The effect of the G141R egg-adaptive substitution on the biological properties of currently circulating B/Victoria-lineage influenza B viruses

Ekaterina A. Stepanova; Степанова Екатерина Алексеевна; Ekaterina A. Bazhenova; Баженова Екатерина Андреевна; Anna K. Chistyakova; Чистякова Анна Константиновна; P. F. Wong; Вонг П. Ф.; Natalie V. Larionova; Ларионова Наталья Валентиновна; Vera V. Kuzmicheva; Кузьмичева Вера Витальевна; Larisa G. Rudenko; Руденко Лариса Георгиевна; Irina V. Kiseleva; Киселева Ирина Васильевна

doi:10.15789/2220-7619-TEO-17977

The effect of the G141R egg-adaptive substitution on the biological properties of currently circulating B/Victoria-lineage influenza B viruses

Authors: Stepanova E.A.¹, Bazhenova E.A.¹, Chistyakova A.K.¹, Wong P.F.¹, Larionova N.V.¹, Kuzmicheva V.V.¹, Rudenko L.G.¹, Kiseleva I.V.¹
Affiliations:
1. Institute of Experimental Medicine
Issue: Vol 16, No 1 (2026)
Pages: 53-65
Section: ORIGINAL ARTICLES
Submitted: 26.07.2025
Accepted: 20.08.2025
Published: 30.03.2026
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/17977
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-TEO-17977
ID: 17977

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Despite the continuing interest in influenza infection and relevant pathogens, a significant number of publications in this field are devoted to influenza A viruses, while influenza B viruses receive less attention. In PubMed database, there are 10 times fewer articles on influenza B vs. influenza A viruses. However, despite the complete disappearance of influenza B/Yamagata lineage viruses in the post-COVID-19 pandemic period, B/Victoria lineage viruses continue to circulate, posing a problem for national health. The fact that only B/Victoria lineage circulate currently in human population gives a reason to believe that it should be closely investigated. An important place among the major properties of influenza virus hemagglutinin (HA) is referred to its potential to shape antigenic diversity of influenza viruses. It has been reliably proven that mutations in specific positions of HA1 receptor-binding site affect antigenic specificity. Therefore, assessing key amino acid positions located in this area is of substantial scientific and practical interest. This is especially important in practice, e.g., in influenza vaccine production that includes passaging in a sensitive substrate (usually in developing chicken embryos) within manufacturing technology. During passaging, substrate-adapting substitutions may occur in the region of the receptor-binding pocket, which may lead to undesirable changes in antigenic and biological properties of vaccine preparation. Our study is aimed at assessing a role of one of such egg-adapting substitutions (G141R). It was found that passaging of two currently circulating influenza B/Victoria viruses, B/Austria/1359417/2021 and B/Catalonia/2279261NS/2023, and LAIV vaccine strains prepared on their platform in developing chicken embryos resulted in HA1 G141R substitution that increased cold-adaptation of LAIV candidates, but not affecting their antigenic properties, temperature-sensitive phenotype, or degree of HA thermostability. The data presented in the article indicate that it is necessary to pay close attention to the emergence of mutations in the genome of influenza vaccine strains during their preparation, monitoring their possible impact on the key properties of such strains.

Keywords

influenza B viruses, B/Victoria lineage, substitutions in hemagglutinin, adaptation to substrate, G141R egg-adaptive mutation, antigenic properties, biological properties

Full Text

Введение

Вспышки заболеваемости гриппом B ежегодно регистрируют в разных странах. Осложненному течению инфекции наиболее подвержены уязвимые группы населения — дети, пожилые люди и лица с ослабленным иммунитетом [37]. В отдельные эпидемические сезоны в ряде стран вирус гриппа B был доминирующим в статистике заболеваемости ОРВИ [8]. В случае ошибочно выбранного компонента вируса гриппа B для гриппозной вакцины в мире неоднократно регистрировали резкие подъемы заболеваемости и значительное количество осложнений после перенесенного гриппа B [11]. В связи с этим воз постоянно производит мониторинг эпидемической ситуации, что позволяет ежегодно обновлять состав гриппозных вакцин наиболее актуальными штаммами.

Известно, что при пассировании вируса гриппа в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), в его гемагглютинине (HA) возникают адаптационные аминокислотные замены, позволяющие вирусу более эффективно связывать рецепторы, доминирующие в тканях РКЭ [9]. В некоторых случаях, особенно, если эти замены располагаются в непосредственной близости от рецептор-связывающего сайта, они могут влиять на антигенную специфичность вируса, в связи с чем необходимо оценивать его антигенные свойства и мониторировать появление такого рода замен в случае выявленных антигенных отличий [19, 35].

В настоящее время одна из двух известных генетических линий вирусов гриппа B — b/yamagata — полностью исчезла из циркуляции [15]. Поэтому изучение особенностей эволюционирования оставшейся викторианской ветви представляет особый интерес.

В сентябре 2021 г. [33] для включения в состав противогриппозных вакцин, производимых в РКЭ, для профилактики гриппа B линии в/victoria в южном полушарии был рекомендован представитель клайда V1a.3a.2 — вирус b/austria/1359417/2021, антигенно отличающийся от вирусов, циркулировавших в предыдущие годы. Подобные вирусы включали в состав вакцин на протяжении нескольких последующих лет, вплоть до эпидемического сезона 2025–2026 гг. В северном полушарии. Этот вирус стал одним из объектов настоящего исследования. Второй викторианский вирус, которому было уделено внимание в нашей работе — дрейфовый вариант вируса b/austria/1359417/2021 — b/Сatalonia/2279261NS/2023, который в настоящее время циркулирует наряду с другими вирусами гриппа B клайда V1a.3a.2 [25].

