG, при сохранности всех мутаций донора, ответственных за аттенуацию [9], характеризовались сниженной холодоустойчивостью репродукции в сравнении с донором аттенуации и штаммами ЖГВ_NR [5]. Причины этого надо искать в особенностях получения штаммов ЖГВ_RG.

Так, реассортанты с вакцинной формулой генома 6:2, полученные разными способами, отличались между собой числом пассажей в РКЭ. В процессе классической реассортации (NR) вирусы культивировали в РКЭ на протяжении 7–8 пассажей для проведения селективного отбора искомых клонов, их дальнейшего субклонирования и накопления вирусной биомассы. После RG-конструирования вакцинные реассортанты также клонировали и накапливали в РКЭ, при этом вирусы инкубировали в РКЭ только 3–4 пассажа. Отличия касались и условий репродукции в РКЭ, поскольку для классической реассортации, в качестве селективного фактора, используется пониженная температура. Кроме того, более продолжительное культивирование в РКЭ привело к появлению у трех из восьми NR-вакцинных реассортантов адаптационной к клеткам птиц аминокислотной замены Thr-Ile в 203-й позиции НА1.

В связи с отмеченными различиями получения и некоторых свойств, представлялось важным провести сравнительную оценку иммуногенности штаммов ЖГВ_NR и ЖГВ_RG — основополагающего признака, который характеризует предназначение вакцины.

Гуморальный иммунный ответ на вакцинацию изучали на мышах и морских свинках. Следует уточнить, что сезонные штаммы вируса гриппа A(H3N2) на протяжении последних 20 лет без длительной адаптации плохо заражают мышей [6]. Поэтому мыши как модель для вирусов А(H3N2) постепенно перестали рассматриваться [13]. Это существенно ограничивает их использование в качестве модели для изучения патогенеза гриппозной инфекции и тестирования гриппозных вакцин.

Как правило, для иммунизации высокочувствительных к вирусу гриппа животных бывает достаточно однократной иммунизации. В нашем случае мышей вакцинировали дважды из-за их низкой чувствительности к вирусам гриппа А(H3N2). По результатам двукратной иммунизации мышей существенных различий в иммуногенности NR и RG вакцинных штаммов не выявлено. Незначительные цифровые колебания показателей иммуногенности у ЖГВ_NR и ЖГВ_RG были статистически не достоверны.

Тем не менее для наших целей была выбрана именно эта модель, поскольку, как мы показали ранее, имела место некая парадоксальная ситуация, когда использование таких высокочувствительных животных, как хорьки, не давало информации о тонких патогенетических различиях ХА-вирусов, отличающихся по количеству аттенуирующих мутаций [4]. Разумеется, мыши не совсем адекватная модель для изучения холодоадаптированных штаммов ЖГВ, поскольку они, хоть и ограниченно, но репродуцируются в легких мышей, чего не наблюдается на модели, максимально приближенной к человеку — хорьках [4]. Но на мышах была продемонстрирована четкая разница в репродукции ХА вирусов в легких в зависимости от числа аттенуирующих мутаций в геноме ХА штамма. Гиператтенуированный ХА донор аттенуации А/Ленинград/134/47/57, несущий в своем геноме три дополнительные аттенуирующие мутации, размножался в легких мышей достоверно хуже, чем ХА донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57, у которого нет этих трех дополнительных мутаций [4].

Поэтому мы совершенно сознательно обратились к мышиной модели, чтобы попытаться выявить (или не выявить) различия в репродукции и иммунном ответе между ХА вакцинными штаммами, которые обладали разным уровнем холодоадаптированности, а именно — между штаммами, полученными методами классической реассортации и обратной генетики. В экспериментах на мышах иммунный ответ был ожидаемо низкий, поскольку мы использовали современные вирусы гриппа А(H3N2), при этом он был практически одинаков — достоверных различий не было выявлено ни внутри исследуемых пар вакцинных штаммов (NR и RG), ни между этими парами.

