Comparatively assessed biological models for determining the pathogenic properties of certain pathogens causing community-acquired pneumonia

Anastasiya S. Anisimova; Анисимова Анастасия Сергеевна; N. V. Aronova; Аронова Н. В.; M. V. Tsimbalistova; Цимбалистова М. В.; N. V. Pavlovich; Павлович Н. В.; A. S. Levchenko; Левченко А. С.

doi:10.15789/2220-7619-CAB-17905

Comparatively assessed biological models for determining the pathogenic properties of certain pathogens causing community-acquired pneumonia

Authors: Anisimova A.S.¹, Aronova N.V.¹, Tsimbalistova M.V.¹, Pavlovich N.V.¹, Levchenko A.S.¹
Affiliations:
1. Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor
Issue: Vol 15, No 5 (2025)
Pages: 881-887
Section: ORIGINAL ARTICLES
Submitted: 28.03.2025
Accepted: 30.06.2025
Published: 08.12.2025
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/17905
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-CAB-17905
ID: 17905

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

In recent years, it has been of interest to search for alternative, so-called surrogate models to investigate bacterial pathogenicity. The current work was aimed at comparing two biological models (using white mice and Galleria mellonella larvae) to evaluate the pathogenic potential of community-acquired pneumonia agents. All the studied strains were isolated from the sputum of patients at the Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor and identified by time-of-flight mass spectrometry. The virulence of the pathogen strains was evaluated when white mice and G. mellonella larvae were experimentally infected by microbes at various doses (CFU/ml). It was found that the hypermucoid variant of Klebsiella pneumoniae caused death of white mice at a dose of < 10³ CFU/mouse, whereas the classical morphotype was apathogenic even at a dose of 10⁶ CFU/mouse. At the same time, when the larvae were infected with two morphotypes, no difference in pathogenicity was observed. Other clinical isolates of the Enterobacteriacea family caused no disease in white mice even at an infection dose of 10⁶ CFU/mouse. However, E. coli and E. kobei caused the lethal process in (90%) in G. mellonella larvae. The exception was E. cloacae, which caused death in as few as 10% of individuals. In contrast to white mice, 100% of larvae died upon infection with Stenotrophomonas maltophilia, Chryseobacterium gleum, Rhizobium radiobacter, and Pantoea agglomerans. The virulence study of different staphylococcal species showed that S. aureus and S. haemolyticus had a high pathogenic potential for larvae, whereas S. epidermidis and S. saprophyticus were characterized by significantly lower potential to cause infection. In the surrogate model, clinical isolates of various fungal species: C. albicans, C. tropicalis, and G. capitatum — were most pathogenic for larvae, whereas C. glabrata and C. krusei, known as most invasive species, caused the delayed death of several individuals. Thus, the pathogenicity study of various microbial species requires to choose most appropriate biological model.

Keywords

Galleria mellonella, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus spp., yeast, yeast-like fungi, pathogenicity, biomodels

Full Text

Введение

Патогенность является генетически обусловленным свойством бактерий вызывать инфекционный процесс [7]. Традиционными лабораторными биологическими моделями для изучения патогенных свойств возбудителей инфекционных болезней являются позвоночные, такие как белые мыши, морские свинки, кролики и др. [10]. Однако, их использование в исследованиях связано с этическими вопросами, что является одной из проблем в современном мире.

В 1986 г. в Страсбурге была принята первая европейская конвенция о защите животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях, которая постоянно пересматривается, а регулирование процесса по их использованию в исследованиях становится более жестким [29]. В основу этой программы легли руководящие принципы, известные как «три R»: замена (Replacement), уменьшение (Reduction) и уточнение (Refinement), впервые предложенные Расселом и Берчем в 1959 г. [30]. Эти правила были выдвинуты не только для того, чтобы помочь исследователям в поиске доступных в настоящее время методов, но и для стимулирования разработки новых инструментов и методологий, выражая фундаментальные цели науки [34].

Все работы по экспериментальному заражению биологических моделей требуют разрешений и соответствия руководящим принципам этического обращения с ними, что приводит к значительному удлинению сроков получения результатов [15].