Поскольку доказано, что мутации в определенных позициях рецептор-связывающего сайта HA1 влияют на антигенную специфичность вируса гриппа, исследование ключевых аминокислотных позиций, располагающихся в этой области, представляет существенный научный и практический интерес. Это особенно важно на практике, в частности, при подготовке гриппозных вакцин, в технологию изготовления которых включено пассирование в чувствительном субстрате (как правило — в РКЭ). При пассировании могут возникнуть адаптационные к субстрату замены в области рецептор-связывающего кармана, которые могут привести к крайне нежелательным изменениям антигенных и биологических свойств вакцинного препарата.

В предварительных экспериментах в HA1 эпидемического штамма b/austria/1359417/2021 и подобному ему b/Сatalonia/2279261NS/2023, выделенных в РКЭ из соответствующих клинических изолятов, после дополнительного серийного пассирования в РКЭ нами была обнаружена аминокислотная замена G141R, расположенная в области рецептор-связывающего сайта. Поэтому целью данной работы была оценка яично-адаптационных изменений в HA, подобных b/austria/1359417/2021, и вакцинных штаммов, подготовленных на их основе, а также анализ возможного влияния выявленных изменений на биологические и антигенные свойства штаммов живой гриппозной вакцины (ЖГВ).

Материалы и методы

Вирусы. Вирус гриппа b/austria/1359417/2021 (линия в/victoria) генетической сублинии V1a.3a.2 (С), был получен из центра воз по гриппу (The Crick Worldwide Influenza Centre, Лондон, Великобритания). Вирус гриппа b/catalonia/2279261NS/2023 (линия в/victoria) генетической сублинии V1a.3a.2 (С), был получен из центра ВОЗ по гриппу (CDC, Атланта, Джорджия, США). Пассажная история обоих «диких» вирусов в РКЭ составляла E3. В работе также использовали вакцинные штаммы ЖГВ, полученные на основе указанных выше «диких» вирусов методом классической реассортации в РКЭ — ЖГВРКЭ — или методом обратной генетики — ЖГВRG. Полный список использованных в работе вирусов и их пассажная история представлены в табл. 1.

Таблица 1. Пассажная история вирусов гриппа линии В/Victoria, использованных в работе

Table 1. Passage history of B/Victoria influenza viruses used

Оригинальное название штамма вируса гриппа В генетической линии V1a.3a.2 (С) Designation of the influenza B virus of genetic group V1a.3a.2 (C)		Число пассажей в РКЭ No passages in eggs	141**	Использованная аббревиатура Abbreviation
B/Austria/1359417/2021	WT	Е3	G	AU/WT/141G
B/60/Austria/2021/92	ЖГВ_RG \| LAIV_RG	Е3/Е4*	G	В60/AU/141G
B/60/Austria/2021/92 (пассажный вариант) B/60/Austria/2021/92 (passaged variant)	ЖГВ_RG \| LAIV_RG	Е3/Е4/Е5	R	В60/AU/141G(R)
B/60/Austria/2021/711	ЖГВ_РКЭ \| LAIV_eggs	Е3/Е7	R	В60/AU/141R
B/Catalonia/2279261NS/2023	WT	Е3	G	CAT/WT/141G
В/60/Catalonia/2279261NS/2023/141G	ЖГВ_RG \| LAIV_RG	Е3/Е4	G	В60/CAT/141G
В/60/Catalonia/2279261NS/2023/141G (пассажный вариант) В/60/Catalonia/2279261NS/2023/141G (passaged variant)	ЖГВ_RG \| LAIV_RG	Е3/Е4/Е5	R	В60/CAT/141G(R)
В/60/Catalonia/2279261NS/2023/8121/141R	ЖГВ_RG \| LAIV_RG	Е3/Е4	R	В60/CAT/141R

Примечание. *Дополнительное число пассажей в РКЭ вируса, первоначальная пассажная история которого при получении из Центра ВОЗ по гриппу составляла Е3, или реассортантного вируса в процессе подготовки вакцинного кандидата; **остаток аминокислоты в 141-й позиции HA1.

Note. *Additional number of passages in eggs of a virus whose initial passage history when received from the Worldwide Influenza Centre, WHO was E3, or of a reassortant virus during preparation of a vaccine candidate; **amino acid residue at position 141 of HA1.

Накопление вирусного материала производилось в РКЭ по стандартной методике [32]. Сток вируса осветляли центрифугированием, фильтровали и хранили в аликвотах при температуре –70°C. Для оценки инфекционного титра вируса использовали однократно размороженный материал.

Подготовка вакцинных штаммов ЖГВ. Для оценки возможного влияния замены G141R в HA1 на биологические свойства вирусов, в HA которых она появляется после пассирования в РКЭ, методом обратной генетики либо классической реассортацией были подготовлены две пары вакцинных штаммов: (1) В60/AU/141G и В60/AU/141R и (2) В60/CAT/141G и В60/CAT/141R. Вирусы представляют собой холодоадаптированные 6:2 реассортанты на основе донора аттенуации ЖГВ b/СССР/60/69 и содержат гены PB2, PB1, PA, NP, M, NS от данного вируса. NA реассортантов идентична и соответствует NA клинического изолята вируса AU/WT/141G (EPI_ISL_825949) и клинического изолята вируса CAT/WT/141G (EPI_ISL_17211611) соответственно. Ген HA пар вакцинных штаммов отличается нуклеотидной позицией 499, что соответствует аминокислотному остатку G или R в 141 позиции HA1 (табл. 1).

Для получения вышеуказанных вакцинных штаммов методами генной инженерии гены NA и двух вариантов HA каждого «дикого» вируса, AU/WT/141G и CAT/WT/141G, содержащие в позиции 141 HA1 G либо R, были клонированы из биологического материала, содержащего разные варианты вирусов, в вектор pcIPolISapIT по сайтам эндонуклеазы SapI по методике, аналогичной описанной ранее [36]. Комплект векторов, кодирующих гены вируса b/СССР/60/69, был получен в рамках предыдущих исследований [36]. Вирусы получали методом трансфекции комплектом из 8 плазмид, кодирующих полный набор генов вируса, в клеточной линии Vero CCL-81 (ATCC). Трансфекцию проводили методом электропорации в режиме 2 импульсов по 1150 В, 20 мс (подробно описано в [36]). Далее материал трансфекции вводили в РКЭ и производили первичное накопление вирусного материала, который затем дважды клонировали методом предельных разведений в РКЭ и отобранный клон накапливали в РКЭ (E4) (табл. 1).