В то же время в экспериментах на более чувствительной модели — морских свинках были получены интересные результаты. Среди 8-ми исследованных пар штаммов ЖГВ были 3 пары, которые отличались не только по уровню холодоадаптированности между ЖГВ_NR и ЖГВ_RG, но и по наличию в НА1 аминокислотной замены Thr-203-Ile у более холодоадаптированных NR реассортантов [1] — вакцинные штаммы, подготовленные на основе эпидемических вирусов A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016, A/Brisbane/190/2017 и A/Switzerland/8060/2017. Для следующего этапа экспериментов были взяты эти 3 пары вакцинных штаммов, у которых варианты, полученные классической реассортацией, не только обладали более выраженным ХА фенотипом, но и имели в последовательности НА1 аминокислотную замену Thr-203-Ile. В этом разделе исследования была зарегистрирована более высокая иммуногенность у штаммов, полученных классической реассортацией. Это подтверждает высказанное ранее предположение о том, что замена в НА1 Thr-203-Ile может играть важную роль в иммуногенности современных вирусов гриппа А(H3N2) клайдов 3С.2а1 и 3С.2а2 [1].

Этот пример демонстрирует, что не все адаптационные к новому хозяину мутации имеют негативное значение для качества препарата ЖГВ для человека. Если мутация не снижает сродство к рецепторам клеток млекопитающих, в том числе человека, но способствует усилению репродукции в РКЭ, что принципиально для производства ЖГВ, а также не понижает иммуногенность вакцинного штамма в клетках млекопитающих, то такая замена расширяет условия выживаемости вакцинных вирусов и имеет для ЖГВ однозначно положительное значение.

Выявление мутаций, повышающих иммуногенные свойства вируса, очень важно для разработки высокоэффективных вакцин. Подобные мутации непосредственно связаны с уровнем температуроустойчивости гемагглютинина вируса гриппа. Из 26 исследованных штаммов, вакцинных и эпидемических, у 4 была выявлена аминокислотная замена Thr-203-Ile в последовательности НА1. Все 4 штамма (один эпидемический и три вакцинных) проявляли высокий уровень термостабильности НА, сохраняя свою гемагглютинирующую активность при нагревании до 58°С. Остальные 22 штамма, которые содержали в 203 позиции НА1 треонин, оказались термочувствительными. Температурная стабильность гемагглютинина является проявлением общей стабильности вирусной частицы. Так, на модели хорьков показана прямая взаимозависимость: более высокие показатели структурной стабильности и кислотной устойчивости тримера HA, обусловливают более высокую термостабильность и инфекционность вируса [16]. Логично, что сочетание таких свойств ведет к повышению эффективности вакцинных штаммов. Кроме того, термостабильность НА вакцинного вируса имеет важное значение в практическом здравоохранении, повышая устойчивость препарата ЖГВ [7]. Результаты исследования на морских свинках свидетельствуют, что аминокислотная замена в НА1 Thr-203-Ile не снижает сродство вируса к клеткам млекопитающих и повышает общую стабильность вирусной частицы.

Положительную роль выявленной или подобной ей мутации стоит учитывать при разработке вакцинных штаммов, а при использовании приемов обратной генетики возможно ее искусственное введение в ген, кодирующий НА1. Конечно, это осуществимо только после всестороннего изучения качества вакцинного препарата, содержащего мутацию, и внесения соответствующих рекомендаций в регламентирующие производство вакцин документы.

И еще один интересный момент. Памятуя о том, что ХА вирусы, обладающие разной степенью аттенуации, по-разному репродуцировались в легких мышей [4], мы взяли в качестве материала для исследования пару вакцинных штаммов, подготовленную на основе вируса A/Brisbane/190/2017, чтобы оценить уровень их репродукции в легких мышей, рассчитывая, что более холодоадаптированный NR-штамм, по аналогии с результатами [4], будет хуже, чем его RG-аналог, реплицироваться в легких. Результаты были получены до какой-то степени неожиданные. Оба вакцинных штамма были существенно ограничены в репродукции по сравнению с их диким родителем A/Brisbane/190/2017, что подтверждает результаты, полученные ранее [4]. Но при этом, вне зависимости от выраженности ХА фенотипа, как NR-, так и RG-штаммы в легких размножались одинаково. Достоверной разницы выявлено не было, что говорит о том, что в изменении уровня холодоадаптированности штаммов, содержащих в позиции 203 треонин или изолейцин, работают другие механизмы, поскольку по данным секвенирования набор мутаций в геноме NR- и RG-штаммов, отвечающий за проявление аттенуирующего фенотипа указанных вакцинных штаммов [9] (а именно, за температурочувствительность и холодоадаптированность), был идентичен.