В качестве альтернативы в последние годы все чаще применяются иные, так называемые суррогатные модели [26]. Например, известны различные виды беспозвоночных, которые применяются для исследования взаимодействий хозяин–паразит, в частности, плодовая мушка Drosophila melanogaster, нематода Caenorhabditis elegans и большая восковая моль Galleria mellonella [25]. Следует особо подчеркнуть, что они не имеют болевых рецепторов (ноцицепторов), следовательно, для них не существует ограничительных этических правил [14].

G. mellonella, а точнее ее личинки, в последние годы являются одними из наиболее изучаемых беспозвоночных для различных целей — оценки вирулентности микроорганизмов, антимикробной эффективности лекарственных препаратов (ЛП) и др. [11, 13, 24, 27, 35, 36]. Исследователями отмечено множество преимуществ личинок по сравнению с млекопитающими, а именно: их низкая стоимость и обслуживание; отсутствие специализированного оборудования и помещений; инкубация при 37°C, то есть оптимальной температуре теплокровных хозяев [20, 21, 33]. Более того, они в качестве биологических моделей позволяют получать результаты экспериментов в более короткие сроки [32].

В литературе имеются сведения о широком использовании личинок в качестве модели инфекции для изучения патогенного потенциала бактериальных и грибковых возбудителей Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus spp., Candida spp. и других [12, 16, 23, 28]. Тем не менее сведения о влиянии индивидуальных межштаммовых различий крайне малочисленны. Поэтому, вопрос о том, насколько эта модель адеватна для характеристики различных видов микроорганизмов, изучен недостаточно.

Целью настоящей работы была оценка адекватности применения личинок Galleria mellonella по сравнению с моделью лабораторных животных (белые мыши) для определения патогенного потенциала возбудителей внебольничных пневмоний.

Материалы и методы

Все исследованные штаммы были выделены из мокроты больных с внебольничными пневмониями в период с 2020 по 2024 г. на базе ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора с помощью бактериологического метода в соответствии с регламентирующими документами [5, 6].

Видовую идентификацию микроорганизмов проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) на масс-спектрометре «Autoflexspeed III» (Bruker Daltonics, Германия) с программным обеспечением MALDI Biotyper. Полученные масс-спектры сравнивали с базой данных компании Bruker, версия 3.1.66 (Bruker Daltonics, Германия). Значение показателя Score 2,0–2,3 оценивали как высокую вероятность видовой идентификации. Подготовку образцов для исследования всех видов микроорганизмов, кроме Candida spp., выполняли методом прямого нанесения материала на мишень в соответствии с инструкцией к прибору. Для грибов пробоподготовку проводили с помощью экстракции этанолом и муравьиной кислотой [1].

Для индукции инфекционного процесса изучены клинические изоляты Klebsiella pneumoniae (классического и гипермукоидного морфотипов), Enterobacter spp., Escherichia coli, Stenotrophomonas maltophilia, Chryseobcterium gleum, Staphylococcus spp., Candida spp., Geotrichum capitatum и других редковстречающихся патогенов (Rhizobium radiobacter, Pantoea aglomerans).

Для эксперимента были использованы суточные культуры микроорганизмов, выращенных на соответствующих питательных средах при температуре 37°С в течение 24 часов.

Вирулентность отобранных штаммов оценивали на традиционной модели экспериментальной инфекции белых мышей при внутрибрюшинном заражении в дозе 10³ и 10⁶ КОЕ/животное (по 4 мыши на каждую концентрацию) и оценивали по степени гибели животных. В случае гибели от заражающей дозы 10³ КОЕ/животное культуру рассматривали как вирулентную, а при отсутствии гибели от заражающей дозы 10⁶ КОЕ/животное — как слабовирулентную (авирулентную). Протоколы работы с животными одобрены комиссией по биоэтике ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (протоколы № 14 от 08.12.2022 г., № 10 от 10.10.2023 г., № 2 от 17.01.2024 г., № 9 от 02.04.2024 г., № 13 от 14.05.2024 г.).