Для скрещивания в РКЭ донора аттенуации B/СССР/60/69 и «дикого» родительского вируса использовали классическую методику, описанную в [28]. В процессе реассортации вакцинный штамм В60/AU/141R прошел 7 пассажей: скрещивание, два селективных пассажа, три клонирования и одну амплификацию (E7) (табл. 1).

Последовательности генов HA и NA оценивали классическим методом секвенирования по Sanger с соавт. [26]. Рнк выделяли из вируссодержащей хориоаллантоисной жидкости набором РИБО-преп (Амплисенс^®, Россия), ОТ-ПЦР проводили набором биомастер премиум от-пцр (Биолабмикс, Россия) с комплектом специфических праймеров (табл. 2).

Таблица 2. Праймеры для секвенирования HA и NA вирусов гриппа B/Austria/1359417/2021, B/Catalonia/2279261NS/2023 и вакцинных штаммов для ЖГВ, подготовленных на их основе

Table 2. Primers for sequencing HA and NA of influenza viruses B/Austria/1359417/2021, B/Catalonia/2279261NS/2023 and LAIV candidates developed on their basis

Ген Gene	Фрагмент Fragment	Праймеры для ОТ-ПЦР Primers for RT-PCR
Ген Gene	Фрагмент Fragment	Позиция Position	Последовательность олигонуклеотидов, 5'→3' Oligonucleotide sequence, 5'→3'
HA	№ 1	F1	GATCGCTCTTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCATTTTCTAATATC
	№ 1	R 1102	TTGCAGGAGGTCTATATTTGGTTC
	№ 2	F1090	AGACCTCCTGCAAAACTATT
	№ 2	R1873	GCTGGCTCTTCTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTTTCAAT
NA	№ 1	F1	ATAGCTCTTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCATCTTCTC
	№ 1	R873	TGTGTTTTACTCTTCCTGTTG
	№ 2	F711	AAAATCCTAAGAACACAAGAAAGT
	№ 2	R1561	ACTGGCTCTTCTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTTTCAGA
Ген Gene	Фрагмент Fragment	Праймеры для секвенирования Primers for sequencing
Ген Gene	Фрагмент Fragment	Позиция Position	Последовательность олигонуклеотидов, 5'→3' Oligonucleotide sequence, 5'→3'
HA	№ 1	F310	TCGGCAAGAGTTTCAATAC
		R466	CATTTTCTGCATTGATAACG
		R1102	TTGCAGGAGGTCTATATTTGGTTC
		F780	AACAGAAGACGGAGGACTACCACA
	№ 2	F1430	AAGGAATAATAAACAGTGAAGATG
		F1090	AGACCTCCTGCAAAACTATT
		R1503	GGTTTCGAAGCATCCATTT
NA	№ 1	R497	CTTTCTTGTTCCATTGTAGTATCC
		F312	TGCCCGGGCTCAACCTT
		R873	TGTGTTTTACTCTTCCTGTTG
	№ 2	F711	AAAATCCTAAGAACACAAGAAAGT
		F1146	TACTCTCGAACGATGTCTAAAACT
		R1242	TAAAAGCTAGGGCATCACT
		R1561	ACTGGCTCTTCTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTTTCAGA

После разделения продуктов в 1% агарозном геле осуществляли их очистку набором Clean-Up S-Cup (Евроген, Россия) и постановку реакции с набором BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fischer Scientific, США) с последующей очисткой и анализом с помощью капиллярного секвенатора Applied Biosystems 3130/3130xl (Thermo Fischer Scientific, США). Последовательности анализировали c помощью пакета Lasergene v. 7.1 (DNASTAR, США). Референсные последовательности и выборку последовательностей современных изолятов вирусов гриппа B получали из базы данных GISAID (https://GISAID.org), выравнивания выполняли и анализировали с помощью пакета UNIPRO Ugene v. 50.0 (https://ugene.net).

Для оценки ростовых характеристик вирусы титровали в РКЭ и культуре клеток MDCK в трех повторах, титр вычисляли по методу Reed и Muench [21] и выражали в lg ЭИД₅₀/мл (50%-ная инфицирующая доза для РКЭ) и в lg ТИД₅₀/мл (50%-я инфицирующая доза для культуры клеток) соответственно. Определяли способность вирусов к репродукции при оптимальной (в РКЭ и клетках MDCK) и субоптимальных (в РКЭ) температурах. В настоящем исследовании за температуру инкубации, оптимальную для эпидемических и вакцинных штаммов вирусов гриппа, приняли 33°C в соответствии с [14]. Способность/неспособность вирусов к размножению за верхним (temperature sensitivity, ts-фенотип) и нижним (cold-adaptation, ca-фенотип) пределами температурного оптимума оценивали при 38°C и 26°C соответственно.

Для оценки антигенных свойств вируссодержащим материалом, накопленным в РКЭ, иммунизировали крыс, после чего оценивали титр гипериммунных сывороток с тестируемыми вирусами гриппа B в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с 1% куриными эритроцитами по стандартному протоколу [32].

Для оценки термостабильности HA. Вирусы инкубировали в течение 20 мин при температурах от 37°C до 70°C, как описано в [27]. Затем проводили реакцию гемагглютинации (РГА) с использованием 1% куриных эритроцитов. Контрольные образцы инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. HA считали низко стабильным, если он терял активность при температуре до 58°C включительно. Если гемагглютинин сохранял свою гемагглютинирующую активность после прогревания при 60°C и выше, его считали термостабильным.