Результаты нашего исследования показывают, что нет причины остерегаться снижения ХА фенотипа. Холодовая адаптация — это всего лишь инструмент получения безвредных температурочувствительных вирусов, которые не могут репродуцироваться в нижних отделах респираторного тракта. Некоторое снижение холодоустойчивости не влияет ни на аттенуирующие свойства вируса, ни на его иммуногенность.

Заключение

Из представленных результатов можно сделать следующий вывод: в экспериментах in vivo штаммы ЖГВ_RG проявляют себя не хуже, чем классические реассортанты, а некоторое снижение ХА фенотипа у RG-штаммов не связано с угнетением уровня их аттенуации, то есть они так же безвредны для лабораторных животных, как и классические реассортанты.

Вне зависимости от способа получения тестируемого вакцинного штамма (методами обратной генетики или классической реассортацией), замена Thr-203-Ile приводила не только к повышению его репродуктивной активности при оптимальной и пониженной температурах, о чем сообщалось ранее, но и к усилению термостабильности гемагглютинина, а значит и общей стабильности вируса, и к повышению иммуногенности в экспериментах на морских свинках. Мутации, приводящие к подобным аминокислотным заменам, нужно отслеживать и по возможности вводить в НА1 вакцинных штаммов, что возможно осуществлять, используя приемы обратной генетики.

По представленным данным исследований in vivo можно прийти к заключению, что иммунный ответ на вакцинацию не зависит от метода получения вакцинного реассортанта, но может зависеть от привнесенных в ген гемагглютинина мутаций. В целом, предпринятая в исследовании интеграция двух подходов разработки штаммов для живой гриппозной вакцины дает возможность более глубокого анализа качества вакцинных препаратов, выявления полезных мутаций и ускоренного получения штаммов с оптимизированными свойствами.

About the authors

Natalie V. Larionova

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: nvlarionova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1171-3383
SPIN-code: 4709-5010
Scopus Author ID: 23497140200
ResearcherId: J-5004-2018

DSc (Biology), Leading Researcher, Laboratory of General Virology, A.A. Smorodintsev Department of Virology and Immunology

Russian Federation, St Petersburg

Irina V. Kiseleva

Institute of Experimental Medicine

Email: irina.v.kiseleva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3892-9873
SPIN-code: 7857-7306
Scopus Author ID: 7102041346
ResearcherId: E-6555-2014

DSc (Biology), Professor, Head of Laboratory of General Virology, A.A. Smorodintsev Department of Virology and Immunology

Russian Federation, St Petersburg

Maya K. Vorsina

Institute of Experimental Medicine

Email: vorsina.02@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-2842-8247

Researcher

Russian Federation, St Petersburg

Anna K. Chistyakova

Institute of Experimental Medicine

Email: anna.k.chistiakova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9541-5636
Scopus Author ID: 57226491888
ResearcherId: HRA-2044-2023

Researcher, Laboratory of General Virology, A.A. Smorodintsev Department of Virology and Immunology

Russian Federation, St Petersburg

Ekaterina A. Stepanova

Institute of Experimental Medicine

Email: fedorova.iem@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8670-8645
Scopus Author ID: 55389452700
ResearcherId: E-2286-2014

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of General Virology, A.A. Smorodintsev Department of Virology and Immunology

Russian Federation, St Petersburg

Larisa G. Rudenko

Institute of Experimental Medicine

Email: vaccine@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0107-9959
Scopus Author ID: 56402849200
ResearcherId: B-5169-2015

DSc (Medicine), Professor, Head Researcher, A.A. Smorodintsev Department of Virology

Russian Federation, St Petersburg

Ekaterina A. Bazhenova

Institute of Experimental Medicine

Email: sonya.01.08@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3280-556X
Scopus Author ID: 56950534400
ResearcherId: J-5029-2018

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of General Virology, A.A. Smorodintsev Department of Virology and Immunology

Russian Federation, St Petersburg

References

Supplementary files