Стандартизированных по весу и цвету личинок G. mellonella хранили в темноте при 4°С. Для экспериментов отбирали особей массой около 250–300 мг без изменения окраски и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов перед инъекцией, затем помещали в холодильник на 15–20 мин. (для обездвиживания) и обрабатывали место введения 70% этанолом. Инфицирование осуществляли с использованием шприца Hamilton (10 мкл), в объеме 5–10 мкл бактериальной взвеси в различных концентрациях (КОЕ/мл), а зараженных личинок помещали в чашки Петри, инкубировали при 37°С. Гибель контролировали ежедневно в течение 5–6 дней. Контролем служили группы интактных личинок, которым вводили 5–10 мкл стерильного физиологического раствора [8].

Профили выживаемости G. mellonella определяли с использованием критерия логарифмического ранга и графиков выживаемости Каплана–Мейера. Результаты считались статистически значимыми при p < 0,05 [4].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью Z-теста и критерия хи-квадрат Пирсона. Достоверными считали различия при p < 0,05 [4].

Результаты

Проведено сравнительное изучение использования разных биологических моделей для оценки патогенного потенциала клинических изолятов различных видов микроорганизмов.

Ранее нами было отмечено, что большинство гипермукоидных вариантов K. pneumoniae обладали достоверно более высокой вирулентностью для белых мышей (DCL ≤ 10³ КОЕ/мышь), чем классические, которые не вызывали гибели животных даже при заражении 10⁶ КОЕ/мышь (p < 0,05) [2]. В то же время представляло интерес изучить патогенность этих же клинических изолятов для другой, так называемой суррогатной, модели — G. mellonella. Как установлено, при инфицировании личинок двумя вариантами клебсиелл в дозах 10⁴–10⁷ КОЕ/личинку достоверной разницы в патогенности исследуемых морфотипов выявить не удалось. Следовательно, для этого вида микроорганизмов результаты оценки их патогенности с использованием белых мышей и личинок существенно отличались. Так, в отличие от авирулентного для белых мышей классического варианта K. pneumoniae, эти штаммы обусловливали смертельную инфекцию у G. mellonella (рис. 1).

Рисунок 1. Кривая выживаемости личинок экспериментальных групп, зараженных суспензиями штаммов представителей семейства Enterobacteriacea (10⁶ КОЕ/личинку). Метод Каплана–Мейера

Figure 1. Survival curve of larvae of experimental groups infected with suspensions of strains of representatives of the Enterobacteriacea family (10⁶ CFU/larva). The Kaplan–Meyer method

Полученные данные обосновывают целесообразность изучения сопоставимости этих двух биологических моделей для других видов инфекционных агентов, в частности, таких представителей семейства Enterobacteriacea как E. coli, E. cloacae, E. kobei (рис. 1). Как оказалось, изученные клинические изоляты этих видов, выделенные в этиологически значимых количествах от больных, не вызывали заболевания у белых мышей даже при дозе заражения 10⁶ КОЕ/мышь. Вместе с тем E. coli и E. kobei обусловливали летальный процесс у (90%) G. mellonella в дозе 10⁶ КОЕ/личинку. Исключение составил E. cloacae, который вызывал гибель лишь у 10% особей (рис. 1).

В последние годы особую настороженность вызывает возрастающая этиологическая роль возбудителей оппортунистических инфекций, которые на фоне снижения общего иммунного статуса человеческой популяции при коронавирусной инфекции приобрели значимость. Поэтому следующий этап исследования включал изучение патогенного потенциала этих микроорганизмов (S. maltophilia, Chryseobacterium gleum, Rhizobium radiobacter, Pantoea agglomerans), патогенность которых изучена недостаточно. Выявлено, что если эти виды апатогенны для белых мышей, то они способны вызывать 100% гибель личинок моли (исключение составил S. maltophilia, который вызывал гибель только у 30% особей) (рис. 2).