Результаты

Молекулярно-генетический анализ «диких» вирусов b/austria/1359417/2021 и b/catalonia/2279261NS/ 2023 (по данным, представленным в базе данных GISAID.org). Для выявления яично-адаптационных замен в генах, кодирующих поверхностные белки «диких» вирусов AU/WT/141G и CAT/WT/141G, прежде всего был проведен анализ последовательностей HA из различных пассажных вариантов, доступных в базе данных GISAID.org. Из 22-х имеющихся в этой базе сиквенсов HA1 вируса AU/WT/141G и реассортантов на его основе, в 9 случаях выявлена замена глицина на аргинин (G141R). Как правило, это были вирусы, имеющие длительную пассажную историю в РКЭ (от 6 до 12) (табл. 3).

Таблица 3. Аминокислотная позиция 141 гемагглютинина разных пассажных вариантов вирусов гриппа B/Austria/1359417/2021 и B/Catalonia/2279261NS/2023 (по материалам базы данных GISAID)

Table 3. Amino acid position of residue 141 of hemagglutinin of different passaged variants of influenza viruses B/Austria/1359417/2021 and B/Catalonia/2279261NS/2023 (based on the GISAID database)

Представленные в базе данных варианты Variants presented in the GISAID database	ЕХ* СХ**	Идентификационный номер штамма в базе данных Virus ID in the GISAID database	141***
Вирус B/Austria/1359417/2021 (линия B/Victoria) \| B/Austria/1359417/2021 (B/Victoria lineage)
Клинический изолят \| Clinical sample	–	EPI_ISL_825949	G
Пассажные варианты «дикого» вируса и вакцинные штаммы для ИГВ на его основе Passaged variants of WT virus and vaccine candidates for IIV	Е3–6; С1–6	EPI_ISL_983345, EPI_ISL_1519459, EPI_ISL_6307006, EPI_ISL_16967998, EPI_ISL_5332900, EPI_ISL_16967997, EPI_ISL_18879404, EPI_ISL_12141693, EPI_ISL_2378894, EPI_ISL_3355461, EPI_ISL_13660190	G
	Е6–15; С2–3	EPI_ISL_10265907, EPI_ISL_12709844, EPI_ISL_5195882, EPI_ISL_18420061, EPI_ISL_16899231, EPI_ISL_15158311, EPI_ISL_5196190, EPI_ISL_18419386, EPI_ISL_13633122	R
	ЕХ	EPI_ISL_5933268	G/R
Вирус B/Catalonia/2279261NS/2023 (линия B/Victoria) \| B/Catalonia/2279261NS/2023 (B/Victoria lineage)
Клинический изолят \| Clinical sample	–	EPI_ISL_17211611	G
Пассажные варианты «дикого» вируса Passaged variants of WT virus	Е5; С1–3	EPI_ISL_17608896, EPI_ISL_17981482, EPI_ISL_18109004, EPI_ISL_18879402	G

Примечание. Количество пассажей вируса в РКЭ* и культуре клеток**; ***остаток аминокислоты в 141-й позиции HA1.

Note. Number of passages in eggs* and tissue culture**; ***amino acid residue at position 141 of HA1.

Варианты, пассированные в культуре клеток (SEAT, MDCK) либо прошедшие ограниченное количество пассажей в РКЭ (не больше 5–6), сохранили присущий клиническому изоляту глицин (G). Пассажная история единственного варианта, имеющего смешанную популяцию по этой позиции (G/R), к сожалению, не известна.

HA вируса CAT/WT/141G представлен в базе данных GISAID.org только пятью сиквенсами (табл. 3). Клинический изолят и три его низкопассажных варианта (1–2 пассажа в культуре клеток), равно как и пятый пассаж в РКЭ, содержат в 141 позиции глицин, что подтверждает сказанное выше о вирусе AU/WT/141G.

Молекулярно-генетический анализ пассажных вариантов «диких» вирусов b/austria/1359417/ 2021 и b/Сatalonia/2279261NS/2023 и вакцинных штаммов ЖГВ, подготовленных на их основе. На следующем этапе исследований исходные популяции эпидемических вирусов AU/WT/141G и CAT/WT/141G, полученных нами из центров ВОЗ по гриппу и содержащих аргинин в позиции 141 HA1, были подвергнуты серийному пассированию, используя высокую заражающую дозу вируса (5,0 lg ЭИД₅₀/мл). Было продемонстрировано, что исходно HA1 эпидемических вирусов содержал аминокислотный остаток 141G. К 7 пассажу в РКЭ (включая три пассажа, которые эти вирусы прошли в центрах ВОЗ по гриппу) «дикие» вирусы приобретали в позиции 141 HA1 вместо остатка глицина (G) остаток аргинина (R) (табл. 1). Пространственно-структурная организация молекулы HA вируса гриппа B и расположение в ней аминокислотного остатка 141 представлены на рисунке.

Рисунок. Пространственно-структурная организация молекулы гемагглютинина вируса гриппа В и расположение в ней аминокислотного остатка 141. (1) — мономер HA, (2) — тример HA

Figure. Spatial and structural organization of the influenza B virus hemagglutinin molecule and the location of amino acid residue 141 in it. (1) — HA monomer, (2) — HA trimer

Примечание. Черными кругами показано расположение 141 аминокислотной позиции HA в структуре рецептор-связывающего кармана. Для картирования использована структура PDB 3bt6. Иллюстрация подготовлена в Chimera 1.14.

Note. Black circles show the location of amino acid position 141 of HA in the structure of the receptor-binding pocket. The PDB 3bt6 structure was used for mapping. The illustration was prepared in Chimera 1.14.

Затем аналогичные эксперименты были проведены с вакцинной генно-инженерной конструкцией В60/AU/141G, заведомо содержащей в 141 позиции остаток аминокислоты, представленный в клинических изолятах, на основе которых конструировались эти вакцинные кандидаты — глицин (G). На 2 дополнительном пассаже (Е3/Е4/Е2) в популяции вакцинного штамма В60/AU/141G треть клонов уже содержала адаптационную замену 141R, а к 5 пассажу (Е3/Е4/Е5) вариантов, содержащих 141G, выявлено уже не было. Пассажному варианту была присвоена аббревиатура В60/AU/141G(R) (табл. 1). В то же время после дополнительного пассирования в РКЭ вакцинного штамма В60/CAT/141G в его популяции на 2 пассаже (Е3/Е4/Е2) еще отсутствовала адаптационная замена 141R, но к 5 пассажу (Е3/Е4/Е5) она уже выявлялась у всех клонов. Пассажному варианту была присвоена аббревиатура В60/CAT/141G(R).

Что касается вакцинного штамма В60/AU/141R, подготовленного в РКЭ методом классической реассортации вируса AU/WT/141G и донора аттенуации B/СССР/60/69, то в процессе реассортации штамм прошел 7 пассажей (табл. 1). Готовый вакцинный штамм содержал в HA1 141R.

Оценка репродуктивной активности в культуре клеток MDCK «диких» вирусов b/austria/1359417/ 2021 и b/Сatalonia/2279261NS/2023 и полученных на их основе вакцинных штаммов, отличающихся по 141-й аминокислотной позиции в HA1, при оптимальной температуре инкубации 33°C. При 33°C все исследованные вакцинные реассортанты, как и их «дикие» родители, активно репродуцировались в культуре клеток MDCK. Величина инфекционного титра в этом субстрате составляла 8,6 lg тид₅₀/мл и выше вне зависимости от присутствия в позиции 141 HA1 глицина или аргинина (табл. 4).

Таблица 4. Ростовые характеристики «диких» вирусов B/Austria/1359417/2021 и B/Catalonia/ 2279261NS/2023 и полученных на их основе вакцинных штаммов, отличающихся по 141-й аминокислотной позиции в НА1, в культуре клеток MDCK и развивающихся куриных эмбрионах

Table 4. Growth characteristics of WT influenza B/Austria/1359417/2021 and B/Catalonia/2279261NS/2023 viruses and vaccine candidates, differing in the amino acid residue at position 141 of HA1, in MDCK cells and eggs

Вирус Virus designation	141*	Число пассажей в РКЭ Number of passages in eggs	Титр в MDCK,* lg ТИД₅₀/мл lg TCID₅₀/mL in MDCK***	Титр в РКЭ при оптимальной и субоптимальных температурах инкубации, lg ЭИД₅₀/мл Titer in eggs at optimal and suboptimal incubation temperatures, lg EID₅₀/ml
Вирус Virus designation	141*		33°С	33°С	38°С	26°С	фенотип
CAT/WT/141G	G	Е3/Е1**	8,6	6,2	≤ 1,2	≤ 1,2	ts, non-ca
В60/CAT/141G	G	Е3/Е4	9,7	7,3	≤ 1,2	5,4	ts, ca
В60/CAT/141R	R	Е3/Е4	9,5	7,9	≤ 1,2	6,6	ts, > ca
AU/WT/141G	G	Е3/Е1	9,0	7,2	≤ 1,2	≤ 1,2	ts, non-ca
В60/AU/141G	G	Е3/Е4	9,2	8,0	≤ 1,2	5,2	ts, ca
В60/AU/141G(R)	R	Е3/E4/Е5	9,3	9,2	≤ 1,2	7,8	ts, > ca
В60/AU/141R	R	Е3/Е7	9,0	9,0	≤ 1,2	7,6	ts, > ca

Примечание. *Остаток аминокислоты в 141-й позиции HA1. **Дополнительное число пассажей в РКЭ вируса, первоначальная пассажная история которого при получении из Центра ВОЗ по гриппу составляла Е3, или реассортантного вируса в процессе подготовки вакцинного кандидата. В таблице приведены результаты титрования вирусов в культуре клеток MDCK*** и в РКЭ**** в трех повторах.

Note. *Amino acid residue at position 141 of HA1. **Additional number of passages in eggs of a virus whose initial passage history when received from the Worldwide Influenza Centre, WHO was E3, or of a reassortant virus during preparation of a vaccine candidate. The table contains the results of virus titration in MDCK cells*** and in eggs**** in triplicate.

Таким образом, анализ полученных результатов показал, что адаптационная к клеткам птиц (в данном случае — к РКЭ) мутация G141R не влияет на репродуктивную активность штаммов ЖГВ в другом субстрате — культуре клеток млекопитающих.

Оценка репродуктивной активности в РКЭ при температурах за пределами оптимальных значений (ts/ca фенотип) «диких» вирусов b/austria/1359417/2021 и b/Сatalonia/2279261NS/ 2023 и полученных на их основе вакцинных штаммов, отличающихся по 141-й аминокислотной позиции в HA1. В ходе дальнейшего исследования было проведено сравнение ростовых характеристик в РКЭ при оптимальной и пограничных температурах эпидемических вирусов AU/WT/141G и CAT/WT/141G и вакцинных реассортантов, полученных на их основе. Результаты представлены в табл. 4. В РКЭ картина наблюдалась несколько отличная от того, что было отмечено в клетках MDCK. Было показано, что эпидемические вирусы гриппа AU/WT/141G и CAT/WT/141G обладают более низкой репродуктивной активностью при оптимальной температуре 33°C по сравнению с вакцинными реассортантами. Все вакцинные штаммы характеризовались высокой репродуктивностью, но по величинам инфекционных титров отличались между собой на 0,6–1,0 lg ЭИД₅₀/мл в пользу более репродуктивных реассортантов с адаптационной «яичной» мутацией.

Все вакцинные реассортанты продемонстрировали неспособность к репродукции при температуре инкубации, повышенной до 38°C, то есть выраженный ts-фенотип, унаследованный от донора аттенуации B/СССР/60/69. Отмечена интересная тенденция усиления свойства холодоустойчивости вакцинных штаммов ЖГВ с мутацией в 141 позиции HA (В60/CAT/141R и В60/AU/141R) — она была выше на 1,2–2,4 lg ЭИД₅₀/мл, чем у реассортантов без мутации.