Рисунок 2. Кривая выживаемости личинок экспериментальных групп, зараженных суспензиями штаммов редких патогенов (10⁶ КОЕ/личинку). Метод Каплана–Мейера

Figure 2. Survival curve of larvae of experimental groups infected with suspensions of rare pathogen strains (10⁶ CFU/larva). The Kaplan–Meyer method

Учитывая тот факт, что разные виды стафилококков занимали значительную долю в этиологической структуре возбудителей ВП, представлялось заманчивым изучение Staphylococcus spp. (S. aureus, S. haemolyticus, S. epidermidis, S. saprophyticus) на суррогатной модели (G. mellonella). Сравнительный анализ вирулентности разных видов стафилококков показал, что S. aureus и S. haemolyticus обладали высоким патогенным потенциалом, вызывая гибель большинства личинок, тогда как S. epidermidis и S. saprophyticus характеризовались достоверно меньшей способностью вызывать инфекцию (рис. 3).

Рисунок 3. Кривая выживаемости личинок групп особей, зараженных суспензиями штаммов S. haemolyticus, S. aureus, S. saprophyticus и S. epidermidis (10⁶ КОЕ/личинку). Метод Каплана–Мейера

Figure 3. Survival curve of larvae of groups of individuals infected with suspensions of S. haemolyticus, S. aureus, S. saprophyticus and S. epidermidis strains (10⁶ CFU/larva). The Kaplan–Meyer method

Ранее нами была зарегистрирована высокая частота изоляции дрожжей и дрожжеподобных грибов у больных с ВП на фоне коронавирусной инфекции [3]. В работе была проведена оценка возможности использования суррогатной модели для определения патогенности клинических изолятов различных видов грибов (C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei и G. capitatum). Результаты проведенного исследования выявили, что наибольшей патогенностью для личинок характеризовались C. albicans, C. tropicalis и G. capitatum (рис. 4).

Рисунок 4. Кривая выживаемости групп особей, зараженных суспензиями штаммов грибов (10⁶ КОЕ/личинку). Метод Каплана–Мейера

Figure 4. Survival curve of groups of individuals infected with suspensions of fungal strains (10⁶ CFU/larva). The Kaplan–Meyer method

При этом C. glabrata и C. krusei вызывали либо частичную гибель группы особей, либо гибель в отдаленные сроки.

Обсуждение

В результате проведенного исследования установлено, что белые мыши позволяют дифференцировать по признаку патогенности гипермукоидные и классические варианты K. pneumoniae. В то же время при использовании модели G. mellonella нам не удалось выявить достоверную разницу в патогенном потенциале различных морфотипов клебсиелл. Наши данные согласуются с результатами других авторов, также показавших, что использование личинок не позволяет четко разделять гипервирулентные и классические варианты этого вида [31]. Таким образом, показана неадекватность применения суррогатной модели для выявления патогенного потенциала различных морфотипов K. pneumoniae.

Согласно данным литературы, известно, что стафилококки являются слабопатогенными для белых мышей при заражении менее 10⁸–10⁹ КОЕ/мл [9, 17]. Более того, для оценки их вирулентности применяются трудоемкие и не гуманные эксперименты (ожоговая модель инфекции, стоматит крыс и т. д.) [22]. При использовании белых мышей, внутрибрюшинно инфицированных стафилококками, нам не удалось зарегистрировать гибель лабораторных животных даже в дозе 10⁶ КОЕ/мышь. В противоположность этому, виды S. aureus и S. haemolyticus обладали высоким патогенным потенциалом при личиночной модели инфекции. Другие изученные виды (S. epidermidis, S. saprophyticus) характеризовались достоверно меньшей вирулентностью для личинок. В отличие от полученных нами результатов, по данным других исследователей именно гемолитический стафилококк проявлял большую вирулентность для G. mellonella [28]. Нельзя исключить, что подобное расхождение результатов обусловлено межштаммовыми различиями, что требует дальнейшего изучения стафилококков на этой модели.

Как было установлено, C. albicans, C. tropicalis и G. capitatum обладали способностью вызывать летальную инфекцию у личинок. При этом удивительно, что C. glabrata и C. krusei, которые являются более патогенными для человека, вызывали лишь частичную гибель группы особей в отдаленные сроки [18, 19].

Несмотря на многолетнее использование личинок в качестве модельных организмов для определения патогенного потенциала возбудителей инфекционных болезней, многие вопросы изучены недостаточно. Поэтому для их уточнения необходимо накопление экспериментального материала по изучению различных видов микроорганизмов и адекватности применения той или иной биологической модели.