Более того, вакцинный штамм генно-инженерной сборки В60/AU/141G, первоначально содержащий 141G, после 5 дополнительных пассажей в РКЭ (Е3/Е4/Е5) приобрел в HA1 замену 141R, параллельно с появлением которой свойства его холодовой адаптации усилились (табл. 4).

Антигенные свойства «диких» вирусов b/austria/ 1359417/2021 и b/Сatalonia/2279261NS/2023 и полученных на их основе вакцинных штаммов, отличающихся по 141-й аминокислотной позиции в HA1 (по данным РТГА). Анализ антигенных свойств эпидемических родителей AU/WT/141G и CAT/WT/141G и вакцинных штаммов, полученных на их основе, проведенный с помощью двустороннего теста РТГА, подтвердил их антигенное соответствие. При этом сыворотки, полученные к вариантам, содержащим 141G, более эффективно подавляли как варианты 141G, так и 141R. Сыворотка, полученная к вариантам 141R, подавляла вирусы, содержащие 141G, несколько хуже, чем 141R (табл. 5).

Таблица 5. Антигенный анализ вирусов гриппа В линии B/Victoria, отличающихся по 141-й аминокислотной позиции в гемагглютинине

Table 5. Antigenic analyses of influenza B viruses (B/Victoria lineage) differing in the amino acid residue at position 141 of HA1

Антиген Antigen	141*	Титр сыворотки в РТГА \| Hemagglutination inhibition titre
		Крысиная гипериммунная сыворотка \| Rat antiserum
		AU/WT/141G (anti-141G)	B60/AU/141G (anti-141G)	B60/AU/141R (anti-141R)
AU/WT/141G	G	1280	640	320
В60/AU/141G	G	640	1280	320
В60/AU/141R	R	320	320	1280
Антиген Antigen	141*	Титр сыворотки в РТГА \| Hemagglutination inhibition titre
		Крысиная гипериммунная сыворотка \| Rat antiserum
		CAT/WT/141G (anti-141G)	B60/CAT/141G (anti-141G)	B60/CAT/141R (anti-141R)
CAT/WT/141G	G	1280	1280	320
В60/CAT/141G	G	1280	1280	640
В60/CAT/141R	R	320	320	1280

Примечание. *Остаток аминокислоты в 141-й позиции HA1.

Note. *Amino acid residue at position 141 of HA1.

Термостабильность HA. Еще одно важное биологическое свойство вирусов гриппа — это устойчивость или чувствительность их HA к нагреванию при высоких температурах. Эксперименты показали, что, вне зависимости от исходной (до прогревания) гемагглютинирующей активности тестируемых вирусов и от аминокислоты в 141 позиции HA (глицина или аргинина), она (активность в РГА) в той или иной степени сохранялась даже при нагревании вирусов до 60°C (табл. 6). Таким образом, термостабильность этого поверхностного белка эпидемических вирусов AU/WT/141G и CAT/WT/141G и вакцинных штаммов, подготовленных на их основе, была высокой.

Таблица 6. Гемагглютинирующая активность вирусов гриппа В при термической обработке (по данным РГА)

Table 6. Hemagglitinating activity of influenza B viruses against heat treatment

Вирус Virus designation	*Титр вируса в РГА (log₂) после его прогревания при HAU (log₂)* after heat treatment at**
Вирус Virus designation	RT**	37°С	50°С	54°С	56°С	58°С	60°С	65°С	70°С
CAT/WT/141G	5	5	5	5	5	4	3	0***	0
В60/CAT/141R	8	8	8	8	8	7	5	0	0
В60/CAT/141G	8	8	8	8	7	7	3	0	0
AU/WT/141G	5	5	5	5	5	5	2	0	0
В60/AU/141R	7	7	7	7	7	6	5	0	0
В60/AU/141G	8	8	8	8	8	8	5	0	0

Примечание. *Все варианты проставляли в РГА в трех параллельных рядах; **постановка РГА при комнатной температуре; ***гемагглютинирующая активность необратимо нарушена.

Note. *The table contains the results of HA test in triplicate; **HA test at RT; *** hemagglitinating activity irreversibly destroyed.

Обсуждение

Причины ухода из циркуляции вирусов гриппа линии b/yamagata не ясны до сих пор. Если сравнивать между собой вирусы линий b/victoria и b/yamagata, викторианские вирусы подвержены более быстрому антигенному дрейфу, чем вирусы линии b/yamagata [30], то есть эволюционируют быстрее. Предполагают, что это может быть обусловлено разницей в предпочтительном связывании HA с клеточным рецептором. Если вирусы гриппа линии b/yamagata в качестве клеточных рецепторов распознают сиалил-содержащие гликопротеины, связанные с галактозой посредством альфа-2,6 связи, то спектр предпочтений викторианских вирусов шире — они способны связываться с рецепторами, содержащими не только альфа-2,6, но и альфа-2,3 связи [22]. Возможно, именно это свойство дает викторианским вирусам определенное преимущество. То, что вирусы линии b/yamagata исчезли из циркуляции как раз к моменту окончания пандемии COVID-19, еще не означает наличия причинно-следственной связи между двумя этими событиями. Но факт остается фактом — сегодня среди человеческой популяции циркулируют только вирусы гриппа Bикторианской линии, что дает повод считать, что этой линии нужно уделять самое пристальное внимание.

Механизмы адаптационной изменчивости вируса гриппа связаны с накоплением мутаций при его пассировании в определенном субстрате, в результате чего репродуктивная активность вируса в этой системе повышается. При репродукции вируса гриппа B в РКЭ в гене, кодирующем HA, возможно появление адаптационных мутаций, приводящих к появлению аминокислотных замен вблизи рецептор-связывающего сайта молекулы HA и усилению связывания вирионов с гликопротеинами с α-2,3 гликозидной связью. Рецептор-связывающий сайт головки HA вирусов гриппа B образован несколькими аминокислотами: Y98, S136, W153, H183, Q190, L194, Y195 [18]. Также было установлено, что количество заряженных замен преобладает над нейтральными [23]. В HA1-субъединице вируса гриппа B было обнаружено несколько адаптационных замен. Например, замена в аминокислотных позициях 197–199 вирусов линии в/victoria приводила к потере N-связанного сайта гликозилирования, что может изменить антигенные свойства вируса [24]. Также в другой работе [17] к 30 пассажу в РКЭ вирусов гриппа B было обнаружено появление аминокислотных замен в положениях 141, 162 и 196 гемагглютинина и установлено их влияние на ростовые характеристики и антигенность. С другой стороны, Chen с соавт. [9] показали, что при переадаптации вируса гриппа B к РКЭ в HA1 появляется аминокислотная замена G141R, которая может стабилизировать вышеназванный сайт и при этом существенно не влиять на антигенность вируса. Эта замена располагается в «головке» HA и входит в состав области рецептор-связывающего кармана [6].

У эпидемических вирусов AU/WT/141G и CAT/ WT/141G, выделенных в РКЭ из соответствующих клинических изолятов, после их серийного пассирования в РКЭ при высокой заражающей дозе в HA1 появилась аминокислотная замена G141R, известная из работы [9]. Теоретически это можно было ожидать, поскольку вирусы прошли три пассажа в РКЭ в центрах ВОЗ по гриппу, откуда были нами получены; их популяции уже были гетерогенными и могли содержать в минорных количествах яично-адаптационную мутацию G141R, которая при дальнейшем пассировании в РКЭ, имея адаптационные преимущества к этому субстрату, вытеснила клоны, содержащие глицин. Поскольку штаммы для живых гриппозных вакцин в России готовятся классической реассортацией в РКЭ эпидемического вируса и донора аттенуации, то в процессе подготовки они вполне могут приобрести эту мутацию. Свойства эпидемических вирусов интересовали нас не только сами по себе, но и применительно к свойствам вакцинных штаммов ЖГВ, получаемых на их основе. В задачу нашего исследования входило понять, является ли мутация G141R нежелательной и как она может повлиять на свойства вакцинного штамма.

Для оценки влияния выявленной замены на биологические свойства вакцинных штаммов, в HA которых она может появиться, методом обратной генетики либо классической реассортацией были подготовлены две пары вакцинных штаммов: (1) В/60/AU/141G и В/60/AU/141R и (2) В/60/CAT/141G и В/60/CAT/141R. Вирусы представляют собой холодоадаптированные 6:2 реассортанты на основе донора аттенуации ЖГВ b/CCCH/60/69, и содержат внутренние белки от донора аттенуации, а NA и HA — от эпидемических родителей. При этом NA реассортантов идентична нейраминидазе соответствующего клинического изолята, а ген HA пар вакцинных штаммов отличается позицией 499 (G/A), что соответствует аминокислотному остатку в 141 позиции HA1 G или R. Произведенные генно-инженерным путем вакцинные штаммы В60/AU/141G и В60/CAT/141G содержали в 141 позиции HA1 глицин, а вакцинный штамм В60/CAT/141R — яично-адаптационную замену глицина на аргинин. Аналогичный реассортант на основе вируса AU/WT/141G, также содержащий 141R, был подготовлен методом классической реассортации в РКЭ.

Интересно, что заведомо гомогенные по аминокислотной позиции 141 популяции вакцинных штаммов В60/AU/141G и В60/CAT/141G, собранных генно-инженерным путем, после дополнительного пятикратного пассирования в РКЭ (Е3/Е4/Е5) также приобрели яично-адаптационную замену G141R. Это совпадает с данными, представленными в базе данных GISAID.org, из которых следует, что для вируса AU/WT/141G необходимо пройти от 6 до 15 пассажей в РКЭ, чтобы приобрести замену G141R.

По данным ВОЗ, вирусы гриппа B, принадлежащие к сублинии V1A.3a.2, хорошо распознаются антисыворотками, полученными против AU/WT/141G-подобных вирусов. При этом сыворотки к вирусам, которые содержат «яичную» замену 141R, несколько хуже работают с вариантами, которые содержат 141G [34]. В наших экспериментах сыворотки, полученные к вариантам, содержащим 141R, хуже подавляли вирусы, содержащие 141G, чем 141R, но в допустимых пределах — разница в титрах была, но менее четырехкратной, считающейся статистически достоверной. Эти имеющиеся незначительные несовпадения в титрах укладываются в рамки различий, разрешенных ВОЗ, при которых вирусы считаются антигенно близкими.

Известно, что замены аминокислотных остатков в положении 141, 136, 237, 240 и ряд других аминокислотных остатков находятся в рецептор-связывающем кармане HA вируса гриппа B и могут оказывать влияние на его антигенную специфичность [6]. Однако в наших экспериментах замена G141R на антигенной специфичности вакцинных штаммов ЖГВ, подготовленных на основе викторианских вирусов AU/WT/141G и CAT/WT/141G, существенно не отразилась.

Ранее было показано, что при инкубации в интервале +32 ... +35°C и эпидемические, и холодоадаптированные вакцинные штаммы одинаково хорошо размножаются как в культуре клеток MDCK, так и в РКЭ [14]. В настоящем исследовании все проанализированные вакцинные реассортанты, как и их «дикие» родители, активно репродуцировались при оптимальной температуре инкубации 33°C в перевиваемой культуре клеток MDCK вне зависимости от присутствия глицина или аргинина в позиции 141 HA1. Это вполне объяснимо, поскольку культура клеток MDCK получена из тканей млекопитающего, то есть является субстратом, имеющим рецепторы с альфа-2-6 связью, специфичной для вирусов гриппа человека.

В РКЭ картина была несколько иной. Было показано, что эпидемические вирусы гриппа CAT/WT/141G и AU/WT/141G проявили более низкую репродуктивную активность при температуре 33°C по сравнению с вакцинными реассортантами, которые характеризовались более высокой репродуктивностью, но по величинам инфекционных титров отличались между собой на 0,6–1,0 lg ЭИД₅₀/мл в пользу реассортантов с адаптационной «яичной» мутацией. Эти результаты вполне закономерны и свидетельствуют о более высокой адаптации к клеткам птиц вирусов, содержащих 141R мутацию. Более высокая репродуктивность обоих реассортантов в сравнении с эпидемическим вирусом — также закономерное явление, она обеспечивается наследованием этого признака от донора аттенуации и меньшей адаптацией эпидемического вируса человека к репликации в клетках птиц.

Сегодня уже никого не удивляет присутствие в циркуляции температурочувствительных или холодоустойчивых вирусов гриппа, хотя в прошлые годы non-ts и non-ca признаки считались неотъемлемым свойством эпидемических вирусов. Особое значение придавали температуроустойчивости репродукции. Предполагалось, что «дикие» вирусы гриппа человека всегда обладают non-ts фенотипом, что коррелирует с их способностью проникать в нижние отделы респираторного тракта и с вирулентностью для организма хозяина [1, 5]. Однако в конце 1970-х гг. В циркуляции появились первые температурочувствительные варианты сначала вирусов гриппа A [4, 20], а позже и B [16]. Чувствительные к повышенной температуре инкубации вирусы гриппа Bыделялись даже из секционного материала [2]. В конце 1990-х гг. в циркуляции превалировали температурочувствительные вирусы гриппа B [1], и эта ситуация продолжается до сих пор. В настоящее время репродукция практически всех современных эпидемических вирусов гриппа B резко снижена при их инкубации за верхними пределами температурного оптимума. Не являются исключением и вирусы CAT/WT/141G и AU/WT/141G, поэтому установить возможное влияние аминокислотной замены G141R на этот показатель не представляется возможным. Ни один из исследуемых в настоящей работе вирусов не репродуцировался в РКЭ при 38°C, демонстрируя таким образом выраженный ts-фенотип.

Неспособность вакцинных штаммов ЖГВ к репродукции при повышенных температурах инкубации (ts-фенотип) и способность к размножению при температурах, пониженных до 26°C (са-фенотип), являются маркерами аттенуации — важными показателями, определяющими стабильность аттенуирующих свойств вакцинных штаммов. Утрата одного из этих признаков может нарушить баланс свойств, определяющих безопасность вакцинных штаммов для человека. В литературе описаны случаи, когда вакцинные штаммы для ЖГВ, собранные методами обратной генетики, частично утрачивали са-фенотип [3, 13]. Поэтому вопрос о том, не повлияет ли мутация 141R на ts/ca фенотип вакцинных штаммов, представляется весьма существенным.

Интересно, что такая характеристика вакцинных штаммов, как их са-фенотип, не только не была утрачена с появлением мутации 141R, но наоборот, наблюдалась определенная тенденция к его усилению у вариантов, несущих в 141-й аминокислотной позиции HA аргинин.

Таким образом, мутация 141R повышает репродуктивную активность штаммов вируса гриппа B в РКЭ при оптимальной и пониженной температурах, давая вирусу преимущество при репродукции в птичьих клетках в сравнении с вирусами, не имеющими этой мутации.

Существует два важных признака, присущих вирусам гриппа, которые так или иначе сопряжены с их устойчивостью или чувствительностью к повышенным температурам. Это температуроустойчивость репродукции и термостабильность HA. В первом случае (о чем уже говорилось выше) это способность реплицироваться in vitro и/или in ovo при температурах за верхними пределами температурного оптимума (свыше 38°C), что определенным образом связано со способностью вируса размножаться в нижних отделах респираторного тракта. Во втором случае — это верхний температурный предел, при нагревании вируса до которого все еще сохраняется его гемагглютинирующая активность. По данным литературы степень термостабильности варьирует у разных вирусов гриппа [7, 10, 27]. С другой стороны, показана корреляция термостабильности гемагглютинина с вирулентностью и рецепторной специфичностью [12, 27, 29]. Также для некоторых сероподтипов вирусов гриппа A выявлены аминокислотные замены, изменяющие чувствительность HA к повышенным температурам и кислой среде, и доказано их влияние на термостабильность и иммуногенность вакцинных препаратов. Так, Wen с соавт. [31] при помощи обратной генетики экспериментально выявили аминокислотную замену Y161F в HA, которая не только повышала репродуктивность вирусов A/H1N1pdm09 в клетках MDCK и vero, но и повышала их термостабильность без изменения антигенных свойств. Также ими было показано, что вакцинные штаммы, полученные на основе мутанта Y161F А/H1N1pdm09, полностью защищали мышей от заражения пандемическим вирусом гриппа A/H1N1pdm09. Данной группой ученых было также продемонстрировано, что введение мутации Y161F в геммаглютинин сезонных вирусов гриппа A/H3N2 повышало их термостабильность и репродуктивность в клетках MDCK и куриных эмбрионах. В связи с этим можно предположить, что вакцинные штаммы с высокими термостабильными свойствами более иммуногенны. По вирусам гриппа B таких данных пока не опубликовано, но можно полагать, что это универсальное явление и термостабильность вирусов B, как и вирусов A, определенным образом связана с их иммуногенностью, а сам показатель степени термостабильности вирусного HA может являться маркером иммуногенности.

В наших экспериментах, независимо от аминокислоты в 141 позиции гемагглютинина (глицина или аргинина), термостабильность этого поверхностного белка эпидемических вирусов AU/WT/141G и CAT/WT/141G и вакцинных штаммов, подготовленных на их основе, была высокой. Таким образом, адаптационная замена G141R не влияет на термостабильность на вирусов гриппа B.